По данным статистики, в 2018 г. в России было выявлено 42 518 новых случаев заболеваемости раком предстательной железы (РПЖ), среди мужского населения более значимую цифру продемонстрировали только злокачественные новообразования трахеи, бронхов и легочной ткани [1].
РПЖ является одной из самых частых опухолей, встречающихся у мужчин во всем мире, его частота в развитых странах превышает 200 случаев на 100 000 мужчин. Хотя клиническое течение опухоли варьирует от медленно растущих локальных форм до высоко агрессивных наблюдений с быстрым метастазированием, РПЖ является одной из основных причин заболеваемости и смертности среди мужчин [2, 3].

Один из наиболее высоких показателей заболеваемости РПЖ зарегистрирован в США. У одного из шести американских мужчин в течение жизни развивается рак предстательной железы, в то же время среди таких пациентов только один умирает непосредственно от РПЖ или его осложнений, в остальных случаях опухоль, как правило, клинически не проявляется [4]. Эти данные подтверждают результаты вскрытия, в которых рак простаты посмертно диагностирован у одной трети пациентов в возрасте 50–60 лет и в 60% наблюдений умерших в возрасте старше 80 лет [5].

До момента внедрения в широкую практику исследования концентрации простатспецифического антигена (ПСА) РПЖ часто диагностировали после того, как у пациентов проявлялись симптомы местно- распространенного или метастатического процесса, а общая пятилетняя выживаемость составляла 70% [6]. Распространение скрининга ПСА привело к резкому увеличению выявления рака простаты, включающему, главным образом, локализованный рак. Тем не менее данный метод не обладает высокой специфичностью и зачастую способствует увеличению числа инвазивных процедур при лечении клинически незначимых видов рака [7]. Этим обусловлена необходимость дальнейшего поиска биологических маркеров для уточнения модели прогрессирования различных форм РПЖ с целью выбора наиболее адекватной лечебной тактики.

Одним из перспективных направлений решения данной проблемы является углубленное изучение основных механизмов гистогенеза наиболее частой формы РПЖ — аденокарциномы.
На современном этапе стохастическая модель канцерогенеза, предполагающая, что каждая опухолевая клетка по отдельности обладает способностью к амплификации и способна давать начало новому опухолевому пулу, постепенно отходит на второй план [8]. На смену ей приходит иерархический подход к прогрессированию опухоли. Такой подход предполагает модель, в которой опухоль состоит из полиморфных по своей пролиферативной активности и потенциалу дифференцировки атипичных клеток. Указанная теория подразумевает наличие стволовых опухолевых клеток, которые, аналогично нормальным стволовым клеткам, обладают способностью к многократному делению, в том числе асимметричному, и, соответственно, обладают мультипотентным потенциалом дифференцировки в пределах опухолевой ткани. Считается, что именно стволовые опухолевые клетки потенцируют рост опухоли [9].

Ранние наблюдения (1960-е гг.), основанные на изучении гемобластозов, доказали гетерогенность клеток в массе опухоли, предполагая существование незрелой популяции клеток. Первое доказательство, подтверждающее гипотезу о существовании раковых стволовых клеток (РСК) и основанное на исследовании острого миелолейкоза, было получено в 1990-х гг. [10]. Более поздние исследования показали наличие РСК и в других типах опухолей, в частности при РПЖ.

Механизмы сохранения РСК мультипотентного потенциала к дифференцировке изучены недостаточно, однако одна из главных ролей может принадлежать регуляторным белкам, отвечающим за аналогичные свойства эмбриональных стволовых клеток (ЭСК).

Белок Nanog представляет собой транскрипционный фактор, который участвует в самообновлении стволовых клеток. Впервые он был обнаружен в эмбриональных стволовых клетках мыши и описан как важный регулятор транскрипции, который отвечает за механизмы клеточной дифференцировки [11, 12].
Указанный белок, кодируемый геном NANOG1, состоит из 305 аминокислот и содержит три функциональных домена: N-концевой домен, C-концевой домен и консервативный гомеодоменовый мотив, необходимый для связывания с промоторной областью целевых участков ДНК и регуляции транскрипции [13].

Вместе с другими транскрипционными факторами, наиболее консервативными из которых являются SOX2 и OCT4, Nanog играет главную роль в поддержании свойств ЭСК [14]. Эти три ключевых фактора обычно функционируют совместно через формирование транскрипционной сети, контролируя экспрессию набора связанных с плюрипотентностью ЭСК генов. Nanog высоко экспрессируется в плюрипотентных стволовых клетках, а также в клетках эмбриональных карцином, и снижение его экспрессии происходит при созревании клеток [11]. Сверхэкспрессия белка Nanog не только поддерживает плюрипотентность ЭСК в мышиных моделях в отсутствие такого сильного внешнего фактора, как лейкемия-ингибирующий фактор (LIF), но также способствует росту ЭСК человека на искусственных средах в условиях отсутствия фидера — функциональной основы, представленной первичными эмбриональными фибробластами [15]. Таким образом, уровень белка Nanog определяет судьбу плюрипотентных клеток в физиологических условиях.
Идентификация в массиве опухолевой ткани клеток, проявляющих признаки и маркеры стволовости, могла бы помочь в прогнозировании клинически неблагоприятного течения РПЖ.

Целью исследования было определить прогностическую значимость экспрессии белка Nanog в клетках аденокарциномы предстательной железы.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В период с сентября 2017 г. по май 2019 г. на базе двух стационаров (Городская клиническая больница № 31 и Госпиталь для ветеранов воин № 2) был отобран материал, полученный от 89 пациентов урологического профиля в ходе хирургического лечения, а также в результате диагностических манипуляций, связанных с заболеваниями предстательной железы.

Средний возраст пациентов на момент взятия образцов ткани железы составлял 69,3 года (от 47 до 89 лет). Критерий включения: пациенты с морфологически верифицированным РПЖ, не получавшие неоадъювантную терапию. Критерии исключения: отсутствие данных клинико-инструментальных обследований (показатели ПСА, распространение опухоли), а также наблюдения с объемом материала, недостаточным для проведения иммуногистохимического анализа и последующей интерпретации результата. Оперативное вмешательство было проведено в 48 случаях (трансуретральная резекция в 23, радикальная простатэктомия — в 25 наблюдениях), диагностическая трансректальная мультифокальная биопсия была взята у 41 пациента. Морфологическая оценка РПЖ предполагала не только оценку степени злокачественности опухоли на основании системы градации Глисона, но также, согласно рекомендациям ВОЗ, была дополнена характеристикой прогностической группы в каждом наблюдении.

Иммуногистохимическое исследование материала проводили в соответствии со стандартным протоколом, в качестве первичных антител использовали кроличьи моноклональные антитела к белку Nanog (Clone EPR2027(2), Epitomics; США). Положительный контроль представлял собой образцы ткани семиномы яичка. Пролиферативную активность клеток оценивали при помощи моноклональных кроличьих антител к белку Ki-67 (Clone SP6, Cell Marque; США). В качестве положительного контроля использовали реакцию с лимфоидной тканью миндалин (клетки герминативных центров). ИГХ-реакцию проводили с использованием системы детекции QUANTO на Autostainer 360 (Thermo Fisher Scientific; США). Докрашивание срезов осуществляли гематоксилином Майера. Исследование препаратов проводили с помощью микроскопа Axioplan 2 imaging (Karl Zeiss; Германия) с фотофиксацией камерой AxioCam ERc 5s (Karl Zeiss; Германия).

Для количественной оценки пролиферативной активности осуществляли подсчет соотношения окрашенных ядер на 300 клеток при увеличении х400. Условно была принята следующая градация: отсутствие экспрессии (0 баллов), слабая экспрессия (1 балл) — окрашены менее 10% ядер клеток, умеренная экспрессия (2 балла) — более 10%, но менее 33% клеточных ядер, сильная экспрессия (3 балла) — более 33% ядер клеток в ткани были положительными.

Оценку экспрессии Nanog также осуществляли путем подсчета числа иммунопозитивных клеток при большом увеличении (х400, минимальное число клеток — 300), однако результат был скорректирован с учетом интенсивности окрашивания. Применяли шкалу с числом баллов от 0 до 3: 0 — отсутствие реакции, 1 — реакция слабая, 2 и 3 — реакция умеренная и сильная соответственно. Затем вычисляли иммуногистохимический индекс H-score (histochemical score) по следующей формуле:

H-score = Σ (Pi × i),

где i — интенсивность окрашивания, выраженная в баллах от 0 до 3; Pi — доля клеток, окрашенных с разной интенсивностью, в %. Значение индекса колебалось от 0 до 300 баллов [16].

Статистический анализ проводили при помощи программы Statistica 10.0 (StatSoft; США) в среде Windows 10. Достоверность различия выборок с распределением, отличным от нормального, определяли с помощью U-критерия Манна–Уитни. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05. Корреляционные взаимоотношения оценивали с помощью коэффициента Спирмена, для оценки силы связи коэффициентов корреляции использовали шкалу Чеддока. Для выявления связи между экспрессией исследуемых маркеров и клинико-морфологическими характеристиками пациентов использовали критерий хи-квадрат (χ2) и точный критерий Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ

После гистологического исследования РПЖ был диагностирован в 68 случаях, остальные наблюдения характеризовались наличием доброкачественной гиперплазии в сочетании с воспалительными изменениями различной степени выраженности. После морфологической оценки все наблюдения были разделены, согласно рекомендациям, на пять прогностических групп: к первой прогностической группе были отнесены 18 случаев (26,5%), ко второй — 16 случаев (23,6%), к третьей — 15 (22,1%). В четвертую и пятую прогностические группы попали 10 (14,7%) и 9 (13,2%) наблюдений соответственно. На основании клинико-морфологических данных определяли степень распространения опухолевого процесса: случаи случайно обнаруженной при обследовании опухоли, а также карциномы, ограниченной тканью органа, были отнесены к локализованным формам (Т1 и Т2 по классификации TNM AJCC, 8-е издание). Экстрапростатический рост расценивали как признак распространенной формы (Т3 и Т4). Пороговое значение концентрации ПСА в крови составляло 10 нг/мл.

Среди всех наблюдений экспрессия Ki-67 была обнаружена в 82 случаях (92,1%). В группе доброкачественной гиперплазии предстательной железы экспрессия Ki-67 была выявлена в 14 наблюдениях (66,7%), причем подавляющее большинство случаев характеризовалось слабым уровнем экспрессии. При сравнении экспрессии этого маркера в наблюдениях доброкачественного поражения предстательной железы и РПЖ были получены статистически значимые различия, причем в целом показатели пролиферативной активности в последнем случае оказались на порядок выше (p < 0,001) (рис. 1).

Сравнительный анализ показателей пролиферативной активности в различных прогностических группах продемонстрировал проградиентное увеличение средних значений уровня экспрессии Ki-67 с увеличением порядкового номера прогностической группы (рис. 2). Корреляционный анализ показал наличие сильной прямой связи между сравниваемыми параметрами (rs = 0,619, p < 0,001).

Экспрессия Nanog

В нашем исследовании экспрессия Nanog отсутствовала во всех наблюдениях доброкачественной гиперплазии предстательной железы, в то время как среди 68 случаев РПЖ иммунопозитивными к данному белку оказались 26 наблюдений (38,2%). В прогностической группе 1 экспрессии Nanog выявлено не было, во 2-й прогностической группе позитивными оказались три наблюдения (18,75%), в 3-й — 6 (40%), в 4-й — 8 (80%), и, наконец, в 5-й — 9 из 9 наблюдений. Средние показатели экспрессии Nanog с учетом интенсивности окраски в различных прогностических группах представлены на рис. 3.

Сопоставление показателей иммуногистохимического индекса экспрессии Nanog в клетках аденокарциномы предстательной железы позволило выявить прямую связь с увеличением порядкового номера прогностической группы (rs = 0,786, p < 0,001).
Характер экспрессии исследуемых маркеров в основных морфологических паттернах РПЖ по классификации Глисона представлен на рис. 4.

При сопоставлении клинико-морфологических особенностей с показателями экспрессии исследуемых маркеров (таблица) была обнаружена статистически значимая связь между уровнем экспрессии Ki-67 и наличием экстрапростатического распространения опухоли (р = 0,046), а также высоким уровнем ПСА в крови (> 10 нг/мл; р < 0,001). В то же время высокие значения иммуногистохимического индекса экспрессии Nanog были связаны с наличием распространенной формы рака (р = 0,041), однако статистически значимой связи между показателями реактивности к данному маркеру и концентрацией ПСА в крови выявлено не было.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Изучение особенностей раковых стволовых клеток (РСК) позволило пересмотреть подходы к основополагающим принципам опухолевой организации и метаболизму. Клеточная гетерогенность опухолевой ткани обусловлена ее иерархической организацией, отчасти моделирующей физиологическую гистоархитектонику исходной ткани. Симметричное и асимметричное деление РСК приводит к поддержанию опухолевой популяции, с одной стороны, и к увеличению объема опухолевой ткани за счет потерявших свойства стволовости клеток — с другой [17].
Было показано, что уровень экспрессии Nanog выше в РСК, чем в остальной популяции опухолевых клеток при некоторых типах онкологии [18, 19].
Функциональные исследования продемонстрировали, что Nanog является не только маркером РСК, но также способствует развитию РСК-подобных характеристик при некоторых видах рака. Например, активация эмбрионального гена NANOG заставляет субпопуляцию клеток колоректального рака принимать стволовой фенотип [20].

Экспрессия Nanog была обнаружена в различных опухолях, включая рак молочной железы, шейки матки, полости рта, почек, простаты, легких, желудка, мозга и яичников [21]. Выраженная экспрессия Nanog — показатель плохого прогноза для пациентов с серозной карциномой яичников, колоректальным раком и раком молочной железы. В плоскоклеточной карциноме полости рта и аденокарциноме легких более высокая экспрессия Nanog вместе с Oct4 связана с поздней стадией рака и более низкими показателями выживаемости [22, 23].

В раковых клетках аберрантная экспрессия Nanog была связана с повышенной скоростью пролиферации in vitro и ростом опухоли in vivo. Было показано, что сверхэкспрессия Nanog, наряду с Oct4, увеличивает клоногенный рост и образование сфероидных тел клеток аденокарциномы легких [24], и, наоборот, нокдаун Nanog в клетках рака молочной железы подавляет клоногенный рост и пролиферацию [25]. При нокдауне Nanog несколько генов, связанных с клеточным циклом (таких как циклины D1, D2, D3 и E1, а также циклин-зависимые киназы 1 и 6), а также связанный с p53 сигнальный путь (например, Bcl6 и Atf3) были подавлены, что может говорить об участии Nanog в клеточном цикле [25, 26].

Настоящее исследование позволило выявить экспрессию белка Nanog в клетках РПЖ, причем данный белок отсутствовал как в нормальных тканях предстательной железы, так и в наблюдениях доброкачественной гиперплазии предстательной железы. Гетерогенность выраженности экспрессии белка Nanog говорит о том, что различные варианты аденокарциномы, отличающиеся в первую очередь по степени клеточной анаплазии, имеют различный гистохимический профиль. Принимая во внимание, что этот транскрипционный белок присущ в основном эмбриональным клеткам, обнаружение его в клетках опухолевого массива говорит в пользу теории существования особого пула клеток с признаками «стволового» фенотипа. При сравнении различных прогностических групп было обнаружено, что с возрастанием степени клеточной анаплазии частота и степень выраженности экспрессии Nanog увеличивается, что находит свое отражение в оценке опухоли по классификации Глисона и в дальнейшем влияет на выбор прогностической группы. Такая прямая корреляция подтверждает тот факт, что в клеточном массиве наиболее низкодифференцированных аденокарцином предстательной железы существует значимая субпопуляция РСК, которые проявляют свойства мультипотентности благодаря наличию Nanog. Также в исследовании была продемонстрирована статистически значимая связь между выраженностью экспрессии Nanog и наличием экстрапростатического распространения опухоли, что является немаловажным фактором, влияющим на прогноз. Большинство наблюдений, оказавшихся в значительной степени иммунореактивными по экспрессии данного белка, также характеризовались высокими показателями экспрессии Ki-67, что говорит о высоком пролиферативном потенциале анаплазированных раковых клеток, в том числе РСК. ИГХ-реакция с маркерами Nanog и Ki-67 в прогностических группах 1 и 2 оказалась на порядок ниже, чем в 5-й группе, что свидетельствует о потенциально благоприятном течении хорошо дифференцированных карцином.

ВЫВОДЫ

Определение раковых стволовых клеток в тканях рака предстательной железы является перспективным методом диагностики и прогнозирования течения заболевания. Высокие показатели экспрессии Nanog связаны с высокой пролиферативной активностью опухоли, а также потенциально неблагоприятным прогнозом — обладающие свойством полипотентности раковые стволовые клетки могут служить источником самообновления популяции опухолевых клеток, играть роль в механизмах метастазирования и химиорезистентности. Обнаружение опухолевых клеток с таким потенциалом требует выбора более агрессивной лечебной тактики, направленной в первую очередь на радикальную элиминацию опухоли.