Псоралены — линейные фурокумарины растительного или синтетического происхождения, сенсибилизирующие биологические объекты к действию ближнего ультрафиолетового излучения (УФ-А-излучения, 320–400 нм) [1]. Фотосенсибилизирующее действие псораленов широко используют в медицине при PUVA-терапии (от англ. psoralen и UV-A) или экстракорпоральном фотоферезе с целью лечения таких заболеваний, как псориаз, витилиго, атопический дерматит, экзема, кожная Т-клеточная лимфома, склеродермия (системный склероз), реакция «трансплантат против хозяина» и ряда других патологий [2–9]. Согласно современным представлениям, PUVA-терапия и фотоферез основаны на антипролиферативном и проапоптотическом эффектах в отношении кератиноцитов и иммунокомпетентных клеток, а также индукции иммуносупрессии, т. е. по сути указанные способы лечения являются фотохимио- и фотоиммунотерапевтическими [2–9]. Важно отметить, что по причинам гибкости в применении, эффективности затрат и высокой безопасности клиническая значимость PUVA-терапии и фотофереза не уменьшается в современную эру разработки и применения биопрепаратов [6, 7, 9].

При проведении PUVA-терапии или фотофереза PUVA-воздействию подвергают кожу пациента или полученную от пациента лейкоцитарную массу соответственно. Ранее нами был предложен метод лечения псориаза, атопического дерматита и экземы, основанный на пероральном введении пациентам предварительно фотоокисленного in vitro псоралена (ФОП), индуцирующего иммунотерапевтический эффект in vivo [10, 11]. Механизмы указанного эффекта исследовали в модели реакции контактной чувствительности к динитрофторбензолу (ДНФБ) у мышей, являющейся экспериментальным аналогом атопического дерматита у человека [11, 12]. Было выявлено, что ФОП модулирует у ДНФБ-сенсибилизированных мышей продукцию секреторных цитокинов клетками лимфатических узлов: снижает продукцию IL2, IL4 и ИНФ-γ, увеличивает секрецию IL17, но не влияет на продукцию IL6 и IL10 [11]. Кроме того, обнаружено, что введение ФОП ДНФБ-сенсибилизированным мышам приводит к уменьшению числа клеток в региональных лимфатических узлах, снижению их пролиферативной активности и индукции в них апоптоза [11]. Полученные результаты хорошо согласуются с современными представлениями о механизмах реализации PUVA-терапии и фотофереза [2–9] и позволяют расценивать ФОП в качестве потенциального агента для лечения заболеваний, обусловленных гиперреактивностью Т-клеточного звена иммунитета.

Известно, что ФОП представляет собой сложную смесь фотопродуктов, образующихся в процессе фотолиза аэрированных растворов псоралена in vitro [13, 14]. При этом лишь некоторые из них были выделены из смеси и химически охарактеризованы вследствие их крайне малого выхода в фотореакциях и нестабильности при проведении разделения и/или аналитических процедур [13–16]. Анализ биологической активности продуктов фотоокисления псораленов in vitro выявил их апоптогенную активность [16, 17], а также способность влиять на процессы пролиферации и дифференцировки клеток [15, 17]. Примечательно, что апоптогенный эффект наблюдали лишь для трансформированных Т-лимфоцитов (клетки линии Jurkat), в то время как у нормальных лимфоцитов от здоровых доноров апоптогенные эффекты не были выявлены [16]. Это наблюдение позволило предположить, что апоптогенная активность фотопродуктов псоралена специфична, а сами продукты играют важную роль в реализации эффектов PUVA-терапии и фотофереза.

В настоящее время для прогноза биологической активности органических соединений широко используют методы хемоинформатики. Программные продукты, созданные с этой целью, позволяют с высокой точностью предсказывать профили биологической активности на основе структурных формул анализируемых низкомолекулярных соединений [18–22].

Целью данной работы было оценить потенциальные фармакологические эффекты и возможные механизмы действия ранее идентифицированных продуктов фотоокисления псоралена и их циклоаддуктов с аминотиолами, соотнести результаты хемоинформационного анализа с иммунотропными (терапевтическими) эффектами, известными из литературы для этих продуктов, и определить новые направления исследований в этой области.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для прогноза потенциальных фармакологических эффектов исследуемых соединений использовали компьютерную программу PASS (от англ. prediction of activity spectra for substances) версии 2019 (ИБМХ им. В. Н. Ореховича; Россия) [18, 19], позволяющую оценить вероятный профиль биологической активности по структурной формуле органического соединения. Оценка основана на анализе связей «структура–активность» обучающей выборки, включающей в себя более миллиона структур веществ, исследованных на биологическую активность. В программе PASS биологическая активность представлена качественным образом (активно/неактивно). Химическая структура описана в виде MNA-дескрипторов (от англ. multilevel neighborhoods of atoms — множественные атомные окрестности) [20]. Алгоритм построения моделей взаимосвязи «структура–активность» на основе веществ обучающей выборки и прогнозирования активности для новых соединений построен на модифицированном Байесовском алгоритме [18, 19]. Использованная версия программы PASS (PASS 2019) прогнозирует более 5000 видов биологической активности, включая терапевтические эффекты, 3818 механизмов действия, побочные эффекты со средней точностью около 95% (скользящий контроль с исключением по одному).

В качестве входной информации в программе PASS использовали информацию о структурной формуле молекулы, представленную в виде файла в формате Molfile. В качестве выходной информации получали список прогнозируемых видов активности с оценкой вероятности наличия каждого вида активности Pa и вероятности отсутствия каждого вида активности Pi, которые могут принимать значения в диапазоне от нуля до единицы. Вероятности Pa и Pi являются также оценками вероятностей ошибок первого и второго рода соответственно, а также могут быть рассмотрены в качестве меры принадлежности прогнозируемого соединения к классам «активных» и «неактивных» веществ. Чем больше для соответствующей активности прогнозируется величина Pa и чем меньше величина Pi, тем больше шанс обнаружить данную активность в эксперименте.

В данном исследовании для прогноза и анализа возможных фармакологических эффектов и связанных с ними механизмов действия использовали также компьютерную программу PharmaExpert версии 2019 (ИБМХ им. В. Н. Ореховича; Россия) [21] с порогом вероятности проявления предсказанной активности 50% (активность считали вероятной, если величина вероятности ее наличия Pa была выше 0,5 и превосходила величину вероятности ее отсутствия Pi). Компьютерная программа PharmaExpert предназначена для анализа результатов прогноза PASS на основе известных данных о связи между действием на лекарственные мишени и фармакологическими эффектами, которые хранятся в базе данных программы (текущая версия 2019 г. содержит более 15 тыс. таких связей).

Структуры исследуемых соединений использовали при поиске идентичных и похожих соединений в базе данных PubChem — крупнейшей свободно доступной базе, содержащей данные о структуре и биологической активности (как экспериментальные, так и патентные) для более чем 100 млн химических соединений [22]. Поиск идентичных и похожих соединений в PubChem основан на описании их структур в виде PubChem-фингерпринтов (векторов размером 881 бит, описывающих особенности структур соединений). Известно, что структурно подобные соединения могут проявлять аналогичную активность, и обнаружение подобных соединений с известной биологической активностью может помочь в планировании экспериментальных исследований. В данной работе для поиска соединений по структурному сходству использовали встроенный в PubChem сервис, который использует в качестве меры структурного сходства рассчитанный на основе PubChem-фингерпринтов коэффициент Танимото [23]:

T (X, Y) = (N (X∩Y)) / (N (XUY)),

где N (X∩Y) — число общих дескрипторов у соединений X и Y, N (XUY) — число всех уникальных дескрипторов у соединений X и Y. В качестве порога сходства использовали коэффициент Танимото больше 0,9 и 0,8.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обоснование выбора объектов исследования

Известно, что формирование фотопродуктов, обладающих иммунотропным (терапевтическим) действием, строго зависит от присутствия кислорода в процессе облучения растворов псоралена [10]. Этот факт позволяет ограничить поисковый анализ ранее охарактеризованными продуктами фотоокисления псоралена (ФОП-продуктами). Исчерпывающий анализ продуктов фотолиза фурокумаринов и механизмов, приводящих к их формированию, был выполнен в обзоре [13]. В данном обзоре было показано, что все процессы с участием окислительной модификации молекулы псоралена и других фурокумаринов можно разделить на три группы. Первую группу формируют фотопродукты окислительного раскрытия фуранового или пиронового кольца, относящиеся к классам кумаринов и бензофуранов соответственно. Ко второй группе относят фотопродукты, формирование которых является результатом присоединения молекулы растворителя к промежуточному продукту фотоокисления по фурановому кольцу. Третья группа включает в себя фотопродукты двойной модификации молекулы псоралена, по меньшей мере одна из которых окислительная.

Проанализировав известные из литературы данные о биологической активности, мы решили сконцентрироваться на ФОП-продуктах, относящихся к первой группе. Известно, что получающиеся в процессе фотоокисления фурокумаринов кумарины и бензофураны содержат фингерпринт в виде орто- гидроксиформильной группировки (ОГФ) и обладают описанной выше биологической активностью [13, 15, 16]. Было высказано предположение [13], что биологическая активность ФОП-продуктов первой группы может быть обусловлена наличием ОГФ по аналогии с известным иммуномодулятором тукарезолом [24]. Отчасти это предположение было подтверждено в одной из работ, в которой были описаны апоптогенные эффекты нескольких ОГФ-содержащих соединений [16]. Ранее также было показано, что ОГФ-содержащие продукты фотоокисления протопорфирина IX обладают иммунотропным действием, супрессируя реакцию контактной чувствительности у мышей [25].

В результате, нами была определена группа соединений для проведения хемоинформационного анализа с использованием программ PASS и PharmaExpert. В нее вошли ОГФ-содержащие кумариновые ФОП- продукты (соединения 1–3), ранее идентифицированные для псоралена, а также для 8-метоксипсоралена

(8-МОП) и 5-метоксипсоралена (5-МОП) — основных фотосенсибилизаторов фурокумаринового ряда, используемых в медицине [2–9]. В группу включены также известные ОГФ-содержащие бензофурановые ФОП-продукты вышеуказанных трех псораленов (соединения 4–6). Данная группа дополнена ОГФ-содержащим тукарезолом (соединение 7) в качестве соединения сравнения с известным иммунотропным действием, в основе которого лежит стимуляция T-клеток посредством формирования Шиффовых оснований с T-клеточными рецепторами [24]. Кроме того, были проанализированы потенциальные фармакологические эффекты фурокумариновой кислоты (соединение 8) — фотопродукта псоралена, предположительно являющегося интермедиатом при формировании соединения 4 в процессе фотоокисления псоралена [26]. Отдельную группу составили соединения, являющиеся циклоаддуктами ОГФ-содержащих продуктов фотоокисления псоралена с цистеином и гомоцистеином (соединения 9–12 и 13–16 для кумаринового и бензофуранового ФОП-продуктов соответственно). Выбор цистеина и гомоцистеина для данного поискового исследования не случаен. Известно, что ОГФ-содержащие кумарины (в частности, 8-формилумбеллиферон) используют для флуориметрического анализа указанных аминокислот в биологических объектах [27], а их аддукты с аминами обладают биологической активностью [28].

Прогноз фармакологических эффектов ФОП продуктов, фурокумариновой кислоты и тукарезола

В табл. 1 и табл. 2 обобщены основные результаты хемоинформационного анализа целевых ФОП-продуктов (соединения 1–6). Единственным из исследованных соединений с предсказанной иммунотропной (иммуносупрессивной) активностью является кумариновый ФОП-продукт 5-МОП. Напротив, для всех соединений предсказана высокая вероятность активности в качестве индуктора апоптоза, причем величины Pa/Pi для указанного вида активности для кумариновых ФОП-продуктов были выше активности бензофурановых ФОП-продуктов. Кроме того, для соединений 1–6 предсказана противоопухолевая и цитостатическая активности.

Помимо описанных выше различных видов антипролиферативной активности, с высокой вероятностью была предсказана активность в качестве дыхательных (соединения 1–5) и в меньшей степени сердечно-сосудистых (соединения 1, 2) аналептиков, а также антимутагенов (соединения 1–6) и радиопротекторов (соединения 1, 3, 4 и 6). Для бензофурановых ФОП-продуктов (особенно, для соединения 4) предполагается ряд других защитных видов активности (вазопротекторная, нейропротекторная и кардиопротекторная активности).

Результаты анализа указывают на широкий спектр ожидаемой антибиотической активности: прогнозируется, что соединения 1–6 обладают противогрибковой активностью, а соединение 1 характеризуется сразу пятью видами антибиотической активности. При сравнении можно отметить, что антибиотическая активность кумариновых ФОП-продуктов количественно и качественно превосходит активность бензофурановых ФОП-продуктов.

Анализ предсказанных механизмов действия указанных выше видов активности позволяет сделать вывод, что антипролиферативные виды активности изучаемых соединений могут быть опосредованы их действием в качестве агонистов апоптоза и ингибиторов активности целого ряда ферментов (фосфатаз, киназ, монофенолоксигеназы) и факторов транскрипции (например, фактора транскрипции NF-kB). Радиопротекторные свойства связывают со способностью выступать в качестве ингибитора проницаемости мембран и способствовать ее целостности, а также действовать в качестве ловушки свободных радикалов. Антибиотическая активность предположительно обусловлена влиянием соединений на трансмембранные процессы и функционирование киназ и мембранных белков (например, ингибировать пенициллинсвязывающий белок ampH).

В табл. 3 представлены основные результаты предсказания фармакологических эффектов тукарезола. Согласно проведенному анализу, тукарезол с высокой вероятностью обладает противовоспалительной активностью в кишечнике, а также нейротропными защитным эффектами (антинейротоксическая и нейропротекторная активности).

Неожиданно богатой оказалась палитра прогнозируемых фармакологических эффектов для фурокумариновой кислоты (табл. 4). Предполагается, что, действуя преимущественно в качестве ловушки свободных радикалов и способствуя сохранению целостности мембран, фурокумариновая кислота обеспечивает широкий спектр защитных эффектов (в том числе антимутагенный, нейропротекторный, вазопротекторный, радиопротекторный, антиканцерогенный и другие эффекты), влияет на процессы метаболизма (регулирует метаболизм липидов, снижает содержание холестерина в крови), обеспечивает противовоспалительную и антиоксидантную защиту, а также обладает потенциальной терапевтической активностью в дерматологии (в частности, антипсориатической) за счет противовоспалительного эффекта и регуляции ферментативной деятельности.

Прогноз фармакологических эффектов циклоаддуктов ОГФ-содержащих продуктов фотоокисления псоралена с аминотиолами

В табл. 5 и табл. 6 представлен прогноз фармакологических эффектов циклоаддуктов с аминотиолами для ОГФ-содержащих продуктов фотоокисления псоралена. Взаимодействие кумаринового соединения 1 с цистеином и гомоцистеином приводит к формированию соответствующих циклоаддуктов (см. табл. 5, соединения 9 и 11). Окисление соединений 9 и 11 приводит к получению соединений 10 и 12 соответственно (см. табл. 5). По аналогии, соответствующие циклоаддукты могут быть получены для бензофуранового соединения 4 (см. табл. 6, соединения 13–16).

Согласно проведенному анализу, соединения 9–15 могут выступать в роли радиопротекторов, причем данное свойство, связываемое со способностью перехватывать свободные радикалы, более вероятно для неокисленных форм циклоаддуктов (соединения 9, 11, 13, 15). Кроме того, предполагается, что соединения 9, 11, 13 и 15 (но не их соответствующие окисленные формы 10, 12, 14 и 16) обладают противоопухолевой активностью для целого ряда злокачественных опухолей, таких как рак предстательной железы, рак печени и меланома. Для всех соединений 9–16 предсказана активность в роли гепатопротектора, что может быть использовано при лечении заболеваний печени. Как и в случае с радиопротекторными свойствами, этот фармакологический эффект связывают с активностью соединений 9–16 в качестве химического восстановителя и ловушек свободных радикалов. По прогнозу, кумариновые циклоаддукты 9–12 обладают спазмолитической активностью, реализующейся в мочевыводящих путях, тогда как для бензофурановых циклоаддуктов 13–16 такая активность не предполагается. Все окисленные формы циклоаддуктов (соединения 10, 12, 14 и 16) предположительно применимы для лечения нейродегенеративных заболеваний, а соединения 10 и 12 потенциально активны и в дерматологии.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Описанные результаты исследования хорошо согласуются с данными, известными из литературы. Ранее было обнаружено, что соединения 1 и 2 являются индукторами апоптоза [16], а производные псораленов способны ингибировать активность фактора транскрипции NF-kB [29]. Кроме того, предсказанная для соединений 1–6 противоопухолевая и цитостатическая активность может объяснять некоторые полученные ранее эффекты ФОП и отдельных фотопродуктов. Так, в опытах in vivo с привитой мышам лимфомой EL-4, моделирующей кожную T-клеточную лимфому человека, для ФОП была показана противоопухолевая активность [10], а бензофурановый ФОП-продукт псоралена (соединение 4) обладал тератогенным эффектом в опытах на эмбрионах Xenopus lavrae [15].

Кроме того, ранее было показано, что тукарезол, использованный в настоящем исследовании в качестве соединения сравнения с известным иммунотропным действием, обладает антипротозойной активностью в модели экспериментального висцерального лейшманиоза [30], а также применим для терапии больных серповидноклеточной анемией [31]. В этой связи примечательно, что возможность использования для лечения β-талассемии и серповидноклеточной анемии была также описана для продуктов фотоокисления псораленов [17].

Особый интерес представляет неожиданное обнаружение у фурокумариновой кислоты потенциальной терапевтической активности в дерматологии (в частности, антипсориатической) за счет противовоспалительного действия и регуляции ферментативной активности. Последние два вида биологической активности характерны для коричных кислот [32], и предположительно реализуются фурокумариновой кислотой за счет перехвата свободных радикалов, ингибирования липоксигеназы и факторов транскрипции и сохранения целостности мембран.

Терапевтической активностью в дерматологии потенциально обладают и окисленные формы кумариновых циклоаддуктов с аминотиолами. Больший интерес представляет предсказанная нами активность ОГФ-содержащих продуктов фотоокисления псоралена в отношении гомоцистеина. Известно, что повышенное содержание и/или накопление гомоцистеина может приводить к ряду патологических состояний (болезни Альцгеймера, сенильной деменции, сосудистым нарушениям, нефропатии и др.) [33]. Поэтому предсказанная терапевтическая активность окисленных форм циклоаддуктов, возникающая в результате взаимодействия ОГФ-содержащих продуктов фотоокисления псоралена и гомоцистеина, может определять перспективу применения данных соединений для лечения вышеуказанных патологий.

ВЫВОДЫ

В настоящей работе с использованием программ PASS и PharmaExpert была осуществлена хемоинформационная оценка потенциальных фармакологических эффектов и их возможных механизмов действия ранее идентифицированных продуктов фотоокисления псораленов и их циклоаддуктов с аминотиолами. Ряд предсказанных фармакологических эффектов подтверждают результаты ранних исследований, что указывает на высокую прогностическую эффективность проведенного анализа. В контексте актуального применения псораленов при лечении целого ряда дерматозов и пролиферативных патологий полученные данные свидетельствуют о возможном участии продуктов фотоокисления псораленов в реализации терапевтических эффектов PUVA-терапии или фотофереза, а потому представляют особую ценность. Отдельный интерес вызывает неожиданно широкий спектр фармакологических эффектов, обнаруженный для фурокумариновой кислоты и циклоаддуктов кумариновых и бензофурановых продуктов фотоокисления псоралена с аминотиолами и позволяющий определить новые направления исследований в области терапевтического применения псораленов.