Ведущим направлением исследований в области неврологии является анализ молекулярных механизмов неврологических заболеваний, связанных с нарушением когнитивных функций [1]. При сосудистых и нейродегенеративных заболеваниях основной проблемой остается прогредиентное когнитивное снижение вплоть до деменций. Большинство из этих заболеваний возрастозависимы. При так называемом нормальном старении можно также наблюдать ряд ишемических и атрофических изменений, которые по сравнению с более молодым возрастом можно рассматривать как патологические, тем более что в этом случае тоже происходит когнитивное снижение. Сосудистые заболевания и процесс старения сопровождает воспаление, развивающееся при активном участии иммунных процессов. Нейроиммунное взаимодействие является значимой частью патогенетического механизма, от которой во многом зависит как течение болезни, так и состояние психических функций [2-8].

Поиск закономерных изменений содержания воспалительных интерлейкинов (IL) в слюне (IL1β, IL6 и IL10) под влиянием когнитивной нагрузки актуален для современной нейроиммунологии. Хроническая ишемия мозга (ХИМ) является патологической формой сосудистого старения, прогредиентно развивающейся хронической сосудистой недостаточности, сопровождающейся общемозговой симптоматикой, а также когнитивным снижением, вызванным лакунарными инфарктами в коре и подкорковой области. Ишемические процессы сопровождает воспаление с образованием активных форм кислорода, активацией микроглии и других глиальных клеток, запуская выработку цитокинов, включая воспалительные интерлейкины [9, 10].

Провоспалительный интерлейкин IL1β, связанный с воспалительными и иммунными процессами, обладает межсистемным действием, изменяя активность нервной, иммунной и гормональной систем. IL1β и рецепторы к нему найдены, в том числе, и в мозге, особенно их много в гиппокампе. Имеются обоснованные предположения, что IL1β востребован в процессах гиппокампальной модуляции пластичности и памяти [4]. В большинстве работ обнаружено, что рост IL1β отрицательно влияет на когнитивные функции. Существует также относительно меньшее число работ, показывающих отсутствие или даже положительное влияние IL1β на обучение и память. В физиологических концентрациях IL1β способствует посттетанической потенциации, но при более высоких концентрациях может ингибировать этот процесс и ухудшать обучение и память. Более того, такие цитокины, как IL1β, IL6 и др., активируются в головном мозге после индукции длительной потенциации [5]. Центральное введение IL1β крысам оказывало влияние на процессы воспаления и на условно-рефлекторные свойства памяти; этот когнитивный эффект коррелировал с уровнем глюкокортикоидов [6]. Кроме того, IL1β взаимодействует с вегетативной нервной системой [7], которая может быть посредником в его влиянии на когнитивные процессы.

Интерлейкин 6 (IL6) — один из главных медиаторов острой фазы воспаления. Нейроны, астроциты, микроглия и эндотелиальные клетки служат источниками IL6 в ЦНС. Этот медиатор играет решающую роль в патогенезе воспалительных заболеваний и в физиологическом гомеостазе нервной ткани [8].

В последнее время стали появляться работы, указывающие на влияние IL6 на когнитивные функции. В ряде исследований применяли дисперсионный анализ для выделения факторов, влияющих на уровень IL6. Возраст, артериальная гипертензия, диабет, курение, умеренное употребление алкоголя, общий гомоцистеин, толщина интимы сонной артерии и индекс массы тела были положительно связаны с уровнями IL6. В модели многомерной линейной регрессии IL6 был отрицательно связан с оценкой шкалы Mini mental state examination с поправкой на социально-демографические и сосудистые факторы риска. В отношении IL6 известно, что его могут продуцировать клетки мозга, включая нейроны при их деполяризации [11]. Вероятно, такой процесс может активироваться при когнитивной нагрузке.

Повышение уровня IL6 отмечают при снижении когнитивных функций, что может быть связано с контролем посттетанической потенциации [12, 13]. IL6 взаимодействует, так же как IL1β, и с вегетативной нервной системой [14].

Противовоспалительный цитокин IL10 ингибирует выработку воспалительных цитокинов, таких как IL1β, IL6, фактор некроза опухоли альфа (TNFα), и способствует высвобождению других противовоспалительных цитокинов, включая рецепторный антагонист IL1β, обладающий противовоспалительными свойствами. Было показано, что в мозге крыс IL10 снижает уровень IL1β и TNFα после черепно-мозговой травмы и улучшает неврологическое восстановление [15]. Гиперактивный ответ микроглии при длительном воспалении часто связан с более высокой индукцией воспалительного IL1β и противовоспалительного IL10 [16], что нередко происходит на фоне активации симпатической нервной системы [17]. IL10 блокирует ингибирующий эффект IL1β на посттетаническую потенциацию [18].

Наша гипотеза состоит в том, что существует определенная избирательность влияния интерлейкинов на когнитивные функции, в большей мере связанная с долгосрочным запоминанием.

Целью работы было оценить сопряженность когнитивных процессов с изменениями про- и противовоспалительных интерлейкинов у больных ХИМ, проанализировать, насколько специфично когнитивные процессы связаны с изменчивостью воспалительных цитокинов при когнитивной нагрузке.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В исследовании участвовали 31 мужчина и 63 женщины с ХИМ в возрасте от 42 до 85 лет (средний возраст 65,4 ± 9,1 года, второе значение — стандартное отклонение). Патоморфологической основой когнитивных нарушений при ХИМ являются диффузные и множественные лакунарные очаговые изменения в подкорковом белом веществе и коре головного мозга, причем наиболее часто подкорковые нарушения в большей мере связаны либо с атеросклеротическим поражением мозговых сосудов, либо с липогиалинозом мелких пенетрирующих артерий, кровоснабжающих глубинные отделы мозга. Основные этиологические причины ХИМ: атеросклероз, артериальная гипертензия (включая гипертоническую болезнь), венозная недостаточность, диабетическая ангиопатия, а также васкулиты различной этиологии, заболевания крови и т. д. При этом заболевании наблюдаются нарушения когнитивных функций, больные различались, в основном, по количественным характеристикам нарушения памяти, работоспособности, раздражительности, проявлений стволовой симптоматики и т. д. Критерии включения пациентов в исследование: соответствие I и II стадии дисциркуляторной энцефалопатии (стадии начальных проявлений и субкомпенсации по критериям О. С. Левина [19–20]); праворукость; оценка по шкале МоСа 26 и более баллов (при оценке менее 26 баллов для дальнейшей работы отбирали пациентов, не нуждающихся в повседневной жизни в постоянной опеке со стороны окружающих, т. е. недементных). Критерии исключения: деменция выраженностью 1 балл и более по клинически рейтинговой шкале деменции (Clinical Dementia Rating Scale); наличие в анамнезе острых нарушений мозгового кровообращения; черепно-мозговая травма; тяжелая кардиальная, метаболическая (сахарный диабет 2-го типа) патология; почечная недостаточность; некомпенсированные нарушения функций щитовидной железы.

При тестировании когнитивных функций больные последовательно выполняли ряд тестов. Вначале — корректурную пробу, при которой в тексте без пробелов испытуемые искали в течение трех минут две рядом стоящие одинаковые буквы. Подобное тестирование основано на n-back-тесте Кирчнера при n = 1. Здоровые испытуемые, как правило, выполняли этот тест без ошибок или с одной ошибкой.

Затем проводили тест на вербальную беглость, когда пациенты называли максимальное число слов на три различные буквы (С, К, А). Данные суммировали и усредняли.

Проводили оценку вербальной памяти (по А. Р. Лурия). Испытуемым предлагали запомнить 10 слов при пятикратном повторении. Затем испытуемые выполняли арифметический тест: вычитание из 100 по 7, после которого снова воспроизводили запомненные слова. Подсчитывалось число непосредственно и отсроченно воспроизведенных слов. Здоровые испытуемые запоминали 9–10 слов, безошибочно выполняли тест на вычитание, при отсроченном воспроизведении запоминали 8–10 слов. Тестирование проводили в приведенной выше последовательности тестов.

Для общей оценки когнитивных функций и отбора пациентов использовали Монреальскую шкалу оценки когнитивных функций (МоСа).

Уровень интерлейкинов исследовали в пробах слюны до и после выполнения когнитивных тестов. Определение цитокинов в слюне проводили твердофазным иммуноферментным методом (ELISA) сэндвич-типа. Для определения IL10 использовали наборы реагентов eBioscience (Bender MedSystems; Австрия), для IL1β и IL6 — наборы Вектор-Бест («Вектор-Бест»; Россия). Диапазон измерения: 1–2000 пг/мл. При всех исследованиях использовали калибраторы фирм — производителей реагентов с дополнительно приобретенными калибраторами.

Определение проводили в дублях на плашечном ридере VICTOR 2 (Perken Elmer; США) с использованием контрольных образцов с низким и высоким содержанием исследуемых параметров. Образцы слюны собирали по протоколу, описанному ранее [21], до и после когнитивных проб. Больные не употребляли алкоголь в течение недели, не пили чай или кофе за 1 ч до забора слюны, за 10 мин до этого прополаскивали рот водой. Сбор слюны осуществляли путем ее сплевывания в пробирку объемом не менее 1,5 мл. Слюну собирали за 10 мин до проведения когнитивных тестов, и не позже 10 мин после их выполнения. Образцы слюны, загрязненные кровью, исключали из исследования. Для этого использовали набор иммуноферментного анализа для определения загрязнения слюны кровью.

Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью пакета прикладных программ Statistica-12 (Dell; США). Оценивали нормальность распределения по критерию Колмогорова–Смирнова. Вычисляли средние арифметические, стандартные отклонения, стандартные ошибки и дисперсию, проводили однофакторный дисперсионный и корреляционный анализ. Если распределение отличалось от нормального, применяли непараметрические методы — коэффициент ранговой корреляции Спирмана.

Однофакторный дисперсионный анализ по методу ANOVA использовали для определения сопряженности реактивности интерлейкинов на когнитивные тесты с успешностью выполнения этих тестов, для чего пациенты были разбиты на группы с изменчивостью ниже и выше среднего уровня. IL10 разделяли на группы с негативной и позитивной изменчивостью, так как средняя величина изменчивости IL10 не отличалась от нуля.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

До и после выполнения когнитивных тестов достоверных гендерных различий в изменении содержания интерлейкинов IL1β, IL6 и IL10 обнаружено не было, поэтому оценку реактивности интерлейкинов проводили в смешанной группе мужчин и женщин. Количество интерлейкинов в фоне IL1β и IL6 в слюне коррелировало с возрастом: r = 0,25, n = 94, p = 0,031 и r = 0,21, n = 94, p = 0,041 соответственно. Изменчивость интерлейкинов после выполнения когнитивных тестов IL1β и IL6 не коррелировала с возрастом больных; для IL10 обнаружена слабая корреляция r = 0,24, p = 0,042, n = 74.

Статистические характеристики интерлейкинов представлены в табл. 1.

Изменчивость IL10 достоверно не отличалась от нуля, тогда как все остальные показатели средних достоверно различались.

Изменчивость распределения интерлейкинов по критерию Колмогорова–Смирнова для IL1β и IL10 не отличалась от нормального, в отличие от распределения IL6. Для IL1β и IL10 был проведен однофакторный дисперсионный анализ. Совокупности данных изменчивости IL1β и IL10 были разделены на две группы: ниже и выше средних значений. Средние сдвиги IL1β и IL10 в двух группах представлены в табл. 2. Пациенты всех групп не различались по возрасту.

Изменчивость IL1β в первой группе достоверно не отличалась от нуля, тогда как во всех остальных случаях сдвиги были высокодостоверны (см. табл. 2). Межгрупповые различия изменчивости интерлейкинов по группам достоверны для IL1β и для IL10: F = 81,6 при p < 0,000001 и F = 147,8 при p < 0,000001 соответственно.

Рассмотрим сопряженность когнитивных характеристик с величиной сдвигов интерлейкинов IL1β, IL10 под влиянием выполнения когнитивных тестов.

Положительная изменчивость IL1β во второй группе, связанная с увеличением содержания IL1β, сопровождалась менее успешным выполнением тестов (табл. 3, рис. 1).

Сдвиги противовоспалительного IL10 также связаны с когнитивными функциями, однако полученные зависимости противоположны тем, которые были найдены для воспалительных интерлейкинов 1β и IL6: большая позитивная реактивность IL10 сопряжена с более успешным выполнением когнитивных функций (табл. 4; рис. 2).

Найденные паттерны — количество буквенных паттернов, обнаруженных в корректурном тесте.

Графически различия когнитивных показателей, сопряженных со сдвигами IL10, представлены на рис. 2.

При сравнении рис. 1 и рис. 2 видна прямо противоположная зависимость когнитивных функций от реактивных изменений про- и противовоспалительных интерлейкинов.

Сдвиги IL6 не соответствовали нормальному распределению по критерию Колмогорова–Смирнова, поэтому для оценки связанности сдвигов IL6 с когнитивными характеристиками использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмана, применяемый для непараметрических выборок. Значение коэффициента Спирмана для теста вычитания из 100 по 7 и сдвигов IL6 достоверно отличалось от нуля (r = 0,26; n = 62; p = 0,042). Так же как для IL1β большее число ошибок связано с большей положительной динамикой IL6.

Ряд когнитивных характеристик не был чувствителен к сдвигам интерлейкинов, среди них тест МоСа, показатель беглости словесных ответов и тест Лурия на непосредственное воспроизведение слов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Данные содержания интерлейкинов в слюне в норме значительно варьируют, например для IL10 [22–23]. У пожилых и старых людей на содержание интерлейкинов в слюне может оказать влияние множество причин от перенесенных заболеваний до качества и числа протезированных зубов. В этом случае целесообразно использовать относительные показатели в одной и той же группе больных, в частности, ряд авторов используют такие показатели, как отношение различных воспалительных интерлейкинов между собой, например IL1β и IL10, или реактивные изменения интерлейкинов на стресс. При этом указывают на рост воспалительных интерлейкинов при стрессе, включая и IL10 [23]. При когнитивной нагрузке увеличивается рост содержания IL1β и IL6, при отсутствии изменений в IL10. Отсутствие сдвигов уровня IL10 на когнитивную нагрузку можно объяснить, вероятно, слабым стрессом, ограниченным в основном проявлением симпатоадреналовой активации.

Многие белки, впервые идентифицированные в иммунной системе, были обнаружены и в синапсах нейронов, участвующих в когнитивных процессах [24]. В настоящей работе было показано увеличение содержания провоспалительных интерлейкинов в слюне при выполнении когнитивных тестов у больных с ХИМ. Большей выработке провоспалительных интерлейкинов соответствовало менее успешное выполнение когнитивных тестов. У больных с ХИМ воспалительные процессы усилены по сравнению с нормой [25]. Активация нейронов в этих условиях приводит к увеличению выработки провоспалительных интерлейкинов, но в разной степени в зависимости от тяжести заболевания. Известно, например, что симпатические нейроны продуцируют IL6 и реагируют на него аутокринным или паракринным образом в присутствии растворимого рецептора IL6 [26]. Можно предположить, что активацию нейронов у таких больных сопровождает рост интерлейкинов воспаления. Известно, что воспалительные цитокины нарушают функцию нейронов в мозге взрослого человека за счет их прямого воздействия на нейроны или косвенных механизмов, опосредованных ненейронными клетками (например, микроглией и астроцитами) [27]. Небольшой стресс при когнитивном тестировании больных ХИМ практически неизбежен, поскольку при данном заболевании когнитивные задания многие больные воспринимают как психоэмоциональную нагрузку. Стресс может привести к стимуляции продукции цитокинов, в том числе IL1β, IL6 и др. С одной стороны, нормальный физиологический уровень IL1β необходим для обучения и памяти, с другой — повышенный уровень IL1β неблагоприятен для когнитивной деятельности. Показано, что вызванное стрессом увеличение циркуляции IL6 усиливает воспалительные процессы, вызывая повышение уровня IL1β в головном мозге и, как следствие, способствует увеличению тревожности [28]. Действие IL1β на механизмы памяти и обучения связывают часто с его влиянием на синаптические механизмы длительной потенциации в гиппокампе. IL1β вызывает гиперполяризацию и модулирует синаптическое торможение в преоптических и передних гипоталамических нейронах, а также отменяет длительную депрессию синаптической передачи в гиппокампе. Сеть цитокинов, включающая IL1β, IL18, IL6 и TNFa, взаимодействует с нейронами во время долгосрочной потенциации и обучения. Блокада эндогенного IL1β способствует формированию памяти [29]. 

Действие IL10 прямо противоположно влиянию воспалительных интерлейкинов. Известно, что IL10 включен в регуляцию цитокинов по механизму обратной связи и тормозит действие воспалительных цитокинов. Отсутствие направленной динамики этого интерлейкина при когнитивной нагрузке, вероятно, связано с его невысокой вовлеченностью в собственно когнитивные процессы. Влияние IL10 на когнитивные функции может быть опосредовано его влиянием на воспалительные цитокины IL1β и IL6 [30].

Коррелирующие со сдвигами уровня интерлейкинов когнитивные функции были связаны с удержанием в сознании следов памяти, т. е. пластическими перестройками в мозге. С этой точки зрения показательно, что непосредственное повторение слов после их называния в тесте Лурия не было связано со сдвигом воспалительных интерлейкинов, тогда как отсроченное воспроизведение было сопряжено с изменением уровня IL1β. Это подтверждает возможную роль данного интерлейкина в подавлении посттетанической потенциации. Вероятно, многие эффекты влияния воспалительных интерлейкинов связаны именно с этим механизмом.

Полученные результаты имеют определенную практическую ценность. В существующих многочисленных рекомендациях для пожилых и старых людей с хроническими сосудистыми нарушениями указывается на целесообразность когнитивной нагрузки (решение кроссвордов, изучение иностранных языков и т. п.). Полученные результаты указывают, что в некоторых случаях когнитивная нагрузка может привести к увеличению содержания воспалительных интерлейкинов и сопровождающим их процессам окислительного стресса. Они ставят под сомнение безоговорочную ценность подобных рекомендаций. Дальнейшие исследования могут быть связаны с поиском биологических маркеров воспалительных интерлейкинов, которые были бы удобны для контроля когнитивной нагрузки и реактивных изменений воспалительных цитокинов.

ВЫВОДЫ

Реактивность про- и противовоспалительных интерлейкинов IL1β, IL6, IL10 связана с выполнением когнитивных функций у больных ХИМ. Выполнение когнитивных тестов сопровождалось достоверным повышением уровня IL1β и IL6 в смешанной выборке мужчин и женщин. Изменение уровня всех исследованных интерлейкинов было сопряжено с различной успешностью выполнения ряда когнитивных тестов. Увеличение содержания IL1β и IL6 в слюне сопровождалось ухудшением выполнения таких тестов, как вычитание из 100 по 7, и для IL1β — снижением отсроченного воспроизведения слов в тесте Лурия. В группе больных с позитивной динамикой IL10 в слюне было отмечено снижение числа ошибок при вычитании из 100 по 7, а также более успешное выполнение корректурного теста, по сравнению с группой больных с отрицательной динамикой IL10. Таким образом, значительную положительную динамику уровня провоспалительных цитокинов, вызванную когнитивной нагрузкой, сопровождало снижение когнитивных функций, связанных с отсроченным запоминанием, а аналогичные изменения противовоспалительного интерлейкина IL10 были связаны с более успешным выполнением когнитивных функций. Тесты МоСа, вербальной беглости и некоторые другие не были сопряжены с изменчивостью интерлейкинов. Необходимо обсуждение механизмов влияния интерлейкинов на когнитивные функции. Существует тесная связь между уровнем воспалительных интерлейкинов и некоторыми видами психической активности, что с практической точки зрения требует контроля уровня воспалительных цитокинов при когнитивной нагрузке у больных ХИМ.