Цереброваскулярная патология и в первую очередь ишемический инсульт (ИИ) представляют одну из ведущих причин смертности и инвалидизации трудоспособного населения в экономически развитых странах мира [1]. Этиология ишемического инсульта имеет мультифакторную природу, т. е. развитие болезни обусловлено сложным взаимодействием генетических и средовых факторов [2]. В многочисленных исследованиях показано, что нарушения редокс-гомеостаза, проявляющиеся дисбалансом между образованием активных форм кислорода и их обезвреживанием, лежат в основе окислительного стресса — патологического процесса, патогенетически связанного с развитием ИИ, а также последующими этапами постишемического повреждения тканей головного мозга [3]. Хорошо известно, что окислительный стресс играет важную роль в патогенезе ИИ, особенно в его острой фазе [4, 5], а нарушение метаболизма глутатиона — одного из самых мощных антиоксидантов организма — нередко служит причиной изменения редокс-гомеостаза и формирования окислительного стресса, что может иметь большое значение для формирования постишемического поражения мозга [6, 7]. Дефицит глутатиона у пациентов, предрасположенных к ИИ, может быть связан с генетически детерминированными изменениями активности ферментов, вовлеченных в биосинтез глутатиона [8, 9]. Ключевым ферментом первого этапа биосинтеза глутатиона является глутаматцистеинлигаза. Она состоит из каталитической и модифицирующей субъединиц, кодируемых различными генами, полиморфные варианты которых оказывают влияние на активность фермента и соответственно уровень глутатиона. Однако до настоящего времени исследований по оценке влияния полиморфных вариантов генов метаболизма глутатиона на степень ишемического поражения головного мозга и клинические проявления инсульта не проводилось. Целью настоящего исследования было изучить влияние частых полиморфных вариантов гена каталитической субъединицы глутаматцистеинлигазы (GCLC) на степень поражения головного мозга и клинические проявления у больных с ИИ.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Материалом для исследования послужила выборка, включающая 589 пациентов (средний возраст больных ИИ составил 61,1 — 9,8 лет (330 мужчин и 270 женщин), перенесших ИИ и находившихся на стационарном лечении в Курской областной клинической больнице в период с 2007 по 2017 г. Критерии включения пациентов в основную группу: наличие диагноза ИИ, подтвержденного клиническими и инструментальными методами; славянское происхождение; наличие подписанного добровольного согласия на участие в исследовании. Критерии исключения: наличие у пациента геморрагического инсульта; неславянское происхождение; отсутствие добровольного согласия на участие в исследовании В исследование включали пациентов славянского происхождения (более 75% пациентов были русской национальности согласно анамнестическим данным о хотя бы двух предшествующих поколениях родственников пробандов). Диагноз ИИ был подтвержден на базе стационаров квалифицированными врачами-неврологами на основании данных неврологического статуса пациентов и результатов инструментального обследования: компьютерной томографии головного мозга и магнитнорезонансной томографии головного мозга.

Для генотипирования было отобрано шесть частых полиморфных вариантов rs12524494, rs17883901, rs606548, rs636933, rs648595 и rs761142 гена GCLC. Для отбора SNP на основании референтной гаплотипической структуры европеоидной популяции проекта HapMap использовали биоинформатический инструмент GenePipe [10]. Отбирали только tagSNP с частотой минорного аллеля не менее 5% и находящиеся в неравновесии по сцеплению с двумя и более SNP. Функциональную значимость SNP оценивали с помощью биоинформатической программы FuncPred (SNPinfo Web Server) [11].

Образцы ДНК пациентов были выделены из замороженной венозной крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции и преципитации этанолом. Молекулярно-генетические исследования, включая генотипирование SNP, были выполнены на базе НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ в 2016–2017 гг. Определение SNP проводили с помощью технологии iPLEX посредством мультиплексного генотипирования на генетическом анализаторе MALDI-TOF MassARRAY 4 (Agena Bioscience; США).

Влияние SNP на клинические проявления ИИ оценивали посредством расчета отношения шансов и 95%-х доверительных интервалов (95% CI) методом логистического регрессионного анализа с коррекцией по полу и возрасту с использованием онлайн-статистической программы SNPStats (Каталонский институт онкологии; Испания). Оценку влияния SNP на размер зоны поражения головного мозга (размер зоны инфаркта, выраженный в миллиметрах) у больных ИИ, измеренной с помощью магнитно-резонансной томографии, а также на возраст дебюта первого случая инсульта, число перенесенных инсультов, проводили с использованием программы SNPStats. Функциональное аннотирование полиморфных вариантов гена GCLC и оценку их регуляторного потенциала осуществляли с использованием различных биоинформатических инструментов, таких как GTEx portal [12] и eQTLGen [13], по тканеспецифичной экспрессии и регуляции генов. Эти ресурсы включают геномные и транскриптомные данные, которые можно использовать для оценки влияния анализируемых SNP на уровни экспрессии гена GCLC в головном мозге, артериях и крови.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ распределения частот генотипов SNP гена GCLC позволил установить статистически значимое отклонение от равновесия Харди–Вайнберга только одного полиморфизма rs648595 за счет снижения уровня фактической гетерозиготности (р < 0,05). Распределение частот (%) генотипов исследованных полиморфных вариантов гена GCLC в группе больных ИИ были следующими (в порядке: гомозиготы по референсному аллелю, гетерозиготы, гомозиготы по минорному аллелю): 93,5, 5,8 и 0,7 (rs12524494); 85,4, 13,7 и 1,0 (rs17883901); 93,7, 6,0 и 0,3 (rs606548); 63,5, 31,6 и 4,8 (rs636933); 16,3, 52,1 и 31,6 (rs648595) и 57,2, 37,8 и 4,9 (rs761142). С клинической точки зрения интерес представлял анализ потенциальной вовлеченности исследуемых полиморфных вариантов гена GCLC в патологические процессы, которые происходят после возникновения окклюзии мозговой артерии: формирование очага инфаркта мозга, зоны некроза и воспаления, а также процессы, имеющие отношение к репаративным изменениям постишемического повреждения мозговой ткани. В этой связи методом линейного регрессионного анализа нами были проанализированы взаимосвязи полиморфных вариантов гена GCLC с размером очага поражения мозга (S, мм) у больных с ИИ. Установлено, что SNP rs636933 и rs761142 гена GCLC статистически значимо ассоциированы с размером зоны поражения головного мозга у пациентов с ишемическим инсультом независимо от пола и возраста пациентов. В частности, носительство генотипов rs636933 G/A-A/A GCLC (доминантный эффект SNP), в сравнении с генотипом по аллелям дикого типа (G/G), было сопряжено со статистически значимым (р = 0,009) увеличением зоны инфаркта мозга на 196,36 мм. Генотипы A/C-C/C SNP rs761142 гена GCLC также характеризовались значимым влиянием (р = 0,015) на размер поражения головного мозга — увеличением S на 173,92 мм в сравнении с генотипом A/A (доминантный эффект SNP).

Затем мы проанализировали ассоциации полиморфных вариантов гена GCLC с числом перенесенных ИИ (табл. 1). Для этой цели группа больных была подразделена на две подгруппы: в 1-ю вошли пациенты с одним эпизодом ИИ, во 2-ю — пациенты с двумя и более эпизодами ИИ в анамнезе. Установлены статистически значимые ассоциации двух SNP с числом эпизодов перенесенного пациентами инсульта. Носители генотипов rs12524494G/G и rs606548-T/T гена GCLC имели более высокий риск возникновения двух и более эпизодов ИИ, чем носители альтернативных генотипов (см. табл. 1).

Известно, что более ранний возрастной дебют любого мультифакторного заболевания может быть связан с влиянием генетических факторов [14]. Нами было исследовано, определяют ли полиморфные варианты гена GCLC возрастную манифестацию ИИ. С помощью метода линейного регрессионного анализа с поправкой на пол и возраст было установлено, что полиморфный вариант rs17883901 GCLC статистически значимо связан с возрастным дебютом ИИ. Так, полиморфизм rs17883901 гена GCLC, а именно генотип G/A был ассоциирован с более ранним (56,8 ± 1,65 против 60,52 ± 0,42 года) дебютом первого эпизода ИИ (р = 0,0038; см. рисунок).

Затем методом логистического регрессионного анализа были проанализированы ассоциации полиморфных вариантов гена GCLC с клиническими проявлениями, развивающимися на фоне ИИ, включая нарушения двигательных функций и расстройства чувствительности. Установлены многочисленные статистически значимые ассоциации полиморфных вариантов гена GCLC с клиническими проявлениями ИИ. Нарушение чувствительности было ассоциировано с rs636933 GCLC (OR = 2,72; 95% CI: 1,01–7,33, р = 0,032). Нарушение температурной чувствительности у пациентов с ИИ было связано с полиморфными вариантами rs17883901 (OR = 0,27; 95% CI: 0,09–0,86; р = 0,006) и rs12524494 (OR = 2,25; 95% CI: 1,13–4,46; р = 0,032) гена GCLC. Нарушение тактильной чувствительности ассоциировалось с SNP rs12524494 (OR = 2,51; 95% CI: 1,27–4,99; р = 0,016) и rs606548 (OR = 2,36; 95% CI: 1,08–5,16; р = 0,04) гена GCLC. Нарушение движения мимических мышц ассоциировалось с SNP rs648595 (OR = 0,53; 95% CI: 0,34–0,81; р = 0,0029).

Нарушение походки было связано с эффектами трех SNP: rs648595 (OR = 1,67; 95% CI: 1,03–2,71; р = 0,039), rs761142 (OR = 1,50; 95% CI: 1,11–2,01; р = 0,007), rs636933 (OR = 1,39; 95% CI: 1,03–1,88; р = 0,03) гена GCLC. Мышечная слабость ассоциировалась с SNP rs761142 GCLC (OR = 1,46; 95% CI: 1,02–2,10; р = 0,037). Диплопия ассоциировалась с rs17883901 (OR = 0,12; 95% CI: 0,02–0,88; р = 0,0028). Косоглазие было связано с эффектами двух SNP: rs606548 (OR = 7,68; 95% CI: 1,32–44,56; р = 0,04) и rs12524494 (OR = 6,67; 95% CI: 1,23–36,24; р = 0,05) гена GCLC. Дизартрия ассоциировалась с SNP rs636933 (OR = 0,69; 95% CI: 0,48–0,99; р = 0,04). Нарушение зрения было связано с эффектом полиморфного варианта rs636933 гена GCLC (OR = 0,61; 95% CI: 0,39–0,94; р = 0,023).

Использование геномно-транскриптомных данных портала GTEx по гену GCLC позволило выявить статистически значимые cis-eQTLs (expression

Quantitative Trait Loci) — локусы генома, ассоциированные с изменением его транскрипционной активности. В табл. 2 представлены результаты оценки влияния полиморфных вариантов на экспрессию гена GCLC в различных отделах мозга и артериях), а также в цельной крови. Установлено, что аллель rs648595-G ассоциирован со снижением экспрессии гена GCLC в базальных ганглиях (р = 0,00002) и коре головного мозга (р = 0,000001), а также в крови (р = 1,2 × 10^–70). Аллель rs636933-A был ассоциирован со снижением экспрессии гена GCLC в базальных ганглиях головного мозга (р = 0,00005) и крови (р = 2,1 × 10^–26). Аллель rs761142-С ассоциировался со снижением экспрессии гена GCLC в крови (р = 5,2 × 10^–52), базальных ганглиях (р = 0,000002) и коре головного мозга (р = 0,000004). Однако SNP rs17883901 GCLC не был ассоциирован с экспрессией гена ни в одном из проанализированных видов тканей, имеющих отношение к патогенезу ИИ.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В рамках настоящего пилотного исследования проведена оценка влияния полиморфных вариантов гена ключевого фермента биосинтеза глутатиона — каталитической субъединицы глутаматцистеинлигазы на степень выраженности поражений головного мозга и клинические проявления ИИ. Установлено, что SNP rs636933 и rs761142 гена GCLC являются значимыми ДНК-маркерами, ассоциированными с увеличением зоны инфаркта мозга у пациентов с ИИ. Кроме того, показано, что полиморфные варианты rs12524494 и rs606548 гена GCLC ассоциируются с увеличением частоты возникновения случаев ИИ. Полиморфизм rs17883901 гена GCLC статистически значимо ассоциирован с более ранним дебютом первого эпизода ИИ. Биоинформатический анализ выявил функциональную значимость отдельных полиморфных локусов, ассоциированных с исследуемыми фенотипами. Примечательно, что для описанных выше SNP обнаружен loss-of-function-эффект альтернативных аллелей на уровень экспрессии гена GCLC по результатам оценки геномно-транскриптомных данных портала GTEx, что свидетельствует о возможной связи увеличения зоны поражения со снижением экспрессии данных генов в данном отделе головного мозга. Таким образом, полученные данные указывают на тот факт, что полиморфные варианты гена фермента биосинтеза глутатиона — каталитической субъединицы глутаматцистеинлигазы являются значимыми ДНК-маркерами, определяющими объем ишемического поражения головного мозга и формирование клинической картины болезни. Действительно, выявление взаимосвязей полиморфных вариантов гена GCLC с клиническими проявлениями и течением болезни представляет собой важный аспект генетико-эпидемиологических исследований и позволяет представить дополнительные подтверждения патофизиологической причастности исследуемого гена к патологии, глубже проникнуть в понимание молекулярных механизмов ее развития [15].

По данным литературы, дефицит глутатиона в головном мозге может иметь непосредственное отношение к увеличению восприимчивости мозговых тканей к окислительному повреждению при окклюзии мозговых артерий. Так, эксперименты, выполненные на культуре астроцитов, показали, что истощение пула глутатиона в клетках не влияет на жизнеспособность клеток, по крайней мере, в первые 24 ч, но значительно увеличивает восприимчивость их к воздействию оксида азота или пероксинитрита [7]. In vivo избирательная частичная потеря глутатиона развивается во время очаговой церебральной ишемии и сохраняется во время реперфузии [7]. Причем время и степень истощения глутатиона ассоциируются с вероятностью последующего развития инфаркта ткани. Кроме того, установлено, что объем инфаркта мозга значительно уменьшается при интрацеребровентрикулярной инфузии моноэтилового эфира глутатиона — соединения, которое способно увеличить уровень митохондриального глутатиона [7]. Экспериментально доказано, что моноэтиловый эфир глутатиона обладает нейропротекторными свойствами при очаговой церебральной ишемии [16]. Таким образом, изменения глутатиона могут способствовать тяжести повреждения тканей при инсульте. Предполагается, что образующийся при окислительном повреждении мозговой ткани акролеин (высокотоксичный α, β-ненасыщенный альдегид) является одним из факторов повреждения нейронов, связанных с истощением внутриклеточных запасов восстановленного глутатиона у пациентов с инсультом [17].

ВЫВОДЫ

Полиморфные варианты rs636933 и rs761142 гена GCLC являются значимыми маркерами, определяющими увеличение зоны инфаркта мозга у больных с ИИ. Носительство генотипов rs12524494-G/G и rs606548-T/T сопряжено с увеличением частоты возникновения случаев ИИ, генотип rs17883901-G/A GCLC связан с более ранним дебютом первого эпизода ИИ. Все исследованные нами SNP гена GCLC были статистически значимо ассоциированы с клиническими проявлениями ИИ, включая нарушения двигательных функций и расстройства чувствительности, что демонстрирует причастность SNP гена GCLC к патогенезу болезни. Выявленные биоинформатическими методами loss-of-function-эффекты аллелей могут указывать на то, что увеличение зоны поражения головного мозга связано именно со снижением экспрессии гена GCLC и формирующийся при этом дефицит глутатиона представляет собой тот неблагоприятный фактор, который способствует увеличению степени поражения головного мозга. В этой связи результаты исследования обосновывают необходимость организации и проведения клинических испытаний новой стратегии в лечении острого ИИ и профилактики тяжелых поражений головного мозга — внутривенного введения восстановленной формы глутатиона, что может стать эффективным способом защиты нейронов от ишемических повреждений, вызванных окислительным стрессом. Кроме того, установленные клинико-генетические корреляции открывают возможности использовать данные ДНК-маркеры для индивидуальной оценки характера течения патологии и прогнозирования ее возможных исходов, подобрать персонализированные способы фармакологического лечения и профилактики осложнений, в том числе с учетом этногенетических особенностей пациентов [18].