Поддержание гомеостаза при развитии плода — необходимое условие нормального протекания беременности. Замещение эндотелия спиральных артерий матки клетками трофобласта делает сосуды нечувствительными к системным регуляторам тонуса, что обеспечивает постоянный приток крови к плаценте и плоду. Воспаление и тяжелая гипоксия нарушают инвазию трофобласта в сосуды [1]. Этот процесс считают одной из основных причин развития преэклампсии, серьезного осложнения беременности. МикроРНК, выделяемые трофобластом при гипоксии, могут быть как маркером развивающейся преэклампсии, так и звеном патогенеза этой патологии за счет регуляции экспрессии геновмишеней [2–4].

Для исследования трофобласта in vitro используют клеточные линии хориокарциномы человека, в частности, клеточную линию BeWo b30. Данные клетки не подвержены контактному торможению, могут образовывать состоятельный клеточный барьер, а также обладают высокой подвижностью [5], что позволяет использовать их для моделирования как ворсинчатого, так и вневорсинчатого трофобласта. Использование микрофлюидных устройств позволяет приблизить модель к реальным условиям в организме [6, 7].

Активация сигнального пути гипоксии связана с запуском транскрипции генов-мишеней индуцируемого гипоксией фактора (HIF). Одной из классических моделей химической активации гипоксии является воздействие на клетки хлоридом кобальта (II), который приводит к повышению уровня HIF в клетке [8]. Производные 8-оксихинолина (ПО) тоже способны активировать путь гипоксии за счет стабилизации HIF в клетке [9]. Воздействие ПО на клетки BeWo b30 имитирует эффекты гипоксии в трофобласте [10].

Целью данного исследования было изучить профили микроРНК и экспрессии соответствующих генов-мишеней в модели гипоксии трофобласта.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточная линия BeWo b30 была любезно предоставлена профессором C. Albrecht (Бернский Университет, Швейцария) с разрешения профессора A. Schwartz (Университет Вашингтона в Сент-Луисе, США). Клетки выращивали в шестилуночных планшетах (Corning; США) с площадью культивирования 9,6 см² в среде Gibco DMEM, high glucose (Thermo Fisher Scientific; США) с добавлением 10% Gibco FBS One Shot (Thermo Fisher Scientific; США), 1% Gibco MEM NEAA (100X) и 1% Gibco Pen Strep (100X). При заполнении 80% культуральной поверхности клетки помещали в свежую среду без добавления химических индукторов гипоксии либо с 5 мкМ ПО 4896-3212 (Центр высоких технологий «ХимРар»; Россия) или 300 мкМ

Cobalt (II) chloride (Sigma-Aldrich; США). Спустя 24 ч клетки лизировали в Qiazol Lysis Reagent (Qiagen; Германия) с последующим выделением РНК набором реагентов miRNeasy Mini Kit (Qiagen; Германия) методом фенолхлороформной экстракции [11] и оценкой концентрации РНК на спектрофотометре NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific; США) и качества РНК на автоматизированной системе электрофореза Experion (Bio-Rad; США) по значению RNA Quality Index (RQI), которое составляло не менее 9 для всех образцов.

Подготовку библиотек для секвенирования следующего поколения (NGS) производили с помощью наборов NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (New England Biolabs; США) для коротких РНК и Illumina Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina; США) для мРНК. NGS производили с помощью системы NextSeq 500 (Illumina; США).

Для анализа экспрессии отдельных генов проводили обратную транскрипцию 500 нг тотальной РНК набором MMLV RT Kit («Евроген»; Россия) с последующей ПЦР в реальном времени реагентами qPCRmix-HS SYBR («Евроген»; Россия). Для поиска дифференциально представленных мРНК и микроРНК в клетках BeWo b30 в контрольных условиях и при имитации гипоксии применяли t-критерий Стьюдента с поправкой Бенджамини–Хохберга на множественность сравнений путем расчета значений False Discovery Rate (FDR). Анализ дифференциальной экспрессии производили с использованием DESeq2 v1.28.1 [12] Различия в экспрессии высокопредставленных микроРНК и мРНК считали достоверными при FDR-p < 0,05 и кратности отличий в log2-шкале более 0,4 [13].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ исследований, оценивавших эффект гипоксии на транскриптом различных клеток, позволил выявить ряд ключевых генов, участвующих в ответе на гипоксию [14]. Экспрессия данных генов при воздействии ПО и CoCl₂ на клетки BeWo b30 была определена по данным секвенирования (табл. 1). Экспрессия всех указанных генов изменялась достоверно (p < 0,05), кроме генов CDKN1A и ENO1 при воздействии ПО и SLC2A1 и TMEM45A при воздействии CoCl₂. Стоит отметить, что экспрессия гена EPO, кодирующего эритропоэтин, снижалась при воздействии кобальта, в то время как при реальной гипоксии его экспрессия повышается [14], как и при действии ПО.

Для подтверждения результатов секвенирования и активации ядра гипоксии с помощью ПЦР была проведена оценка экспрессии генов BNIP3, SLC2A3, PDK1 и VEGFA в клетках BeWo b30; в качестве референсных генов использовали ACTB и GUSB. Результаты подтвердили активацию экспрессии указанных генов (табл. 2).

Среди высокоэкспрессированных микроРНК, на которые приходится более 95% всех микроРНК в клетках BeWo b30, были определены микроРНК, уровень которых достоверно изменился при химической индукции гипоксии. При воздействии ПО произошло изменение уровня семи микроРНК (табл. 3), а при воздействии CoCl₂ — 16 микроРНК (табл. 4), при этом общими в этих списках были две микроРНК — hsa-miR-374a-5p и hsa-miR-374b-5p.

Был проведен анализ экспрессии мишеней микроРНК hsa-miR-374a-5p и hsa-miR-374b-5p в клетках при воздействии ПО и CoCl₂. Ранее было показано, что hsamiR-374b-5p может регулировать экспрессию FOXM1 в клеточной линии рака шейки матки SiHa [15]. В клетках BeWo b30 было выявлено достоверное снижение экспрессии гена FOXM1 в 1,7 раза при действии ПО и в 2,6 раза при действии CoCl₂. Поскольку было показано, что микроРНК hsa-miR-21-5p тоже может вызывать снижение экспрессии FOXM1 [16], был проведен анализ сид-регионов hsa-miR-21-5p, hsa-miR-374a-5p и hsa-miR374b-5p, который выявил, что все три микроРНК имеют по одному месту связывания в 3'-нетранслируемой области мРНК FOXM1 (рисунок).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Ответ клеток на гипоксию может различаться, что выражается в активации различных генов и в разной степени выраженности данных изменений. Ранее был проведен анализ целого ряда исследований с целью выявить ключевые гены, активация которых происходила во всех клетках, подвергавшихся воздействию гипоксии [14]. Повышение экспрессии данных генов происходило и в клетках BeWo b30 в нашем исследовании при воздействии ПО и CoCl₂, что может свидетельствовать об активации пути HIF. Показано, что в клетках BeWo под воздействием CoCl₂ происходит повышение экспрессии транспортера глюкозы GLUT1, закодированного в гене SLC2A1 [17–19], что совпадает с нашими наблюдениями. Интересно, что экспрессия гена EPO, кодирующего эритропоэтин, уменьшалась при действии CoCl₂ на клетки BeWo b30, в то время как при реальной гипоксии его экспрессия повышается [14], как и при действии ПО в нашем исследовании. Показано, что HIF способен напрямую повышать экспрессию гена EPO в клетках BeWo [20]. В другом исследовании уровень экспрессии EPO в клетках BeWo был недетектируемым, что не позволило оценить влияние CoCl₂ и гипоксии на его экспрессию [21]. Кобальт стимулирует увеличение экспрессии эритропоэтина в почках [22]. Экспрессия EPO находится под контролем HIF-2α, и хотя кобальт вызывает индукцию как HIF-1α, так и HIF-2α, однако на клеточных линиях рака печени Huh7 и HepG2 было показано отсутствие повышения экспрессии EPO при воздействии CoCl₂ [23]. Вероятно, экспрессия этого гена может зависеть не только от активации сигнального пути HIF, но и от других тканеспецифичных факторов.

Воздействие гипоксии на клетки трофобласта может приводить к выделению целого ряда молекул, включая ассоциированные с гипоксией микроРНК [24]. Выделяемые клетками микроРНК могут влиять на окружающие клетки, а изменение уровня данных микроРНК в различных условиях может определять степень выраженности влияния, однако для этого концентрация микроРНК в клеткепродуценте должна быть достаточно высокой. В связи с этим нами были отобраны 10% микроРНК с наибольшим уровнем в клетках BeWo b30, после чего определены микроРНК, уровень которых достоверно изменился при действии ПО или CoCl₂. Интересно, что из достоверно изменившихся семи микроРНК для ПО и 16 микроРНК для CoCl₂ совпадали только две микроРНК — hsa-miR374a-5p и hsa-miR-374b-5p. Последние закодированы в X-хромосоме в интронах гена FTX, кодирующего длинную некодирующую РНК, которая участвует в инактивации X-хромосомы. Семейство miR-374 участвует в регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки, процессов развития организма и канцерогенеза [25]. МикроРНК hsa-miR-374a-5p и hsa-miR-374b-5p имеют очень схожую последовательность, при этом сид-регион этих молекул совпадает, что предполагает регуляцию одних и тех же генов-мишеней. Уровень hsa-miR-374a-5p был повышен в крови матерей, дети которых родились преждевременно [26] или с низкой массой для своего гестационного возраста [27], что может указывать на возможную связь с гипоксией и патологией плаценты. Известно, что при гипоксии метаболизм в клетках ворсинчатого трофобласта смещается от аэробного к анаэробному, а это позволяет снизить потребление кислорода, но повышает потребление глюкозы. В результате к плоду через плаценту поступает больше кислорода, но меньше питательных веществ, что и может приводить к задержке роста плода или преждевременным родам [28]. Аналогичный эффект был обнаружен и в клетках BeWo b30 при воздействии другого ПО [10].

Среди мишеней микроРНК hsa-miR-374a-5p и hsamiR-374b-5p был выявлен ген FOXM1, кодирующий транскрипционный фактор. Уровень мРНК этого гена в клетках BeWo b30 понижался при воздействии как ПО, так и CoCl₂. Ранее было показано, что микроРНК hsa-miR-21-5p также может вызывать снижение экспрессии FOXM1 и снижать пролиферацию клеток хориокарциномы HTR8/ SVneo, при этом при преэклампсии в ткани плаценты тоже был повышен уровень hsa-miR-21-5p и снижена экспрессия FOXM1 [16]. Эти данные хорошо согласуются с полученными в нашем исследовании. Вместе с тем значимое повышение уровня hsa-miR-21-5p в клетках BeWo b30 происходило только при воздействии ПО, но не CoCl₂, что позволяет предполагать роль hsa-miR-374a-5p и hsa-miR-374b-5p в регуляции экспрессии FOXM1 в данной модели. Близкое расположение мест связывания предполагает конкуренцию микроРНК hsa-miR-21-5p с hsa-miR-374a-5p и hsa-miR-374b-5p по пространственному принципу, поскольку для одновременного взаимодействия комплекса белков-аргонавтов с этими микроРНК необходимо создать значительное пространственное напряжение в цепи мРНК-мишени (см. рисунок).

Возможно, снижение инвазии клеток трофобласта в стенку матки и сосуды матери при патогенезе преэклампсии может быть обусловлено снижением экспрессии гена FOXM1 под влиянием микроРНК hsa-miR374b-5p, что было показано ранее для клеточной линии рака шейки матки SiHa [15]. При уровне кислорода 3%, имитирующем физиологическую гипоксию трофобласта, экспрессия FOXM1 в клетках хориокарциномы JEG-3 была высокой, однако при дальнейшем снижении уровня кислорода выраженно падала. Нокдаун гена FOXM1 приводил к снижению миграционной активности JEG-3, а культуральная среда от таких клеток снижала ангиогенез в культуре эндотелиальных клеток (HUVEC) [29].

ВЫВОДЫ

Полученные результаты свидетельствуют, что воздействие производных оксихинолина и хлорида кобальта (II) на клетки BeWo b30 может служить моделью гипоксии трофобласта плаценты, что подтверждается активацией ключевых генов ответа на гипоксию. Вместе с тем ответ этих клеток на гипоксию в виде изменения экспрессии микроРНК значимо различается для двух вариантов химической индукции гипоксии. Общим для воздействия кобальта и производного оксихинолина является увеличение экспрессии микроРНК семества miR-374, что может указывать на их роль в гипоксическом ответе. Наблюдаемое при этом снижение экспрессии FOXM1, генамишени этих микроРНК, позволяет предположить роль микроРНК miR-374 и FOXM1 в патогенезе нарушения инвазии трофобласта при формировании плаценты как предпосылки к развитию задержки роста плода и преэклампсии.