Известно, что дентальную имплантацию успешно используют для коррекции зубных рядов при частичной или полной адентии [1, 1]. Нередко к стоматологам обращаются пациенты со значительным дефицитом костной ткани в области альвеолярного отростка и части челюсти, что предполагает вмешательство по поводу увеличения объема костной ткани перед установкой имплантатов. При аугментации костной ткани используют алло- и аутотрансплантаты, при этом аутотрансплантаты предпочтительнее [3, 4]. Для этой процедуры подходит кортикальная аутокость из разных внеротовых областей организма: гребень подвздошной кости, свода черепа, участки большой берцовой кости, скуловой кости, а также внутриротовые (ветви нижней челюсти, участки ретромолярной области, подбородочная область). Внутриротовые аутотрансплантаты используют чаще, поскольку их получение менее инвазивно, хирургический доступ более удобен, требуется меньше времени для установки. Важно также, что сокращается расстояние между донорской и реципиентской зоной [5, 6].

Процессы остеорегенерации зависят от ряда факторов: микроархитектоники, плотности кости, соотношения кортикальной и губчатой составляющих, уровня про- и противовоспалительных цитокинов, маркеров деструкции и восстановления костной ткани [7–10]. Известно, что челюсти — это плоские губчатые кости, состоящие из трабекул. Трабекулы формируют каркас для красного костного мозга, в котором происходит кроветворение и образуются клетки крови [11]. Пластинки трабекул на 95% образованы коллагеном 1-го типа, кроме того, в них присутствуют коллагены 3-, 4-, 5-, 11- и 12-го типов (оставшиеся 5%). В межклеточном пространстве имеются неколлагеновые белки остеокальцин, остеонектин, остеопонтин, костные сиалопротеины, фосфопротеины, морфогенетические белки и протеогликаны. Кроме того, оно включает гликопротеины: щелочную фосфатазу, остеонектин, тромбоспондин, фибронектин, витронектин, остеопонтин, сиалопротеин, Wht-гликопротеины. Минеральные компоненты занимают 30% состава костной ткани и представлены кристаллами гидроксиапатита. В состав кости входят также регуляторы стабильности гидроксиапатита — магний, стронций и марганец.

Клеточный состав костной ткани включает остеопрогениторные клетки (ранние предшественники остеобластов), остеобласты, остеоциты, выстилающие клетки и остеокласты. Зрелые остеобласты синтезируют коллаген 1-го типа, протеогликаны и остеокальцин. Незрелые прилегают непосредственно к надкостнице. В их цитоплазме в небольшом количестве имеются гранулы гликогена. Функция остеобластов — синтезировать органический матрикс кости, цитокины, факторы роста. Маркерами остеобластов служат щелочная фосфатаза и остеокальцин (основной маркер регенерации костной ткани). Окончательный этап дифференцировки остеобластов — образование остеоцитов. Они не синтезируют костный матрикс, участвуют в остеолизисе и обеспечивают транспортно-обменные процессы. Резорбцию костной ткани осуществляют крупные многоядерные клетки остеокласты. Они секретируют ионы водорода и ферменты катепсин и коллагеназу, лизирующие органический матрикс. Маркером остеокластов является кислая фосфатаза. Губчатая ткань снаружи покрыта кортикальной костью, а та в свою очередь надкостницей (периостом), в которой проходят питающие кость сосуды. Внутренний слой периоста содержит клеткипредшественники остеобластов, обеспечивающие рост и обновление кости [11]. Изучение структуры костной ткани и ее составляющих имеет принципиальное значение для оценки и прогноза течения процессов регенерации, остеогенеза и остеоинтеграции при дентальной имплантации [12].

Очевидно, что в стоматологическую практику важно внедрять современные оптические методы, позволяющие эффективно, надежно и неинвазивно определять локализацию компонентов костной ткани, ротовой жидкости, а также продуктов периферической крови, для контроля структуры, резорбции и ремоделирования костной ткани. Оценка процессов интеграции при имплантации и аугментации в альвеолярных отростках актуальна для хирургической стоматологии и имеет принципиальное значение, поскольку определяет успех лечения.

Своевременная диагностика нарушений процессов остеоинтеграции и восстановления костной ткани крайне необходима. Известны маркеры резорбции, регенерации и протекторы костной ткани. Существует ряд методов, с помощью которых их можно определить. Биохимический анализ позволяет оценить результаты лечения и профилактики осложнений, но требует довольно большое количество анализируемого материала. Более точной является газовая хромотография, преимущество которой заключается в высокой достоверности результатов. Недостатком этого метода можно считать значительную сложность исследования, высокую стоимость, большие временные затраты на интерпретацию результатов и необходимость экспертной оценки.

В последние годы в биологии и медицине используют множество оптических методов. Одним из них является спектроскопия комбинационного рассеяния — оптический метод, обладающий высокой чувствительностью, позволяющей быстро и точно определять состав и конформацию молекул биологических объектов: клетки, их фрагменты, бактерии, вирусы, белки пептиды, липиды [13, 14]. Отметим, что в стоматологии появляются исследования с применением не только КР, но и спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) [15]. Этот подход обладает высокой чувствительностью и использовался для идентификации основных возбудителей гнойно-воспалительных процессов в челюстно-лицевой области [16]. Важно, что с помощью ГКР выявлены индивидуальные маркеры возбудителей: у бактерии Bacillus subtilius выявлены пики на 657, 726, 1248, 1377, 1466, 1617 см^–1; у E. coli — на 1140, 1551 см^–1; у S. aureus — на 959, 1006, 1160, 1284, 1530 см^–1; у S. haemolyticus — на 1327, 1369; для Ps. aeruginosa — на 675, 1353, 1404, 1605, 1630 см^–1. Таким образом, по спектрам ГКР в ходе лечения, можно выявить причину воспаления. Однако этот подход требует дальнейшего и детального апробирования на практике, так как для реализации ГКР необходимо ипользовать наночастицы (колоиды серебра или золота), токсическое действие которых на состояние ткани и клеток ротовой полости пациента пока не известно.

Учитывая информативность и эффективность, отсутствие длительной пробоподготовки спектроскопии КР, важна разработка технологии оценки остеоинтеграции при дентальной имплантации с помощью метода КР для определения состояния костных аутотрансплантатов и поиска маркеров остеогенеза, резорбции и остеоинтеграции в процессах репаративной регенерации.

Целью работы было исследовать молекулярно-клеточный состав аутотрансплантатов с помощью спектроскопии КР.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В исследовании проводили аугментацию костной ткани челюстей перед установкой имплантатов. Для этого пациентам проводили операцию по увеличению объема костной ткани с помощью аутотрансплантата, состояние которого затем изучали. Объектом исследования были четыре образца кортикально-губчатой костной ткани, полученные в ходе хирургического вмешательства из ретромолярных областей нижней челюсти справа и слева (см. таблица). Исследовали четыре аутотрансплантата, взятых у троих пациентов в возрасте 51–73 лет, двоих мужчин и одной женщины. Критерии включения в исследование: отсутствие соматической патологии; костный дефект нижней челюсти средних размеров; отсутствие лекарственной непереносимости; возраст от 40 до 60 лет. Критерии исключения: наличие серьезной соматической патологии; лекарственная непереносимость; костный дефект нижней челюсти больших размеров; возраст моложе 40 лет и старше 60.

Ход операции по выделению костного блока из донорской области

Под проводниковой и инфильтрационной анестезией (sol. Articaini 3,4 мл) производили разрез по вершине альвеолярного отростка части нижней челюсти в области отсутствующих зубов, отслаивали слизисто-надкостничный лоскут, скелетировали альвеолярную часть нижней челюсти, определяли дефицит костной ткани по ширине или высоте. Под проводниковой и инфильтрационной анестезией (sol. Articaini 3,4 мл) проводили разрез в ретромолярной области слева и справа длиной 3 см, отслаивали слизисто-надкостничный лоскут. При помощи диска с защитным протектором и фиссурного бора производили забор аутотрансплантата размером 2 × 1 × 0,3 см или 1,5 × 1 × 0,3 см. Костный аутотрансплантат разделяли на две тонкие костные пластинки при помощи дисков. Рану ушивали, используя Викрил 4-0.

Образцы костных аутотрансплантатов (размером около 0,1 мм) помещали в стеклянные капилляры диаметром поперечного сечения, равным 1 мм («АгатМед»; Россия) с буфером (145 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 4 мM

Na₂HPO₄, 1 мM NaH₂PO₄, 1 мМ MgSO₄, 5 мМ глюкозы (Sigma; США), рН 7,4) и хранили при температуре 4 °С не более 3 ч.

Методом микроскопии КР исследовали морфологию объекта и молекулярный состав костной ткани, мягких тканей и клеток нижней челюсти. В работе использовали конфокальный микроскоп-спектрометр NTEGRA-SPECTRA (NT-MDT; РФ) с регистрацией в диапазоне 1000–3000 см^–1, с шагом измерения 0,8 см^–1, регистратор — ССD детектор с Пельтье-охлаждением –50°С (объектив 20× с апертурой 0,15, решетка — 600 штр/мм); мощность лазера на образце составляла не более 3 мВт, длина волны возбуждения — 532 нм, время регистрации одного спектра — 10 с, число накоплений сигнала — 3. Число повторов для каждого эксперимента (образец) — 12. Обработка спектров включала в себя вычитание базовой линии и сглаживание спектров в программе Origin2017 (OriginLab Corporation; США).

Пилотное исследование выполняли с целью выяснения возможности использовать метод КР для оценки состояния тканей челюстно-лицевой области, статистическую обработку не проводили.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе работы были получены изображения материала и КР-спектры компонентов аутотрансплантатов (костной ткани, мягких тканей и клетки) из ретромолярной области.

КР-спектры костной ткани аутотрансплантатов, полученных из ретромолярной области

В результате анализа маркеров костной ткани аутотрансплантатов в данной серии экспериментов было обнаружено, что КР-спектр образцов включает ряд характерных полос, которые соответствуют коллагену, фосфатным группам, PO₄^3– -апатиту, карбонат-иону В (типа СО₃^–2), а также адсорбированным на поверхности клеток молекулам белков (деформационное колебание N–Н и валентное С–N белка), липидам (С–Н-группы жирных кислот липидов) и их ОН-группам.  

Так, в КР-спектре пациента у объекта № 2 выявлен ряд полос, которые соответствуют фосфатным группам PO₄³ (563, 943, 975 см^–1), коллагену (1270 см^–1), карбонат-иону В типа СО₃^–2 (1025,1051 см^–1), белкам и липидам (С–Нгруппам жирных кислот липидов — 2862, 2890, 2946 см^–1) и их ОН-группам (3192, 3420, 3559, 3635 см^–1) (рис. 1). Выявлен ряд полос, которые соответствуют фосфатным группам (426, 583, 938 см^–1), карбонат-иону В типа СО₃^–2 (1009, 1023, 1056 см^–1), белкам (деформационное колебание N–Н и валентное С–N белка — 1607 см^–1), липидам (С–Н-группам жирных кислот липидов — 2857, 2889, 2948 см^–1) и их ОН-группам (3204, 3408, 3621см^–1), а также ряд полос, которые характеризуют минеральный состав костной ткани: фосфатные группы PO₄^–3 (415, 457, 570, 580, 892, 936 см^–1 (фосфатная группа апатита)), карбонат В типа CO₃^–2 (1007, 1022, 1050 см^–1) и ОН-группы липидов и белков — 3209, 3399, 3625 см^–1). Обнаружены полосы, которые характеризуют минеральный состав ткани: фосфатные группы PO₄^3– (567, 582, 941 см^–1), а также карбонат В типа CO₃^–2 (1004, 1021, 1054 см^–1) и ОНгруппы адсорбированных белков и липидов (2952, 3214, 3620 см^–1) (см. рис. 1).

КР-спектры ткани аутотрансплантатов, полученных из ретромолярной области

При разработке маркеров для выявления компонентов ткани аутотрансплантатов в ходе операции установлено, что спектр КР характеризуют ряд полос, соответствующих коллагену, гемоглобину крови и белкам (группы амид II белков) и липидам (С–Н-групп жирных кислот липидов), а также их ОН-группам. В КР-спектре пациента у объекта № 2 выявлен ряд полос, которые свидетельствуют о наличии в пробе коллагена (1270 см^–1), гемоглобина (1109, 1151, 1228, 1289, 1353, 1382, 1545, 1570, 1615 см^–1), белков (C–N-связи — 3157, 3204 см^–1) и липидов (С–Н-групп жирных кислот — 2697, 2877, 2911, 2964 см^–1; фосфатных групп — 924, 961 см^–1 фосфолипидов), а также их ОН-групп (3402, 3588 см^–1) (рис. 2).

В КР-спектре пациента у объекта № 1 выявлены характерные полосы, которые соответствуют колебаниям отдельных молекулярных связей в белках (например, 1632 см^–1 — амид II белков; 2848, 2876, 2918, 2930 см^–1), липидах (С–Н-группы жирных кислот липидов), а также их ОН-группах.

КР-спектры клеток аутотрансплантатов, полученных из ретромолярной области

Для маркеров отдельных клеток в составе аутотрансплантатов выявлен ряд характерных полос спектра, которые соответствуют коллагену, гемоглобину эритроцита, белкам (амид- и C–N-связи) и липидам клетки (С–Н-групп жирных кислот и фосфатным группам липидов), а таже их ОН-группам. В КР-спектре пациента у объекта № 1 выявлены ряд полос, которые соответствуют белкам и липидам (С–Н-групп жирных кислот липидов — 2848, 2876, 2930 см^–1) и их ОН-группам (3230, 3420, 3612 см^–1) (рис. 3, рис. 4, рис. 5), коллагену (1274 см^–1), гемоглобину эритроцита (1303, 1335, 1363, 1407, 1531, 1550, 1593 см^–1), белкам и липидам (фосфатным группам — 924, 961 см^–1), С–Нгруппам жирных кислот липидов (2848, 2876, 2930 см^–1) и их ОН-группам (3230, 3420, 3612 см^–1)[18–20]. В КР-спектре пациента у объекта № 2 выявлены характерные полосы, которые соответствуют белкам (1621 — амид; 2841, 2887, 2950 см^–1) и липидам (фосфатным группам — 888, 1432 см^–1), а также их ОН-группам (3212, 3402, 3626 см^–1). В КР-спектре пациента у объекта № 2 выявлены белки и липиды (С–Н-групп жирных кислот липидов — 2836, 2876, 2946 см^–1) и их ОН-группы (3214, 3397, 3614 см^–1). В КРспектре пациента у объекта № 3 выявлены характерные полосы, которые соответствуют коллагену (1314 см^–1 и 1603 см^–1), а также белкам (C–N-связям — 2974, 3002, 3932 см^–1) и липидам (С–Н-группам жирных кислот липидов — 2846, 2902, 2938 см^–1) и их ОН-группам (3238, 3406, 3607 см^–1) (см. рис. 3, рис. 4, рис. 5).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В ходе проведенной работы мы исследовали возможность регистрации КР-сигналов от молекул тканей и клеток в процессе операции получения биологической ткани для аугментации альвеолярных отростков при дефиците костной ткани (планируемая костная пластика) [15–17]. Очевидно, что постоянный контроль за состоянием ткани при хирургическом вмешательстве позволяет врачу оперативно менять протокол операции и проводить дополнительную диагностику [18–20]. В данной работе использовали оптический неинвазивный метод для быстрой и эффективносй диагностики изменений состава и конформации молекул клеток и ткани нижней челюсти пациента. Мы провели предварительные исследования и получили характерные сигналы от костной и околокостной ткани и предполагаем, что использование световодов и КРспектроскопии позволит идентифицировать на молекулярном уровне проблемы и дефекты в ходе операции. Нами было уствновлено, что характерным маркером для диагностики костной ткани являются полосы, свидетельствующие о наличии фосфатных групп (426, 583, 938 см^–1) и карбонатиона В типа СО₃^–2 (1009, 1023, 1056 см^–1). Таким образом, при регистрации данных, маркеров можно оценить вклад данных компонентов или их изменения в ходе хирургического вмешательства. Очевидно, что при регистрации КР-сигнала от совокупности тканей и клеток может быть получен суммарый спектр. Для идентификации специфического сигнала от околокостной ткани (а не от костной ткани) были получены КР-сигналы, которые свидетельствуют о наличии коллагена, гемоглобина, различных белков (C–N-связи) и липидов (С–Нгрупп жирных кислот и фосфатных групп фосфолипидов), а также их ОН-групп. Таким образом, применение нашего подхода позволит выявить изменения как в костной, так и в околокостной ткани нижней челюсти пациента [21, 22].

Важным моментом данного исследования оказалось и то, что нам удалось зарегистрировать КР-сигнал отдельных клеток аутотрансплантатов, соответствующий отдельным молекулам коллагена, гемоглобина, белкам и липидам, а также их ОН-группам).

Установлено, что КР можно использовать для оценки состояния аутотрасплантатов костной ткани при трансплантации. Полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что спектры аутотрансплантатов разных объектов отличаются друг от друга. Предложенный метод оценки состояния аутотрансплантатов предполагается использовать в дальнейшем для идентификации конкретных белков, липидов, других молекул, входящих в структуру костных тканей, и проводить их количественную оценку. В ходе остеоинтеграции образуется большое количество биологически активных молекул, которые могут свидетельствовать об усилении или, наоборот, ослаблении интеграции [3, 6].

Итак, на различных клетках и тканях зафиксированы КР-сигналы от специфических веществ и, вероятно, используя современную технику и световоды для регистрации сигнала в области ротовой полости в ходе операции, можно локализовать воздействие именно на костную ткань и отдельные молекулы в клетках ткани аутотрансплантата (например, гемоглобин, коллаген, белки или липиды) или стволовых клеток в трансплантанте [23].

ВЫВОДЫ

Таким образом, в ходе проведенного исследования было показано, что использование КР-спектроскопии позволяет эффективно и быстро оценить молекулярный состав, а также качественные и количественные изменения костных аутотрансплантатов, используемых при аугментации тканей челюсти. Своевременное выявление факторов, нарушающих остеоинтеграцию, способствующих резорбции костной ткани вокруг имплантата, — одна из основных проблем современной стоматологии. Поэтому исследования, направленные на решение этой проблемы, необходимы и актуальны. Полученные результаты позволяют предположить возможность использования с этой целью метода КРспектроскопии. Применение технологии совмещения регистрации КР и детекции полости рта с помощью световодов может позволить врачу контролировать процесс репаративной регенерации и остеоинтеграции при дентальной имплантации. Совмещение оптической диагностики и цифрового подхода для быстрого анализа состояния ткани способно существенно повысить эффективность операции и терапии.