В последние годы при проведении морфологических исследований все шире применяют метод флуоресцентной микроскопии. Появление этого метода в арсенале исследователей и его быстрое внедрение в клиникодиагностическую практику открывает новые возможности для решения целого ряда задач экспериментальной биологии и медицины. Одной из таких задач является совершенствование методов морфологической диагностики амилоидозов.

Амилоидозы — это группа конформационных заболеваний, общим признаком которых является внеклеточное отложение в органах и тканях нерастворимых патологических фибриллярных белков, амилоидов [1]. Амилоидоз представляет собой тяжелое заболевание с высоким уровнем летальности, при этом наиболее злокачественные формы развиваются у лиц трудоспособного возраста. Накопление амилоида в разных органах (сердце, почках, печени, легких, желудочно-кишечном тракте и др.) приводит к нарушению их функции и может стать причиной развития кардиомиопатии, сердечной и почечной недостаточности, тромбоза печеночных вен и т. д. Накопление амилоида в мозге является гистопатологическим признаком таких нейродегенеративных заболеваний, как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона [2–4]. Дифференциальная диагностика амилоидозов сильно затруднена вследствие большого разнообразия клинических проявлений и отсутствия патогномоничных симптомов. В настоящее время наиболее надежным методом диагностики остается гистологическое исследование образцов тканей с применением красителя конго красного и последующим исследованием препаратов методами световой и поляризационной микроскопии [5]. Однако применение такого подхода нередко приводит к получению ложноположительных и/ или ложноотрицательных результатов [6], что указывает на несовершенство существующей методической базы. Это обуславливает актуальность проблемы поиска новых подходов к улучшению качества морфологической диагностики амилоидозов. Определенный вклад в решение этой задачи может внести применение метода флуоресцентной микроскопии. В настоящее время многие клинико-диагностические центры оснащены флуоресцентными микроскопами, что позволяет им использовать флуоресцентные свойства ряда красителей в диагностических целях, в том числе для диагностики амилоидозов.

Целью работы было оценить эффективность применения метода флуоресцентной микроскопии для идентификации амилоидных скоплений в тканях человека.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В качестве материала для исследования были использованы фрагменты миокарда (n = 12) и коры головного мозга (n = 8) пациентов обоих полов (четверо мужчин и восемь женщин, трое мужчин и пять женщин соответственно) в возрасте от 60 до 98 лет с иммуногистохимически детектированным амилоидозом. Критерии включения: присутствие иммунопозитивных β-амилоидных бляшек в коре головного мозга и скоплений агрегированного транстиретина в миокарде. Критерии исключения: выраженные посмертные аутолитические изменения в ткани мозга или миокарда.

Для верификации присутствия амилоидных скоплений применяли кроличьи поликлональные OC-антитела (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody) к конформационным эпитопам амилоидных фибрилл (разведение 1:1000, кат. номер AB2286, Sigma-Aldrich; США) и мышиные моноклональные (клон TA5F4) антитела к агрегированному транстиретину (разведение 1:600, кат. номер 848102, BioLegend; США).

Материал получен из архива Отдела общей и частной морфологии ФГБНУ «ИЭМ». Образцы фиксировали в 10%ом формалине и заливали в парафин. С парафиновых блоков изготавливали срезы толщиной 5, 7 и 14 мкм. Чтобы оценить возможность использования гистохимических красителей для флуоресцентного выявления амилоидов, препараты коры головного мозга и миокарда человека окрашивали с применением ряда гистохимических красителей (табл. 1).

Анализ и фотографирование препаратов проводили с использованием светового микроскопа Leica DM750 (Leica Microsystems; Германия) и флуоресцентного микроскопа Leica DM2500 (Leica Microsystems; Германия), оснащенного системой фильтров флуоресценции от 340 до 560 нм. Система фильтров состояла из следующих возбуждающих фильтров: ВР=340–380 нм (первый — «А»), ВР=450–490 нм (второй — «I3») и ВР=515–560 нм (третий — «N2,1»).

Подсчет количества выявленных разными методами амилоидных бляшек проводили на серийных срезах коры головного мозга одного и того же случая. Подсчет осуществляли три разных исследователя в идентичных условиях, используя объектив ×40. Так как распределение амилоидных бляшек в нервной ткани характеризуется выраженной неравномерностью, подсчет проводили по всей площади среза (0,67 см²) с последующим пересчетом на см². В качестве контрольного значения использовали количество амилоидных бляшек, выявленных при использовании иммунофлуоресцентной реакции. Для этого применяли мышиные моноклональные (клон DE2B4) антитела к β-амилоиду (разведение 1:200, кат. номер ab11132, Abcam; Великобритания); в качестве вторичных реагентов использовали биотинилированный антимышиный Fab-фрагмент иммуноглобулина осла (Jackson ImmunoResearch; США) и конъюгат стрептавидина с флуорохромом Cy2 (Jackson ImmunoResearch; США).

Статистический анализ полученных данных выполнен в программе GraphPad Prism 9 (GraphPad Software Inc.; США). Для сравнения показателей использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим попарным сравнением групп (тиофлавин Т, конго красный, метиловый фиолетовый) с контролем (иммуногистохимия) с помощью post hoc критерия Даннета. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

Данные представляли в следующем формате: среднее ± стандартная ошибка среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эффективность применения гистохимических красителей для флуоресцентного выявления амилоидных скоплений

Результаты применения разных гистохимических красителей для идентификации скоплений β-амилоида и транстиретинового амилоида с использованием методов световой и флуоресцентной микроскопии представлены в табл. 2 и табл. 3 соответственно.

Способность связываться с амилоидными фибриллами с формированием флуоресцирующего комплекса характерна для трех красителей — тиофлавина Т (ThT), конго красного и метилового фиолетового.

При окраске ThT амилоидные бляшки в коре головного мозга хорошо визуализируются уже на малом увеличении микроскопа (×10). Выявленные скопления имеют вид компактных очаговых образований, флуоресцирующих в синем диапазоне спектра (рис. 1А). Амилоидные бляшки характеризуются морфологической гетерогенностью, которая выражается в том, что для одних бляшек характерно наличие интенсивно флуоресцирующего плотного центра округлой формы и расположенного вокруг него волокнистого ореола (рис. 1А; стрелка 1), при этом другие бляшки выглядят как скопления, сформированные только волокнистыми структурами (рис. 1А; стрелка 2). Флуоресценция характерна для амилоидных бляшек обоих морфологических типов. При окраске ThT они визуализируются с одинаковой эффективностью (рис. 1А). Анализ препаратов выявил присутствие небольшой фоновой флуоресценции ядер клеток и автофлуоресценции липофусцина — пигмента, накапливающегося в нейронах при старении.

Транстиретиновый амилоид в миокарде человека при окраске ThT также характеризуется интенсивной флуоресценцией в синем диапазоне спектра (рис. 1Б). Как и в случае изучения препаратов коры головного мозга, в миокарде было отмечено присутствие фоновой флуоресценции ядер клеток (рис. 1Б, головка стрелки, бирюзовый цвет) и автофлуоресценции липофусцина (рис. 1Б, короткая стрелка, оранжевый цвет), накопление которого характерно не только для нейронов, но и для кардиомиоцитов. Важно отметить, что, хотя цвет флуоресценции неамилоидных компонентов ткани отличается от цвета флуоресценции связавших ThT амилоидных фибрилл, присутствие дополнительных флуоресцирующих элементов затрудняет идентификацию амилоидных скоплений и их количественный анализ.

Анализ препаратов, окрашенных конго красным, с помощью флуоресцентного микроскопа показал, что конгофильные амилоидные скопления в тканях человека флуоресцируют в красном диапазоне спектра (рис. 1В, Г). При изучении препаратов коры головного мозга было отмечено, что после окраски конго красным амилоидные бляшки выявляются не во всех исследованных образцах.

Лишь в трех проанализированных случаях из восьми в тканях мозга были идентифицированы единичные конгофильные скопления. Наиболее высокой интенсивностью флуоресценции при окраске конго красным обладает плотное центральное ядро амилоидной бляшки. Периферический волокнистый ареол плохо визуализируется. Бляшки, не имеющие компактного центра, значительно хуже различимы по сравнению с бляшками, имеющими ярко флуоресцирующую центральную область. Было также отмечено присутствие значительной фоновой флуоресценции (в красном диапазоне спектра) ядер клеток коры головного мозга, эритроцитов и липофусцина (рис. 1В).

При изучении препаратов миокарда, окрашенных конго красным, амилоидные скопления выглядели как волокнистые агрегаты разного размера, локализованные в интерстициальном пространстве миокарда и интенсивно флуоресцирующие в красном диапазоне (рис. 1Г). Было отмечено присутствие автофлуоресценции липофусцина, которая сильно затрудняла идентификацию амилоидных скоплений, особенно в случае накопления большого количества этого пигмента кардиомиоцитами.

При анализе препаратов, окрашенных метиловым фиолетовым, с помощью флуоресцентного микроскопа было обнаружено, что в данном случае амилоидные бляшки интенсивно флуоресцировали в синем диапазоне спектра (рис. 1Д). При этом фоновая флуоресценция ткани полностью отсутствовала. Наблюдалось лишь слабое темномалиновое окрашивание нервной ткани, что усиливало контрастность выявления амилоидных бляшек (рис. 1Д). Полное отсутствие фоновой флуоресценции значительно облегчало идентификацию амилоидных бляшек. Бляшки с плотным центральным ядром и бляшки без него визуализировались одинаково эффективно. Интересно, что транстиретиновый амилоид в миокарде человека не флуоресцирует при окраске метиловым фиолетовым (в отличие от амилоидных бляшек в коре головного мозга), хотя при наблюдении окрашенных препаратов в проходящем свете амилоидные депозиты в миокарде четко визуализируются за счет метахроматической окраски амилоида в насыщенный фиолетовый цвет (рис. 2А).

Интересной находкой в рамках проведенного исследования стала окраска транстиретинового амилоида миокарда основным фуксином. При использовании этого красителя амилоидные скопления приобретают насыщенный красный цвет при наблюдении в проходящем свете (рис. 2Б). По нашим данным, ранее способность основного фуксина метахроматически окрашивать амилоид описана не была.

Количественный анализ амилоидных бляшек, выявляемых с использованием разных красителей

В ходе анализа препаратов коры головного мозга человека было отмечено, что визуально количество выявляемых амилоидных бляшек сильно варьирует в зависимости от выбранной методики окраски. В связи с этим было проведено количественное исследование, которое заключалось в подсчете амилоидных бляшек тремя разными исследователями на препаратах одного и того же случая, окрашенных разными красителями. Результаты проведенного количественного анализа представлены на рис. 3. Полученные результаты были сопоставлены с результатами иммуногистохимической реакции на β-амилоидные фибриллы как наиболее чувствительного метода идентификации амилоидных бляшек.

Из представленной гистограммы видно, что количество амилоидных бляшек, выявляемых при использовании любого гистохимического красителя, значимо меньше по сравнению с количеством иммунопозитивных бляшек. Среднее количество выявляемых методом иммунофлуоресценции амилоидных бляшек в образце, взятом для количественного анализа, составило 1106 ± 76,72 на см² ткани мозга. Наименьшие количественные различия с группой контроля наблюдались при окрашивании срезов ThT. При применении такой окраски среднее количество амилоидных бляшек составило 810,9 ± 44,49 на см². Наибольшие различия с группой контроля наблюдались при использовании конго красного: количество визуализируемых бляшек составило 268,1 ± 15,34 на см². Среднее количество бляшек при окраске метиловым фиолетовым было 399,0 ± 60,03 на см², что являлось промежуточным значением между результатами использования ThT и конго красного.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Способность формировать флуоресцирующие комплексы при связывании с клеточными и тканевыми структурами ранее была показана для целого ряда гистохимических красителей. Так, флуоресцентные свойства эозина применяются для визуализации эластических волокон [7], оценки повреждения печени [8], морфологической оценки состояния селезенки [9], изучения структуры и функционального состояния пародонта [10].  Основной фуксин также обладает способностью флуоресцировать при связывании с эластическими волокнами [11]. В связи с этим поиск среди известных гистохимических красителей новых флуоресцентных зондов, специфичных в отношении амилоидных фибрилл, может способствовать разработке новых диагностических подходов для выявления амилоидозов.

Окраска срезов ThT является наиболее известным способом флуоресцентного выявления амилоида. Показано, что молекулы этого красителя способны специфично встраиваться в β-складчатую структуру амилоидных фибрилл. По мнению исследователей, такое встраивание блокирует вращение диметиламинобензольного кольца относительно бензатиазольного в молекуле красителя, вследствие чего происходит значительное (в тысячи раз) увеличение квантового выхода его флуоресценции [12]. Согласно литературным данным, при связывании ThT с амилоидными фибриллами имеют место сдвиг максимума его возбуждения с 385 нм до 450 нм и сдвиг максимума эмиссии с 445 нм до 482 нм [13]. В связи с этим флуоресценцию окрашенных ThT амилоидных скоплений принято оценивать в «зеленом» диапазоне спектра (с использованием возбуждающего фильтра «I3» ВР=450–490 нм). Наши исследования свидетельствуют о том, что окраска ThT является эффективным методом визуализации β- и транстиретинового амилоидоза у человека. Интересно, что после окраски срезов коры головного мозга и миокарда человека ThT мы наблюдали интенсивную флуоресценцию амилоидных скоплений не только в «зеленой», но и в «синей» части спектра (при использовании возбуждающего фильтра ВР=340– 380 нм). Причем в этом случае автофлуоресцирующие элементы нервной и мышечной ткани (липофусцин, накапливающийся в нейронах и кардиомиоцитах при старении, NADPH, содержащийся в митохондриях, и др.) имеют цвет, отличный от цвета флуоресценции окрашенных ThT амилоидных фибрилл. Это значительно увеличивает контрастность выявления амилоида.

Несмотря на то что ThT способен избирательно взаимодействовать с белками в состоянии амилоидных фибрилл, образуя при этом интенсивно флуоресцирующий комплекс, для клинической диагностики его применяют значительно реже, чем другой краситель со сходным механизмом действия, конго красный. В настоящее время именно окраска конго красным является «золотым стандартом» выявления амилоида. Ее широко применяют в научных исследованиях и клинико-диагностической практике [14, 5]. Как и ThT, конго красный обладает свойством встраиваться в β-складчатый слой амилоидных фибрилл, при этом приобретая способность поворачивать плоскость поляризации света. Поэтому для подтверждения природы обнаруженных конгофильных скоплений традиционно применяют метод поляризационной микроскопии [14]. Однако цвет свечения конгофильных скоплений в поляризованном свете может сильно варьировать, что значительно усложняет интерпретацию полученных результатов [15].

Нами было показано, что для верификации скоплений амилоида после окраски конго красным вместо микроскопии в поляризованном свете может быть рекомендовано использование флуоресцентной микроскопии. Способность конго красного флуоресцировать при связывании с фибриллами амилоида была описана еще в 1959 г. [16], однако в то время использование флуоресцентных свойств конго красного не нашло широкого применения. Вероятно, это обусловлено тем фактом, что на момент выхода указанной статьи флуоресцентные микроскопы были доступны лишь немногим диагностическим лабораториям. Использование свойства конго красного флуоресцировать при связывании с амилоидом может способствовать снижению количества ложноположительных и ложноотрицательных результатов, связанных с ошибочной интерпретацией результатов из-за непостоянства зеленого оттенка свечения конгофильных скоплений в поляризованном свете. Тем не менее важно подчеркнуть, что, согласно результатам наших исследований, окраска конго красным характеризуется низкой эффективностью в отношении выявления амилоидных бляшек. Об этом свидетельствует тот факт, что при использовании конго красного амилоидные бляшки удается идентифицировать не во всех образцах коры, в которых они присутствуют (согласно данным иммуногистохимического исследования). Кроме того, количество выявленных конгофильных бляшек в образце, взятом для количественного анализа, в четыре раза меньше соответствующего значения, полученного после проведения иммуногистохимического окрашивания.

Первые попытки выявления амилоида с помощью метахроматических красителей, таких как толуидиновый синий, кристаллический фиолетовый и метиловый фиолетовый, относится к концу прошлого века. Согласно результатам исследований тех лет, эти методики значительно менее эффективны в отношении выявления амилоида по сравнению с окраской конго красным и ThT [17]. Здесь следует отметить, что исследование препаратов, окрашенных с использованием метахроматических красителей, ранее проводили исключительно методом микроскопии в проходящем свете. Нами было отмечено, что окраска метиловым фиолетовым с последующей верификацией амилоида методом флуоресцентной микроскопии является эффективным способом выявления β-амилоидных бляшек. В этом случае идентифицировать амилоидные бляшки в пределах среза значительно легче благодаря полному отсутствию фоновой флуоресценции неамилоидных компонентов ткани. Ранее было показано, что обработка парафиновых срезов тканей кристаллическим фиолетовым, который по своей химической структуре близок к метиловому фиолетовому, приводит к значительному уменьшению автофлуоресценции [18]. Вероятно, метиловый фиолетовый обладает сходным свойством. Интересно, что эта методика окраски неэффективна в отношении транстиретинового амилоидоза миокарда. В данном случае амилоид приобретает метахроматическую окраску при наблюдении в проходящем свете, но характеризуется полным отсутствием флуоресценции. Это может указывать на специфику связывания молекул красителя метилового фиолетового с амилоидными фибриллами определенной природы.

Идентификация амилоидных бляшек в коре головного мозга человека является актуальной задачей, так как их наличие служит одним из основных гистопатологических признаков болезни Альцгеймера. В ходе проведенных исследований нами было отмечено, что проанализированные гистохимические красители демонстрируют разную эффективность взаимодействия с амилоидными бляшками с образованием флуоресцирующего комплекса. Наблюдаемые различия в количестве выявляемых разными методами амилоидных бляшек могут быть обусловлены разной специфичностью красителей в отношении связывания β-амилоидных фибрилл. Наличие достоверных различий с результатами, полученными при использовании метода иммунофлуоресценции, указывает на то, что использованные гистохимические красители связываются не со всеми присутствующими на срезе амилоидными бляшками, а лишь с частью амилоидных бляшек. Возможно, это обусловлено существованием структурных различий между разными типами амилоидных бляшек. Так, отмечено, что диффузные (или незрелые) амилоидные бляшки не имеют фибриллярного строения и представляют собой компактные скопления β-амилоидного пептида [19]. Из-за отсутствия в структуре этих бляшек амилоидных фибрилл они не способны взаимодействовать с такими красителями, как конго красный и ThT, молекулы которых встраиваются в структуру с определенной конформацией. С этой точки зрения, методы гистохимического выявления амилоида не являются полными аналогами методов иммуногистохимии, поскольку применение антител позволяет выявлять место локализации определенного белка (β-амилоида, транстиретина и т. д.). В данном случае гистохимические методы представляют собой более эффективный способ выявления конформационной патологии.

Несмотря на то что количественные данные свидетельствуют о меньшей эффективности использования любой из гистохимических окрасок для выявления амилоидных бляшек по сравнению с методом иммунофлуоресценции, полученные результаты могут представлять интерес для будущих исследований. Метод иммунофлуоресценции — сложный в реализации и дорогостоящий из-за высокой стоимости необходимых реагентов и расходных материалов. По этой причине его можно применять в качестве рутинного метода далеко не во всех научных, клинико-диагностических и патоморфологических лабораториях. Гистохимические методики, напротив, отличаются простотой и дешевизной, будучи значительно более доступными. Проблему более низкой эффективности этих методик в отношении выявления амилоида отчасти можно решить за счет модификации имеющихся гистохимических красителей и создания их аналогов [12, 20].

ВЫВОДЫ

Применение метода флуоресцентной микроскопии позволяет найти новые подходы для визуализации амилоида в тканях человека, что может быть успешно использовано для улучшения эффективности морфологической диагностики амилоидозов. Тиофлавин Т является наиболее эффективным гистохимическим красителем для флуоресцентного выявления β- и транстиретинового амилоидоза в тканях человека. Методика окраски конго красным характеризуется высокой эффективностью в отношении транстиретинового амилоидоза, но плохо подходит для идентификации β-амилоидных бляшек. Способность конго красного флуоресцировать при связывании с амилоидными фибриллами может быть использована для верификации амилоидных скоплений вместо поляризационной микроскопии. Метиловый фиолетовый обладает способностью специфически связываться с β-амилоидными скоплениями с образованием флуоресцирующего комплекса, одновременно подавляя автофлуоресценцию нервной ткани. Это делает методику окраски метиловым фиолетовым перспективной для диагностики патологии альцгеймеровского типа.