За последнее годы для восстановления полнослойных дефектов гиалинового хряща широкую популярность получила технология индуцированного матрицей аутохондрогенеза AMIC (autologous matrix indused chondrogenesis) [1–4]. Этот метод основан на формировании отверстий в субхондральной кости (обеспечивающих транспорт костного мозга на поверхность дефекта) и регенеративной способности стромальных клеток костного мозга, поступающего через сформированные отверстия. Образующийся в результате «суперсгусток» из красного костного мозга стабилизируется коллагеновой мембраной, имплантируемой в зону дефекта хряща. Естественный клеточный каркас защищает и связывает прогениторные клетки внутри «биологической камеры», стимулируя их дифференциацию для репарации хряща [3, 5].

Преимущества AMIC очевидны. Это мало инвазивная одноэтапная процедура, не требующая культивирования хондроцитов; возможность восстановления крупных дефектов хряща (≥ 6–8 см²); простая хирургическая техника; подтвержденная эффективность в отношении купирования болевого синдрома, восстановления функции сустава и удовлетворенности больных исходами лечения.

Несмотря на широкую популярность AMIC, остается много спорных и нерешенных вопросов: сроки деградации мембраны; характер ее трансформации в хрящевую ткань; качество вновь образованной на месте имплантации мембраны хрящевой ткани и др. [6, 7].

В настоящее время коллагеновая мембрана является одним из наиболее востребованных биологических материалов для восстановления хрящевой ткани. К сожалению, высокая стоимость импортных предложений не позволяет внедрить AMIC в широкую клиническую практику отечественных медицинских учреждений. В то же время потребность в выполнении операций по восстановлению хряща остается высокой. Этот факт определил необходимость разработки отечественного аналога, отвечающего всем современным требованиям, предъявляемым клиницистами к коллагеновым мембранам.

Целью исследования было экспериментальным путем изучить биологический потенциал коллагеновых мембран и их способность к трансформации в хрящевую ткань.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали два вида коллагеновых мембран, отличающихся по составу, структуре и характеру производства.

В качестве основной (тестируемой) использовали разработанную российскими учеными мембрану Ortokeep («Ортософт»; Россия). Мембрана сформирована методом электроспиннинга из нановолокон диаметром 300–500 нм, состоящих из смеси бычьего коллагена I типа и полилактида. Мембрана имеет одинаковый микрорельеф и смачиваемость с обеих сторон. Метод формирования мембраны и структура нановолокон радикально отличают ее от зарубежных аналогов, что позволяет произвести объективный сравнительный анализ их биологического потенциала.

В качестве контрольной использовали коллагеновую мембрану Chondro-Gide (Geistlich Pharma; Швейцария), синтезированную из свиного коллагена I и III типа, который резорбируется естественным путем. Эта мембрана является наиболее популярным биопродуктом и широко используется для восстановления полнослойных дефектов хряща. Поэтому данная мембрана была выбрана нами в качестве контрольной.

Модель эксперимента

Исследование проводили на четырех свиньях породы Русская белая возраста 6 месяцев, весом 68/67,4/79/73 кг, которых содержали в подсобном хозяйстве Центра доклинических исследований (г. Пенза) изолированно от общего поголовья. Животные на момент начала эксперимента находились в удовлетворительном состоянии, имели светлый окрас, самостоятельно принимали пищу и воду, внешние признаки заболевания отсутствовали. В анамнезе указаний на перенесенные заболевания не было. Все особи пребывали в изоляция за три недели до эксперимента, на дозированном кормлении. Исследование выполняли с использованием анальгетиков системного действия, применяемых в ветеринарии и клинической медицине в соответствующих для конкретного животного дозировках (ксилазин и др.). Глубину анестезии контролировали по системным реакциям: спонтанному дыханию, частоте сердечных сокращений, артериальному давлению, состоянию зрачка, пульсоксиметрии. Респираторную поддержку осуществляли при помощи наркозно-дыхательного аппарата,  путем ингаляции кислородно-воздушной (газо-наркотической) смеси, состоящей из 75–85% кислорода, воздуха и 1,0–3,0 об.% изофлюрана (аеррана) по полузакрытому типу.

На суставах правых задних конечностей каждого животного с помощью круглого бора формировали по одному полнослойному дефекту хряща (дефект № 1) прямоугольной формы размером 1 × 0,5 см, доходящего до субхондральной кости (рис. 1А). Тонким сверлом диаметром 1,5 мм производили рассверливание субхондральной кости на глубину 1 см, что позволяло обеспечить транспорт костного мозга на поверхность дефекта (рис. 1Б). Коллагеновую мембрану Ortokeep моделировали по форме и размеру дефектов и фиксировали к субхондральной кости с помощью фибринового клея (рис. 1В).

На суставах левых задних конечностей формировали по два дефекта: дефект (№ 2) — для имплантации мембраны Chondro Gide и контрольный дефект (№ 3) — без имплантации мембраны (рис. 1Г). Коллагеновую мембрану моделировали по форме и размеру дефекта. После рассверливания субхондральной кости на дефект № 2 наносили фибриновый клей и имплантировали коллагеновую мембрану Chondro-Gide (рис. 1Д). На контрольный дефект № 3 имплантацию мембраны не осуществляли (рис. 1Е).

Животных выводили из эксперимента в сроки 2, 3, 4, 6 месяцев после операции путем наркотизации (ксилазин 15 мл, золетил 1,5 мл внутримышечно) с последующим кровопусканием (пересечением сонных артерий).

Для последующего гистологического исследования предоставляли крупные костно-хрящевые фрагменты с расположенными на них исследуемыми дефектами. Для последующего микроскопического исследования из центральной части каждого дефекта производили забор одного фрагмента-биоптата.

Проводили щадящую кислотную декальцинацию костных фрагментов с последующей стандартной гистологической обработкой. Гистологические срезы толщиной 7–8 мкм окрашивали гематоксилином и эозином по методу Ван-Гизона. Используя микроскоп с цифровой фотонасадкой разрешением 12 мегапикселей (Sony; Япония), с каждого гистологического среза производили микросъемку препарата (не менее 5 полей зрения); исследовали ответную воспалительную реакцию, структуру тканей, процентное соотношение тканей в области дефекта, состояние микроциркуляторного русла.

Полученные данные подвергали статистической обработке с использованием статистических пакетов Statistica v.10 (StatSoft; США). Для проверки нормальности распределения в данной работе был использован критерий Шапиро–Уилка. Все описанные в работе параметры имели распределение, близкое к нормальному. Для каждого параметра рассчитывали среднюю арифметическую (M), ошибку средней арифметической (m).

Достоверность различий между группами определяли с помощью параметрического критерия Фишера и непараметрического критерия Колмогорова–Смирнова. Различия считали достоверными при 95%-м пороге вероятности (p < 0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Макроскопическое исследование

При макроскопическом исследовании контрольной группы (дефект № 3, без имплантации мембран) было отмечено прогрессирующее увеличение его размеров без признаков регенерации хрящевой ткани на поверхности дефекта, вплоть до 6-месячного срока (рис. 2).

В то же время в экспериментальных группах (дефекты № 1 и 2) выраженное увеличение размеров дефекта не выявлено. Дно дефектов ровное, но не равномерное. При пальпации дно ткани на ощупь упруго-эластичное. Оба

дефекта покрыты жизнеспособной стабильной хрящевой тканью (см. рис. 2).

Микроскопическое исследование

Микроскопическое исследование в контрольной группе (дефект № 3) показало признаки прогрессирующей деструкции костной ткани и очень слабые признаки хондрогенеза, которые проявлялись только в непосредственной близости от интактного хряща (рис. 3).

При исследовании гистологических стекол после имплантации мембраны Ortokeep во всех сроках вывода воспалительный процесс и лейкоцитарная инфильтрация не выявлены. Четкая граница интактного хряща выявляется до срока 4 месяца, а на 6-м месяце она стирается. Отмечено, что подлежащая костная ткань подверглась значительной резорбции в непосредственной близости от дефекта. Но признаков остеодистрофии в окружающем губчатом веществе не выявлено (рис. 4).

На месте удаленного хряща и резорбированной костной ткани формировалась грубоволокнистая соединительная ткань. С первого срока вывода отмечены образование и созревание соединительной ткани и, как следствие, к 6-месячному сроку вывода — уменьшение ее объема (таблица). Параллельно по краям дефекта костной ткани происходили активные репаративные процессы костной ткани — неоостеогенез. Дефект первоначально имел колбообразную форму, но в дальнейшем приобретал цилиндрическую форму и к 6 месяцам становился клиновидным. Со 2-го до 4-го месяца дефект в основном был заполнен грубой волокнистой тканью, а на 6-м месяце практически полностью закрылся костной тканью. Формирование хондроцитов (неохондрогенез) происходило активно и не только у края неповрежденного хряща, островки хондроцитов образовывались также по центру дефекта (см. рис. 4). В центре дефекта имелось глубокое щелевидное пространство, уходящее относительно глубоко в губчатое вещество.

При исследовании гистологических стекол после имплантации мембраны Chondro-Gide воспалительный процесс и лейкоцитарная инфильтрация не выявлены. Граница разрушенного хряща нечеткая. По центру на месте дефекта образовалась щелевидная полость, подлежащая костная ткань подверглась резорбции (глубина резорбции меньше по сравнению с контрольной группой), на месте резорбированной костной ткани сформировалась грубоволокнистая соединительная ткань с тенденцией к образованию костной ткани по краю дефекта и множественными островками хондроцитов в толще дефекта. Дефект имел колбообразную форму, и формирование неохондроцитов происходило активнее в направлении от периферии к центру. Имелись отдельные щелевидные полости в толще грубоволокнистой соединительной ткани. На дне дефекта между соединительной тканью и костной тканью сформировалась довольно выраженная прослойка, состоящая из жировых клеток. Процессы неоангиогенеза выраженные. В толще соединительной ткани формировались также островки хондроцитов, но в отличие от дефекта № 1 островки хондроцитов отмечены ближе к формирующейся костной мозоли (рис. 5).

При анализе результатов измерений отмечено, что в центре области вмешательства у контрольной группы новообразованный хрящ так и не появлялся во всех сроках исследования (таблица). В группах 1 и 2 на 2-м месяце исследования хрящ также не выявлен. Но уже с 3-го месяца исследования хрящ выявлялся и отмечена тенденция к статистически достоверному (p < 0,05) увеличению его толщины вплоть до 4-го месяца (в  группе 1 — на 18,7% (657,1 ± 34,46 мкм), в группе 2 — на 12,8% (571,4 ± 29,96 мкм)). Однако к 6 месяцам толщина статистически достоверно (p < 0,05) уменьшалась в  группе 1 — на 51,1%, в группе 2 — на 44,2% (335,94 ± 13,47 мкм и 252,68 ± 12,19 мкм соответственно), что связано скорее всего с «организацией» хрящевой ткани. Данный факт подчеркивает эффективность применения мембран.

Толщина соединительной ткани в контрольной группе к 6-месячному сроку увеличилась на 32,1% (p < 0,05), тогда как в группах 1 и 2 уменьшилась (p < 0,05) на 18,5% (1688,66 ± 71,60 мкм) и 46,4% (900,58 ± 72,43 мкм) соответственно. Уменьшение толщины соединительной ткани свидетельствует о репаративных процессах в области вмешательства. Столь бурная динамика уменьшения толщины соединительной ткани в группе 2 обусловлена замещением ее жировой тканью. Данный факт несколько ухудшает конечный процесс восполнения костной ткани.

Толщина кортикальной пластинки в области вмешательства в контрольной группе и  группе 2 к 6-месячному сроку увеличивалась (p < 0,05) на 17,6 и 24,0% соответственно, тогда как в  группе 1 толщина кортикальной пластинки с 2-месячного срока до 6-месячного срока наоборот уменьшилась (p > 0,05) на 4,3%. Увеличение толщины кортикальной пластинки происходило в основном за счет новообразованной ткани (остеоида). В последующем происходило ее созревание с формированием зрелой ткани, при этом «созревание» костной ткани начиналось быстрее в  группе 1, что говорит о более благоприятных условиях в области вмешательства.

Вышеописанные изменения в зонах вмешательств подтверждаются данными процентного соотношения компонентов, представленных в таблице.

Стоит также отметить процессы неоангиогенеза. Во всех группах был отмечен статистически достоверный (p < 0,05) прирост общей площади кровеносных сосудов. Но наиболее быстрый прирост выявлен в первой группе (до 12,79 ± 0,65 %), что свидетельствует о лучшей трофике тканей, расположенных в области вмешательства. В группе 2 площадь соединительной ткани увеличилась до 11,91 ± 0,42%.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Показанная низкая эффективность одной лишь туннелизации субхондральной кости ставит под сомнение целесообразность выполнения подобных операций в клинической практике, что подтверждают исследования других авторов [1]. Высокая эффективность коллагеновых мембран для регенерации хрящевой ткани, отмеченная в нашем исследовании, соответствует результатам, полученным другими авторами [1–4]. К сожалению, корректно сопоставить цифровые значения не представляется возможным, так как в приведенных работах использовали разные биомодели. Представляется также важным изучить данные с более отдаленными результатами и провести исследование с различными по составу мембранами.

ВЫВОДЫ

Оба исследуемых материала (коллагеновые мембраны Ortokeep и Chondro-Gide) показали отличные результаты в регенерации полнослойного дефекта хряща. В обеих группах были получены практически идентичные макро- и микроскопические результаты. Однако более детальный анализ данных гистологического исследования выявил следующие особенности: 1) в обеих группах зона имплантации коллагеновых мембран была представлена волокнистой соединительной тканью с включениями хондроцитов; 2) коллагеновые мембраны в месте дефекта создавали более благоприятные условия для репаративных процессов, что подтверждается самыми короткими сроками закрытия дефекта собственной соединительной тканью; 3) созревание соединительной ткани протекало в более короткие сроки; 4) в зоне имплантации мембран хондрогенез протекал по «рассыпному» типу — в сформированной грубоволокнистой соединительной ткани появлялись «островки» гиалинового хряща, которые выявлялись уже на 3 месяце эксперимента, первоначально располагались на удалении друг от друга, но имели тенденцию к слиянию между собой в последующие сроки вывода из эксперимента; процессы неохондрогенеза протекали не только на границе со здоровой тканью, но и в толще соединительно-тканной мозоли; 5) эффективность применения коллагеновых мембран подтверждают цифровые значения объема костной и хрящевой тканей.