Сетчатка является наиболее доступным для изучения отделом нервной системы и одной из самых уязвимых сенсорных тканей. Подобные свойства актуализировали изучение офтальмологических коррелятов неврологических заболеваний, открывая возможности для улучшения диагностики и изучения нейродегенеративных процессов. За счет эмбриональной общности и схожести протеомного состава сетчатка может выступать платформой для развития тех же патологических каскадов, что и центральная нервная система [1]. В частности, повреждение сетчатки было обнаружено при боковом амиотрофическом склерозе (БАС) [2, 3], заболеваниии, для которого характерна прогрессирующая гибель мотонейронов вследствие накопления нерастворимых белковых агрегатов [4].

Белковые включения при БАС имеют сложный состав и могут состоять из различных белков, среди которых чаще всего обнаруживают РНК-связывающие белки или антиоксидантный фермент супероксиддисмутазу 1, а также другие компоненты: нейрофиламенты, убиквитин [5]. В 5% семейных случаев БАС ассоциирован с накоплением агрегатов, основным компонентом которых является белок FUS. Одна из причин развития FUS-протеинопатии — мутации в домене сигнала ядерной локализации (NLS) и выход белка из ядра в цитоплазму, где он приобретает способность к формированию нерастворимых агрегатов [6].

Цель данного исследования — оценить взаимосвязь между нейрональной экспрессией патологической формы белка FUS и активацией некоторых патологических путей в сетчатке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные

В качестве модельного объекта FUS-протеинопатии были использованы мыши, несущие трансген аберрантного человеческого гена FUS c искусственно укороченным NLS (кодирует укороченный FUS[1-359]) [7]. Данная модель характеризуется манифестирующей в возрасте 3–4 месяцев клинической картиной БАС, которая сопровождается развитием морфологических и молекулярных признаков нейродегенерации, включая гибель нейронов и нейровоспаление [8].

Исследование проводили на 25 мышах (обоего пола) линии CD-1, 12 из которых были гемизиготами FUS, а 13 служили контролем дикого типа. Мышей содержали в условиях постоянного доступа к воде и корму. Световой цикл — 12 ч/12 ч, интенсивность освещения — 40–50 лк, температура воздуха — 23 ± 1 °С, влажность — 42 ± 5%. В возрасте 80–90 дней мышей седатировали (золазепам + тилетамин + ксилазин) для проведения офтальмоскопии. Перед седацией проводили клинический осмотр для исключения животных с признаками воспалительных изменений наружной камеры глаза.

Офтальмоскопическое исследование проводили после аппликации 1%-го атропина сульфата. Для объективизации анализа офтальмолог оценивал картину глазного дна по балльной шкале от 0 до 5, где 0 баллов — отсутствие нарушений, а 5 баллов — грубые аномалии. Данные офтальмоскопического анализа представлены в виде M ± SD, проверку статистической значимости межгрупповых различий проводили по критерию Краскелла–Уоллиса. После офтальмоскопического исследования животных эвтаназировали передозировкой наркоза и отбирали биоматериал для молекулярного анализа: у 6 животных из каждой группы извлекали образцы сетчатки для изучения генной экспрессии, а у 4 собирали образцы сетчаток и люмбального отдела спинного мозга для проведения вестерн-блотинга.

Количественная ПЦР

Ткани контрлатеральных сетчаток от каждого животного пуллировали и инкубировали 15 мин в растворе ExtractRNA («Евроген»; Россия). После лизирования образца в реагенте его подвергали хлороформной экстракции, а образовавшийся осадок РНК промывали последовательно изопропиловым спиртом и 70%-ным этиловым спиртом. Полученный осадок разбавляли в 20 мкл воды и с использованием спектрофотометра IMPLENNanoPhotometer® (Implen; Германия) измеряли концентрацию полученной РНК (~200 нг/мкл). Обратную транскрипцию проводили с использованием набора MMLVRTSK021 в соответствии с протоколом фирмыпроизводителя (Евроген; Россия).

Праймеры для количественной ПЦР подбирали с использованием ресурса Primer-BLAST (NCBI) с соблюдением ряда условий: 1) температура плавления 59–61 °C; 2) один из праймеров в паре должен отжигаться на область межэкзонного соединения; 3) прямой и обратный праймеры не должны образовывать ауто- и кроссдимеров в одной смеси; 4) размер ПЦР-продукта должен быть от 95 до 200 п.н.; праймеры должны быть специфичны к максимальному количеству транскриптов гена.

Затем в амплификаторе BioRad CFX96 проводили ПЦР образцов с использованием интеркалирующего красителя SYBR® Green Master Mix (Bio-Rad Laboratories, Inc.; США) и олигонуклеотидных праймеров («Евроген»; Россия) (таблица). Уровень экспрессии генов интереса (GOI) оценивали относительно генов домашнего хозяйства (HKG) Gapdh и Actb. Расчет экспрессии в конкретной точке производился по формуле: Экспрессия гена = 2^[(Ct(HKG)-Ct(GOI)].

Иммуноблотинг

Образцы сетчатки пуллировали от двух животных, принадлежащих к одной группе.

После разделения в геле белки переносили методом полусухого электроблотинга на поливинилденфторидную мембрану Hybond-P (Cytiva; Великобритания), предварительно обработанную 100%-м метанолом, промытую водой MilliQ и замоченную в буфере для переноса, содержащем 25 мМ Трис, 0,15 мM глицина, 20% метанола. Помещали гель с плотно прижатой мембраной между двумя листами бумаги Wathman 3 ММ, смоченной в буфере для переноса, в аппарат для полусухого блотинга (GE Healthcare Amersham; США) и переносили белки на мембрану в течение 30 мин при токе 50 мА (1,2 мА на 1 см²). После электроблотинга промывали мембрану в

Трис-Твин-буфере (ТТБ; 50 мM Трис-HCl pH 7,4, 150 мМ NaCl, 0,1% Твин-20) 3 раза по 5 мин. Блокировали мембрану в 4%-м растворе обезжиренного сухого молока в ТТБ 1 ч при комнатной температуре, затем инкубировали с первичными антителами в том же растворе при 4 °C в течение ночи. После инкубации с первичными антителами промывали мембрану в ТТБ 3 раза по 5 мин и инкубировали с вторичными антителами 1,5 ч при комнатной температуре. После инкубации мембрану отмывали в ТТБ 3 раза по 5 мин.

Детекцию специфичного связывания антител проводили с помощью реагентов ECL Plus (Cytiva; Великобритания) согласно инструкции производителя. Для детекции хемилюминесции использовали рентгеновскую пленку. Количественный анализ результатов иммуноблотинга проводили с помощью денситометрического анализа, c использованием прибора BioSpectrum AC Chemi HR410 и программного обеспечения Vision Works LS (UVP; Великобритания). При проведении денситометрического анализа специфический сигнал от анализируемого белка нормализовали по отношению к сигналу от β-актина (после реинкубации мембраны с соответствующими антителами) для каждой дорожки отдельно.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Трансгенные мыши FUS[1-359] демонстрируют умеренные офтальмоскопические аномалии

В обеих группах у части животных были обнаружены сосудистые аномалии и отечность диска зрительного нерва, что в целом характерно для мышей линии CD-1 [9, 10]. При статистическом анализе не выявлено достоверных различий между мутантными и дикотипными животными, однако у мышей FUS[1-359] отмечена тенденция к более выраженным нарушениям по всем исследуемым параметрам (рис. 1).

Аберрантный FUS не экспрессируется в сетчатке

Вестерн-блот-анализ не выявил наличие FUSиммунопозитивного сигнала в тканях сетчатки трансгенных мышей (рис. 2). Кроме того, при количественной ПЦР также не обнаружена экспрессия FUS на уровне мРНК. Таким образом, анализ экспрессии не подтвердил ретинальную экспрессию трансгена ни на транскриптомном, ни на белковом уровнях.

Трансгенные мыши FUS[1-359] характеризуются увеличенной экспрессией провоспалительных генов в сетчатке

При анализе ретинальной экспрессии таргетных генов было обнаружено, что в сетчатке трансгенных мышей FUS[1-359] происходит активация провоспалительных факторов Vegfa, Icam1, Il6, Il1b и Tnfa. Выраженных изменений экспрессии генов нейрорегенерации (Bdnf), аутофагии (Atg7, Atg5) и регуляции апоптоза (Bax, Bcl2) обнаружено не было (рис. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Вовлечение сетчатки в патологический процесс было обнаружено при большинстве дегенеративных заболеваний центральной нервной системы, включая болезнь Альцгеймера [11], болезнь Паркинсона [12, 13] и лобно-височную деменцию [14]. Закономерно, что офтальмологические аномалии слабой степени выраженности также являются частым немоторным симптомом БАС [15]. Среди типичных клинических находок описаны нарушение цветового зрения [16], а также истончение сетчатки [17] и желтого пятна [18–20].

В нашем исследовании мы не обнаружили статистически значимых различий в выраженности патологических изменений сетчатки у исследуемых животных. Тем не менее по всем исследуемым параметрам была выявлена однозначная тенденция к более выраженным нарушениям у трансгенных мышей FUS[1-359]. Особенно яркие различия были обнаружены в отношении артериальной сети, что согласуется с результатами других исследователей [21].

Поскольку иммуноблотинг и количественная ПЦР показали, что трансген не экспрессируется в сетчатке, мы решили выяснить механизмы дегенерации сетчатки с помощью изучения активности наиболее общих молекулярных путей нейродегенеративного повреждения мотонейронов. В связи с этим в качестве основных таргетных мишеней мы выбрали гены, регулирующие воспаление, апотоз и аутофагию. Несмотря на то что вовлеченность путей аутофагии [22–24] и апоптоза [25] при БАС была подтверждена в исследованиях in vivo и in vitro, мы не нашли значимого отклонения в экспрессии генов Atg7, Atg5, Bax, Bcl2. Однако среди выбранных мишеней, была выраженно изменена экспрессия генов Vegfa, Icam1, Il6, Il1b и Tnfa, что указывает на роль воспаления в механизмах ретинальной дегенерации у мышей FUS[1-359]. Эти данные согласуются с предыдущими результатами, касающимися драматической роли воспалительной активации (и ее фармакологического подавления) в мышиной модели

FUS[1-359] [26, 27].

Таким образом, несмотря на отсутствие ретинальной экспрессии аберрантной формы белка FUS, трансгенные животные имеют признаки дегенеративных изменений сетчатки. Среди потенциальных механизмов повреждения заднего отрезка глаза можно выделить активацию микроглии [28], сосудистую регрессию [20], нейрофтальмологические взаимодействия через глимфатическую систему [29].

ВЫВОДЫ

Проведенное исследование продемонстрировало, что трансгенные мыши FUS[1-359] склонны к развитию структурных и функциональных аномалий глазного дна, несмотря на отсутствие экспрессии трансгена в сетчатке. Дальнейшие исследования природы выявленных нарушений могут актуализировать наиболее значимые механизмы FUS-ассоциированной ретинопатии.