Chaetopterus variopedatus (Renier) относится к семейству Chaetopteridae, одному из наиболее дифференцированных среди морских полихет, ведущих на взрослой стадии развития бентосный образ жизни, за исключением необычного пелагического вида C. pugaporcinus (Osborn) [1]. Разные исследователи описывают C. variopedatus как видовой комплекс, состоящий из нескольких отдельных популяций-подвидов [2–4]. C. variopedatus — космополит, обитает в умеренных и тропических регионах по всему миру. Разные подвиды C. variopedatus встречаются в прибрежных районах России, Японии, Австралии, Бразилии, Европы и США [5]. Несколько лет назад филогенетические отношения в семействе Chaetopteridae были пересмотрены [1, 6], однако для C. variopedatus sensu lato (Hartman) до сих пор нет полной ясности в этом вопросе.

C. variopedatus живет, прячась в построенной самостоятельно погруженной в грунт U-образной пергаментной трубке. У него сегментированное тело с парными конечностями — параподиями. В ответ на агрессивное воздействие извне C. variopedatus выпускает облако светящейся голубым светом (с максимумом на 460 нм) слизи [7]. При этом также ярко светятся параподии всех сегментов тела червя. Это явление издавна привлекало внимание любопытных наблюдателей, о чем свидетельствуют многочисленные публикации. Многие исследователи на протяжении последних 70 лет пытались понять биохимические аспекты процесса свечения C. variopedatus [8–10]. Однако результаты довольно противоречивы, и на сегодняшний день по-прежнему не ясно, как именно работает биолюминесцентная система этих полихет.

Ранее мы писали, что из биомассы C. variopedatus, собранной в проливе Сан-Себастьян побережья Бразилии, за несколько этапов очистки был получен препарат люциферазы, с которым воспроизведена характерная биолюминесцентная реакция in vitro. Для этого к препарату добавляли спиртовый экстракт C. variopedatus, содержащий основной субстрат (люциферин) и ионы двухвалентного железа [11].

Мы предположили, что люцифераза C. variopedatus может быть использована для детекции ферроптоза [12] — недавно открытого пути программируемой клеточной гибели, вызванной накоплением ионов двухвалентного железа [13]. Изучение ферроптоза важно как для фундаментальной науки, так и для прикладных биомедицинских разработок. Показано, что процессы, похожие на ферроптоз, имеют место при некоторых нейродегенеративных заболеваниях [14]. Кроме того, индукторы ферроптоза представляют собой перспективные противоопухолевые препараты [15].

Таким образом, детальная характеристика и расшифровка биолюминесцентной системы C. variopedatus является актуальной научной задачей. Целью исследования было выделить и охарактеризовать люциферазы C. variopedatus, а также сравнить люциферазы C. variopedatus из разных популяций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сбор биомассы C. variopedatus

Вылов C. variopedatus производили в двух местах: проливе Сан-Себастьян побережья Бразилии и бухте Троицы залива Посьета Японского моря. Особей извлекали из домиков и немедленно замораживали в жидком азоте.

Транспортировку замороженных полихет осуществляли на сухом льду, а хранение — при температуре –70 °С.

Для получения светящейся слизи червей извлекали из домика, помещали в морскую воду и механически стимулировали в темноте. Светящуюся слизь собирали пипеткой и замораживали в жидком азоте.

Выделение люциферазы

100 г замороженной биомассы C. variopedatus гомогенизировали в 900 мл 50 мМ Трис-буфера, рН 7,5. Гомогенат обрабатывали ультразвуком с помощью ультразвукового гомогенизатора Ultrasonic Disintegrator UD-20 (Techpan; Польша) 5 раз по 2 мин на льду, а затем центрифугировали (25 000 g  х  20 мин) при 4 °С. К супернатанту добавляли сульфат аммония до конечной концентрации 500 мМ и пропускали через колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (Cellulose DEAE-32, Serva; Германия), уравновешенную 500 мМ сульфатом аммония. Полученный фильтрат наносили на колонку 25 х 100 мм Phenyl Sepharose CL-4B (Cytiva; США), уравновешенную 500 мМ сульфата аммония. Люциферазу элюировали 5 мМ Трис-HCl буфером, рН 7,5.

Фракции с люциферазной активностью объединяли и наносили на колонку 16 х 200 мм  Sepharose DEAE FF (Cytiva; США), уравновешенную 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5; промывали этим же буфером и элюировали линейным градиентом. Буфер А — 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, буфер Б — 500 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5. Скорость потока — 4 мл/мин, время градиента — 25 мин.

Полученный препарат концентрировали на ячейке 10 кДа (Amicon; Ирландия) и наносили на колонку 26 х 400 мм с сорбентом Sephacryl S200 (Cytiva; США), уравновешенную 200 мМ NaCl с 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5. Элюцию проводили этим же буфером со скоростью 1,5 мл/мин. К объединенным фракциям с люциферазной активностью добавляли сульфат аммония до конечной концентрации 500 мМ и наносили полученный раствор на колонку 5 × 90 мм с сорбентом С8 (Cytiva; США). Элюцию проводили линейным градиентом. Буфер А — 500 мМ сульфата аммония, 5 мМ Трис-HCl, рН 7,5, буфер Б — 5 мМ Трис-HCl, рН 7,5. Скорость потока — 0,5 мл/мин, время градиента — 80 мин.

Полученный препарат люциферазы разводили в два раза дистиллированной водой и наносили на колонку 3 х 50 мм с сорбентом monoQ (Cytiva; США), уравновешенную 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, промывали тем же буфером и элюировали линейным градиентом. Буфер А — 20 мМ Трис-HCl рН 7,5, буфер Б — 500 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5. Скорость потока — 0,5 мл/мин, время градиента — 80 мин.

Препарат концентрировали на центрифужном фильтре 10 кДа (Amicon; Ирландия) до 200 мкл, затем проводили гель-фильтрацию на колонке 10 х 300 мм Superdex 200 (Cytiva; США), уравновешенной 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, pH 7,5. Элюцию проводили этим же буфером со скоростью 0,8 мл/мин.

Люциферазу из светящейся слизи (10 мл) выделяли аналогичным образом. Измерение активности люциферазы проводили по ранее разработанному протоколу [11].

Для определения видовой специфичности имеющихся образцов Chaetopterus использовали праймеры HC02198 (5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3') и LCO1490 (5'-TCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'). Была выделена ДНК каждого из образцов замороженных тканей

C. variopedatus — для этого использовали набор реактивов ExtractDNA Blood & Cells («Евроген»; Россия). После этого с помощью указанных праймеров амплифицировали последовательности фрагмента гена COI длиной 650 п.н., используя в качестве матрицы ДНК каждого из образцов замороженных тканей. Полученные продукты ПЦР были секвенированы по Сенгеру.

Масс-спектрометрический анализ препаратов очищенных люцифераз бразильских и дальневосточных C. variopedatus проводили на масс-спектрометре Q Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific; США), сопряженном с хроматографом Ultimate 3000 Nano LC System (Thermo Fisher Scientific; США), посредством наноэлектроспрейного источника ионизации (Thermo Fisher Scientific; США). При масс-спектрометрическом анализе использовали следующие параметры: разрешение — 140 000, диапазон сканирования — 500–2000 m/z, уровень AGC — 3 × 10⁶, максимальное время инжекции ионов — 30 мсек. Полученные первичные данные визуализировали при помощи программы XCalibur (Thermo Fisher Scientific; США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Применение анионообменной хроматографии высокого разрешения привело к разделению целевого препарата на две практически гомогенные люциферазы: L1 с временем удержания 21,5 мин и L2 с временем удержания 46 мин (рис. 1). Их нативные молекулярные массы, рассчитанные по результатам гель-фильтрации, составили 70 кДа и 60 кДа соответственно (рис. 2).

В денатурирующих условиях SDS-фореза люцифераза L1 состоит из моносубъединиц, примерно по 18 кДа каждая, а L2 — как минимум из двух разных субъединиц массой около 18 и 15 кДа (рис. 3).

Присутствие в одном животном двух разных люцифераз может свидетельствовать о их различном происхождении или об особенностях функционирования [16, 17]. Хотя люминесценция C. variopedatus одноцветная (синяя), вероятно, каждая из его люцифераз функционирует локально: например, одна определяет свечение параподий, другая — свечение слизи, выделяемой червем во внешнюю среду.

Для проверки этой гипотезы использовали образец слизи, собранной и отдельно замороженной при ловле бразильских C. variopedatus. Хроматографический анализ препарата, очищенного по приведенной выше методике, показал присутствие только одной люциферазы, причем время ее удержания на колонке monoQ (45,5 мин) практически совпало с таковым для L1, выделенной ранее из тотальной биомассы червя (см. рис. 1). Отдельных образцов параподий бразильских полихет не было, а количества полученных препаратов L1 и L2 оказалось недостаточно для их сиквенса. Поэтому авторы обратились к более близкому источнику таких червей — дальневосточному побережью России.

Полихеты, выловленные в бухте Троицы залива Посьета Японского моря, изначально были определены как C. variopedatus по морфологическим признакам и доставлены в лабораторию живыми. Для более точного определения видовой специфичности имеющихся Chaetopterus авторы секвенировали фрагмент гена первой субъединицы цитохром С оксидазы (COI) длиной 650 п. н. Анализ последовательностей по базе данных GenBank показал, что фрагменты COI бразильского и дальневосточного образцов с высокой степенью гомологии (более 99%) принадлежат двум разным подвидам: C. variopedatus (AM503096.1) и C. cautus Marenzeller (LC533809.1) соответственно. В настоящее время они объединены в один видовой комплекс С. variopedatus [6].

В процессе сбора дальневосточных полихет выделяемую ими слизь замораживали отдельно. После размораживания в лаборатории не удалось зарегистрировать ее люминесценцию. Порции свежей слизи, полученные в ответ на механическую и химическую стимуляцию живых червей, тоже не светились. Добавка люциферина и двухвалентного железа к образцам слизи также не приводила к светоизлучению. Попытки выделить из образцов слизи какую-либо люциферазу по приведенной выше методике успехом не увенчались.

С регистрацией свечения параподий дальневосточных полихет проблем не возникло. Из них удалось выделить высокоочищенную люциферазу L(FE) с нативной молекулярной массой 65 кДа (см. рис. 2). Время удержания этой люциферазы на колонке monoQ — 45,5 мин, что практически совпадает с таковым для люциферазы L2 (см. рис. 1). На денатурирующем SDS-форезе видно, что L(FE), как и L2 бразильских полихет, состоит из двух различных субъединиц. Молекулярные массы субъединиц этих белков тоже близки (см. рис. 3).

Проведен масс-спектрометрический анализ препаратов очищенных люцифераз бразильских и дальневосточных Chaetopterus. Результаты, соотношение масса/заряд (m/z), заряд (z) и рассчитанная молекулярная масса (m) представлены в таблице (таблица).

Препараты люцифераз L2(Br) и L(FE) существенно более гетерогенны, чем препарат L1(Br), что, по-видимому, объясняется посттрансляционными модификациями и отщеплением концевых аминокислот. Наборы масс, полученные для L2(Br) и L(FE), практически идентичны, что говорит о сходстве самих ферментов, и значительно отличаются от такового для L1(Br).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Биолюминесцентные системы широко применяют в различных биомедицинских технологиях [18, 19]. Одним из важных направлений является люминесцентный биоимиджинг — прижизненная визуализация клеток и внутриклеточных процессов [20]. В случае успешной расшифровки люцифераза C. variopedatus предположительно может быть использована для создания сенсора ферроптоза [12]. Мы оптимизировали ранее разработанную [11] методику выделения люциферазы C. variopedatus, что позволило получить практически чистый препарат, пригодный для массспектрометрического анализа.

Изначально для исследования использовали C. variopedatus, выловленных в Бразилии, однако из-за логистических проблем стали использовать C. variopedatus, выловленных в Приморском крае России. Интересно, что в отличие от бразильских, дальневосточные C. Variopedatus не секретировали светящуюся слизь. В бразильских C. variopedatus были обнаружены две различных изоформы люциферазы (L1 и L2), тогда как в дальневосточных была обнаружена одна (L). Масс-спектрометрический и хроматографический анализ показал, что L2 и L обладают существенным сходством и отличаются от L1. По-видимому, функцию свечения параподий полихет C. variopedatus обеспечивает люцифераза L2 (L), поскольку она обнаружена в общей биомассе бразильских полихет и в параподиях дальневосточных полихет. Свечение слизи бразильских C. variopedatus обусловлено функционированием люциферазы L1, которая отсутствует в слизи дальневосточного подвида.

ВЫВОДЫ

На основании полученных результатов можно сделать следующие выводы: 1) функцию свечения параподий полихет C. variopedatus обеспечивает люцифераза L2, так как она обнаружена в общей биомассе бразильских полихет как L2(Br) и в параподиях дальневосточных полихет как идентичная ей L(FE); 2) свечение слизи бразильских C. variopedatus обусловлено функционированием люциферазы L1, которая отсутствует в слизи дальневосточного подвида; 3) набор изоформ люцифераз полихет C. variopedatus зависит от места их обитания.