Микробиота эякулята остается малоисследованной частью микробиома человека, несмотря на серьезный интерес к данному биоматериалу в контексте борьбы с бесплодием и возможности современных молекулярных технологий [1]. Мужской фактор является причиной бесплодия у половины пар [2], однако причина инфертильности у мужчин часто остается неустановленной [3]. Наличием инфекции удается объяснить до 6–10% случаев мужского бесплодия [4]. Было показано, что некоторые бактерии могут оказывать прямое повреждающее действие на сперматозоиды, снижая их подвижность и жизнеспособность [5].

Использование молекулярно-генетических методов, прежде всего NGS, позволило установить присутствие сложных  бактериальных сообществ не только в эякуляте пациентов с инфекционно-воспалительными процессами, но и у здоровых мужчин с нормозооспермией [1, 6–10]. Часть обнаруживаемых микроорганизмов (МО) являлись трудно- или некультивируемыми (включая облигатно анаэробных бактерий) [8, 10, 11], чем можно объяснить получение большего количества положительных образцов, чем при использовании культурального исследования. Однако обнаружение МО в семенной жидкости пациентов с нормозооспермией заставило отказаться от представлений о бактериоспермии как маркере исключительно патологического состояния [6, 7, 9]. Вместо этого были выдвинуты осторожные предположения о наличии взаимосвязи состава микробиоты эякулята и отклонений в спермограмме [6, 9].

Результаты немногочисленных исследований микробиоты эякулята от пациентов с нормозооспермией были получены на ограниченном числе образцов, что не позволило сформулировать четкие представления о норме для данного биологического материала [1]. Кроме того, использованный в этих исследованиях метод NGSсеквенирования имеет ряд объективных недостатков, препятствующих его внедрению в практическое здравоохранение: высокую стоимость и трудоемкость, сложность стандартизации процедуры и интерпретации полученных результатов.

С практической точки зрения более перспективен для рутинного исследования микробиоты эякулята другой молекулярно-генетический метод — ПЦР с детекцией результатов в реальном времени (ПЦР-РВ). Появление зарегистрированного теста для оценки микробиоты урогенитального тракта у мужчин  открыло новые возможности для выявления в эякуляте широкого спектра патогенных и условно-патогенных МО, включая трудно и некультивируемые бактерии, а также Lactobacillus spp. [12, 13], которые традиционно считают обитателями женского репродуктивного тракта. Доступность этого инструмента ставит вопрос о корректной интерпретации полученных с его помощью результатов. Присутствие множества групп бактерий в различных комбинациях и количествах потребовало обращения к методам математического моделирования для выявления закономерностей формирования микробиоты эякулята. Применение кластерного анализа позволило свести все многообразие выявленных сочетаний МО к четырем устойчивым типам микробных сообществ, отличающихся преобладанием разных групп бактерий [12]. Для понимания клинической значимости обнаружения различных вариантов микробиоты необходим анализ частоты их выявления и особенностей микробного состава в образцах, соответствующих критериям нормозооспермии и имеющих признаки патологии.

Целью исследования стало определение устойчивых вариантов микробиоты, исследованной методом ПЦР-РВ, в образцах эякулята с нормозооспермией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Группы обследованных пациентов

В исследование включили 227 образцов эякулята с нормозооспермией, полученные от мужчин (возраст — 20–59, средний возраст — 33 ± 4,7 года), которые в период с января 2019 г. по март 2020 г. обратились в Медицинский центр «Гармония» (г. Екатеринбург, n = 142) и в урологическую клинику Ивановской государственной медицинской академии (г. Иваново, n = 85) для прегравидарной подготовки.

Критерии включения пациентов в исследование: отсутствие приема антибактериальных и гормональных препаратов в течение последних четырех недель, нормозооспермия по результатам исследования спермограмм.

Критерии исключения из исследования: наличие гипо- и гипергонадотропного гипогонадизма, сахарного диабета 1-го и 2-го типов, гипо- и гипертиреоза; наличие инфекций, передающихся половым путем (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma genitalium, Trichomonas vaginalis); клинические проявления простатита; наличие аномалий кариотипа, мутаций в гене CFTR, микроделеций в AZF-локусе Y-хромосомы.

У всех  пациентов были получены образцы эякулята в соответствии с ниже описанными правилами, проведена оценка параметров спермограммы и состава микробиоты эякулята.

Техника получения эякулята

Подготовку пациентов и отбор материала проводили в соответствии с рекомендациями ВОЗ по сбору эякулята для микробиологических исследований (пункт 2.2.4 Руководства ВОЗ). Обязательным условием было половое воздержание в течение 2–5 дней. Сбор эякулята осуществляли путем мастурбации в стерильный контейнер после предварительного мочеиспускания и туалета наружных половых органов [14]. 

Оценка параметров спермограммы

Анализ эякулята проводили после 30–60-минутного разжижения материала, подсчет количества (концентрации) и подвижности сперматозоидов — с помощью сперманализатора Biola SCA («Биола»; Россия). Морфологию сперматозоидов оценивали в окрашенных препаратах при увеличении микроскопа ×1000 с помощью диагностического набора «Spermac Stain» (Ferti Pro; Бельгия).

Полученные данные интерпретировали в соответствии с критериями ВОЗ [14]. 

Выделение ДНК

Для выделения ДНК использовали набор ПРОБА-НКПЛЮС  («ДНК-Технология»; Россия). Образцы эякулята подвергали предварительной обработке по следующей методике: 1,0 мл эякулята помещали в пробирку Эппендорф с 1,0 мл транспортной среды («Транспортная среда с муколитиком»; «ИнтерЛабСервис», Россия), встряхивали на приборе «Vortex» до полного перемешивания. Пробирку центрифугировали при 13 000 об./мин в течение 10 мин на центрифуге Mini-Spin (Eppendorf; Германия). После удаления надосадочной жидкости 50 мкл осадка использовали для последующего выделения ДНК. Оценка микробиоты эякулята

Исследование проводили с использованием набора реагентов «Андрофлор» в детектирующем амплификаторе ДТпрайм (все производства «ДНК-Технология»; Россия) согласно инструкции производителя. После реакции амплификации по показателю индикаторного цикла с помощью специального программного обеспечения проводили автоматический расчет количества общей бактериальной массы (ОБМ), лактобацилл и каждого из условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) в представленном образце (выражали в геномэквивалентах на мл (ГЭ/мл)). Спектр МО, определяемых набором, представлен следующими группами: грамположительные факультативно-анаэробные МО

(Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Corynebacterium spp.); грамотрицательные факультативно-анаэробные МО (Haemophilus spp., Pseudomonas aeruginosa / Ralstonia spp./ Burkholderia spp.); группа Enterobacteriaceae / Enterococcus spp.; облигатно-анаэробные микроорганизмы (Gardnerella vaginalis, Eubacterium spp., Sneathia spp. / Leptotrichia spp. / Fusobacterium spp., Megasphaera spp./Veillonella spp. / Dialister spp., Bacteroides spp. / Porphyromonas spp. / Prevotella spp., Anaerococcus spp., Peptostreptococcus spp. / Parvimonas spp., Atopobium cluster); микоплазмы (Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum); группа Lactobacillus spp.; грибы рода Candida.

В качестве отрицательного контрольного образца (ОКО) использовали стерильную деионизированную воду. В ОКО положительные сигналы по некоторым группам МО в ПЦР-РВ фиксировали не ранее 35 цикла амплификации (что соответствовало микробной нагрузке менее 10³ ГЭ/мл). На основании этого значимым считали количество МО не менее 10³ ГЭ/мл, что соответствовало положительному сигналу в ПЦР-РВ до 35 цикла. Исключение составляли U. urealyticum, U. parvum, M. hominis, по которым положительный сигнал в ОКО отсутствовал. При получении сигнала на любом цикле амплификации результат ПЦРРВ по этим группам МО расценивали как положительный. Грибы рода Candida в данном исследовании не учитывали.

Статистические методы

Анализ структурных особенностей микробиоты эякулята проводили с использованием модели кластеризации MSSC, минимизирующей сумму по всем кластерам внутрикластерных сумм квадратов расстояний от элементов кластеров до их центроидов [15]. Решение задачи кластеризации проводили с использованием алгоритма k-means++ [16], реализованного в библиотеке машинного обучения scikit-learn. Выбор оптимальной кластеризации проводили на основе внутренних оценок качества кластеризации: индекса силуэта [17] и индекса Дэвиса–Болдина [18].

Для запуска алгоритма кластеризации k-means++ каждый исследуемый образец был представлен в виде вектора (p, s) Є R⁵⁰ состоящего из вектора первичных признаков p Є R¹⁹, взятых из данных  исследований микробиоты эякулята методом ПЦР-РВ, и вектора вторичных признаков s Є R³¹, рассчитываемых на основе первичных признаков.

Первичными признаками являлись абсолютные значения показателей, определяемых тестом Андрофлор (ОБМ и 18 групп МО).

На основе первичных признаков рассчитывали следующие вторичные признаки: скорректированную ОБМ (СОБМ), равную суммарной массе 18 определяемых групп МО; массовые доли МО по отношению к СОБМ; массы укрупненных в соответствии с компоновкой теста Андрофлор групп МО: Lactobacillus spp., грамположительных факультативных анаэробов (ГПФА), облигатных анаэробов (ОА), грамотрицательных факультативных анаэробов (ГОФА), Enterobacteriaceae spp. / Enterococcus spp. (ЕЕ) и микоплазм; массовые доли укрупненных групп МО по отношению к СОБМ.

Для оптимальной кластеризации исследовали устойчивость кластеров к изменению размера выборки. С этой целью кластеризовали случайные подвыборки объемом от 1 до 100% от исходной выборки и рассчитывали индекс устойчивости кластеров по следующей формуле:

формула

где 1_{true}: {true, false} → {0, 1} — индикаторная функция логического аргумента; A(x), A`(x) — метка кластера наблюдения x, полученного в результате кластеризации на основе исходного набора данных и подвыборки, соответственно; k = {1,2,3,4}, l = {1,2,3,4} — метки кластеров.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактериальная ДНК (ОБМ) отсутствовала или определена в количестве менее 10³ ГЭ/мл в 81 (35,7%) образце эякулята. В 39 (17,1%) образцах ОБМ составила более 10³ ГЭ/мл, однако число всех определяемых групп МО было ниже установленного порога.

В 107 (47,1%) из 227 образцах ОБМ составляла не менее 10³ ГЭ/мл (медиана — 10^3,8, межквартильный размах — 10^3,5–10^4,4 ГЭ/мл) и одновременно выявлено от 1 до 14 групп МО в надпороговых значениях. Частота встречаемости отдельных групп МО в надпороговых значениях представлена в табл. 1.

Разные группы МО присутствовали во множестве ассоциаций друг с другом. Поэтому было принято решение провести кластерный анализ с целью определения характерных для эякулята микробных сообществ.

Кластерный анализ микробиоты эякулята

Для проведения кластерного анализа отобрали 107 проб, отвечающие следующим критериям: ОБМ не менее 10³ ГЭ/мл, как минимум одна группа МО не менее 10³ ГЭ/мл.

Определение оптимального количества кластеров в исследуемом наборе данных проводили на основе значений индексов силуэта и Дэвиса–Болдина (табл. 2). Наилучшему качеству кластеризации соответствуют наибольшее значение индекса силуэта и наименьшее значение индекса Дэвиса–Болдина. В соответствии с полученными значениями индексов оптимальным было выделение 4, 9 или 10 кластеров. Однако при проверке устойчивости кластеры, полученные в результате 9- и 10-кластеризации, демонстрировали меньшую устойчивость в сравнении с таковыми, полученными в результате 4-кластеризации.

На основании этого было принято решение выделять 4 основных кластера микробиоты эякулята.

Каждый из полученных кластеров отличался преобладанием определенной укрупненной группы МО. На рис. 1 представлены диаграммы размаха признаков объектов, попавших в соответствующий кластер. 

Кластер 1 — вариант с преобладанием ОА. СОБМ составила 10^4,3 ГЭ/мл в центроиде. Абсолютное количество всех ОА было сопоставимо с СОБМ и составило в центроиде 10^4,2 ГЭ/мл (рис. 1А). Доля ОА в центроиде достигала 81,1% относительно СОБМ. Выделить преобладающую группу ОА из числа определяемых с помощью теста не удалось: как правило, в образцах присутствовало сразу несколько групп ОА одновременно. Данный вариант микробиоты определили в 43 (40,2%) из 107 образцов.

Кластер 2 — вариант с преобладанием Lactobacillus spp, выявили в 22 (20,6%) из 107 образцов. СОБМ составила 10^4,0 ГЭ/мл в центроиде. Абсолютное количество Lactobacillus spp. было ниже количества СОБМ и в центроиде и составило 10^3,5 ГЭ/мл (рис. 1Б). Доля Lactobacillus spp. в центроиде — 64,3% относительно СОБМ. Одновременно с Lactobacillus spp. присутствовали представители ОА, ГПФА и ГОФА.

Кластер 3 — вариант с преобладанием ГПФА. СОБМ составила 10^3,7 ГЭ/мл в центроиде. В образцах, отнесенных к данному кластеру, абсолютное количество ГПФА было сопоставимо с СОБМ и составило в центроиде 10^3,7 ГЭ/мл (рис. 1В). Доля ГПФА в центроиде достигала 92,5% относительно СОБМ. Данный кластер у пациентов с нормозооспермией чаще формировался вокруг

Corynebacterium spp. и Streptococcus spp. Этот вариант микробиоты эякулята идентифицировали в 27 (25,2%) из 107 образцов.

Кластер 4 — вариант с преобладанием группы ЕЕ. СОБМ составила 10^4,2 ГЭ/мл в центроиде. Абсолютное количество всех ЕЕ было сопоставимо с СОБМ и составило в центроиде 10^4,1 ГЭ/мл (рис. 1Г). Доля ЕЕ в центроиде — 80,8% относительно СОБМ. Данный вариант микробиоты эякулята определили в 15 (14,0%) из 107 образцов.

Анализ устойчивости микробных кластеров

Для исследования устойчивости выделенных кластеров генерировали подвыборки объемом 1–100% от исходной выборки (1000 случайных подвыборок без возврата на каждое значение объема).

На рис. 2 представлены графики устойчивости кластеров, полученных на основе 4-кластеризации микробиоты образцов эякулята, соответствовавших критериям нормозооспермии. Наиболее устойчивыми оказались кластеры с преобладанием ГПФА (кластер 3; рис. 2В) и преобладанием EE (кластер 4; рис. 2Г).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В ходе настоящего исследования микробную ДНК в надпороговых значениях (не менее 10³ ГЭ/мл) обнаружили в 146 (64,3%) из 227 образцов эякулята, отвечающих критериям нормозооспермии. В 81 (35,7%) образце бактериальная ДНК отсутствовала или определялась в количестве менее 10³ ГЭ/мл и вполне могла быть китомной ДНК (микробной ДНК, присутствующей в наборах реагентов) [19]. Полученные результаты согласуются с данными других исследователей, отмечавших присутствие МО в эякуляте мужчин с нормальными показателями спермограммы [1, 6–8, 20]. В 107 (47,1%) пробах с ОБМ не менее 10³ ГЭ/мл обнаружили до 14 групп МО в надпороговых значениях, что тоже согласуется с ранее полученными данными о наличии в семенной жидкости здоровых мужчин полимикробных ассоциаций [1, 8, 20].

Бактерии рода  Corynebacterium идентифицировали в 17,2% исследованных образцов — чаще, чем остальные группы МО. Streptococcus spp., Peptostreptococcus spp. / Parvimonas spp., Bacteroides spp. / Porphyromonas spp. / Prevotella spp., Lactobacillus spp., Enterobacteriaceae spp. / Enterococcus spp. присутствовали в 10,6–13,2% проб. Остальные исследованные группы МО были обнаружены в 3,5–9,7% проб. Одновременное выявление множества групп МО в различных сочетаниях делает невозможным интерпретацию полученных результатов без применения дополнительного математического анализа.

Положительные образцы в зависимости от преобладающей группы МО были сгруппированы в четыре кластера, аналогичные полученным при исследовании всех типов эякулята [21]: варианты с преобладанием ОА, Lactobacillus spp., ГПФА, EE. При этом последние два кластера более устойчивы, чем первые два. Примечательно, что выделенные исключительно математически кластеры образованы МО со схожими физиологическими свойствами. В частности три из четырех выделенных кластеров (с преобладанием ОА, ГПФА, EE) сформированы филогенетически гетерогенными МО с одинаковой потребностью в кислороде, что также было отмечено в других исследованиях [1]. По всей видимости, данный феномен обусловлен наличием различных экологических ниш для колонизирующих эякулят МО, что неудивительно, поскольку эякулят представляет собой смесь биоматериалов из разных отделов урогенитального тракта [6].

Большинство положительных проб (40,2%) было отнесено к кластеру с преобладанием ОА; их доля в центроиде достигала 81,1% от всех выявляемых МО. Микробиота в этих образцах отличалась значительной гетерогенностью в пределах группы ОА без доминирования какого-либо вида. Подобный кластер, состоящий из облигатно анаэробных бактерий, был выделен в работе авторов, исследовавших микробиоту эякулята методом NGS-секвенирования [1]. Стоит отметить, что при использовании рутинного культурального исследования образцов эякулята с преобладанием ОА последние как преобладающая группа МО были идентифицированы только в 15% случаев [12].

Четверть образцов (25,2%) были отнесены к кластеру с преобладанием  ГПФА. Именно этот вариант микробиоты ранее описывали как характерный для урогенитального тракта клинически здоровых мужчин [4]. В том числе в сперме мужчин без признаков инфекций, передающихся половым путем, культуральным методом обнаруживали бактерии родов Staphylococcus, Streptococcus и Corynebacterium (отнесенные к группе ГПФА) [22]. Однако факт выделения ГПФА из эякулята не всегда означает, что данная группа МО преобладает в данном биоматериале [12]. Применение современных молекулярно-генетических технологий позволяет также выявить трудно культивируемые и некультивируемые МО, что уточняет представление о вкладе данной группы МО в формирование микробиоты эякулята. 

Несколько меньшее число проб эякулята (20,6%) было отнесено к кластеру с преобладанием Lactobacillus spp. Роль бактерий рода Lactobacillus, основных представителей нормальной микробиоты женского репродуктивного тракта, в составе микробиоты эякулята не настолько очевидна. Одни авторы отмечают наличие лактобацилл в образцах эякулята при нормозооспермии и ассоциируют это с мужской фертильностью [8, 9]. Другие исследователи полагают, что повышенные количества Lactobacillus spp. в сперме являются маркером гормональных нарушений и основанием для дальнейшего расширенного обследования мужчины [23].

Кластер с преобладанием EE был самым малочисленным в исследованном нами пуле образцов; наличие данной микробиоты отметили только в 14,0% случаев. Представителей EE, в основном Escherichia coli и Enterococcus feacalis, принято считать частой причиной воспалительной патологии урогенитального тракта у мужчин [24]. Возможно, это обусловлено высокой частотой их выявления при культуральном исследовании. Например, при параллельном изучении образцов эякулята культуральным методом и методом ПЦР-РВ было показано, что почти в половине случаев, когда энтеробактерии и энтерококки культуральным методом определялись как преобладающие, с помощью ПЦР-РВ выявлялись другие преобладающие МО. Чаще всего это были ОА, что, по всей видимости, обусловлено сниженной способностью выделять анаэробов при культивировании in vitro [12]. Вклад E. coli и E. feacalis, как и других представителей группы EE, в нарушение фертильности и качества сперматозоидов окончательно не определен и требует дальнейшего изучения.

Настоящее исследование в очередной раз демонстрирует частое присутствие МО в образцах эякулята, отвечающих критериям нормозооспермии. Примечательно, что в большинстве исследованных проб микробиота была преимущественно представлена облигатно анаэробными бактериями, а не грамположительными факультативными анаэробами, которые обнаруживали при культуральном исследовании [22].

ВЫВОДЫ

В половине случаев образцы эякулята, соответствующие критериям нормозооспермии, содержали микробиоту в надпороговых значениях. Выделенные микроорганизмы были сгруппированы с помощью кластерного анализа в четыре устойчивых типа по критерию преобладания определенной группы микроорганизмов: облигатных анаэробов, Lactobacillus spp., грамположительных факультативных анаэробов, Enterobacteriaceae spp. / Enterococcus spp. Кластеры ранжированы по частоте встречаемости: вариант с преобладанием облигатных анаэробов, грамположительных факультативных анаэробов, Lactobacillus spp., Enterobacteriaceae spp. / Enterococcus spp. (определены в  40,2, 25,2, 20,6%, и 14,0% положительных образцов соответственно). По всей видимости, использование молекулярногенетических методов приведет к переосмыслению представлений о составе микробиоты, определяемой в  данном биоматериале при нормозооспермии. Вопрос ассоциации определенных вариантов микробиоты эякулята с воспалительной патологией репродуктивного тракта и нарушениями фертильности остается открытым. Не исключено, что существуют информативные микробиологические маркеры, ассоциированные с данными состояниями. Исследование микробного состава патологических образцов эякулята является следующим необходимым шагом для поиска таковых диагностических маркеров.