Производное глюкозамина и нитромочевины стрептозоцин (СТЗ) является алкилирующим агентом и вызывает повреждения ДНК, приводя к снижению пролиферативной активности и гибели клеток. Благодаря химическому сходству с глюкозой СТЗ имеет высокое сродство к транспортеру глюкозы (GLUT2),  избирательно захватывается β-клетками островков поджелудочной железы, что используют в терапии рака поджелудочной железы и при системном введении — для моделирования диабета у экспериментальных животных [1]. На клетках островков поджелудочной железы показано, что стрептозоцин приводит к разрывам ДНК и активации поли-(AДФ-рибоза)-полимераз (PARP), что в свою очередь вызывает снижение уровня НАД (выступающего в качестве субстрата для PARP)  и гибели клеток [2]. 

Интрацеребральное однократное введение СТЗ вызывает нейродегенеративные изменения. Предполагается, что СТЗ снижает локальный метаболизм глюкозы и энергетический обмен в мозге [3–5]. При внутрижелудочковом введении СТЗ происходят прогрессирующая гибель нейронов в гиппокампе и неокортексе, повреждение белого вещества мозга, дисфункция холинергической системы, что приводит к когнитивным нарушениям у животных [3]. Нейрохимические изменения, вызываемые СТЗ, включают накопление β-амилоида, гиперфосфорилование тау-белка и дисфункцию рецепторов инсулина [6–8]. Эти эффекты интрацеребрального введения СТЗ воспроизводят черты  спорадической болезни Альцгеймера (БА), и находятся в соответствии с гипотезой диабета 3-го типа, связывающей нейродегенерацию при БА и локальную инсулинрезистентность [9–11]. Вместе с тем, точный механизм действия СТЗ в мозге не изучен, а гипотезу о прямой необратимой десенситизации инсулиновых рецепторов под действием СТЗ критикуют некоторые авторы [5]. 

Предполагается, что одной из причин развития БА служит дизрегуляция систем гипоталамуса, вовлеченных в обеспечение энергетического гомеостаза. В нейровизуализационных исследованиях показаны изменения ядер гипоталамуса у пациентов с БА. По некоторым данным, инсулинрезистентность и диабет повышают риск развития БА [12]. Вместе с тем, патоморфологические изменения клеточных популяций гипоталамуса на стрептозоциновой модели БА охарактеризованы недостаточно. В частности, интерес представляют изменения таницитов стенки третьего желудочка. Танициты — хемочувствительные глиоэпендимные клетки. Выделяют несколько подтипов таницитов α1, α2, β1, β2 [13], различающихся своим нейрохимическим профилем, локализацией в стенке третьего желудочка и связями с ядрами гипоталамуса. Танициты участвуют в регуляции гомеостаза, являются сенсорами глюкозы и жирных кислот и других нутриентов, а также гормонов лептина, грелина и инсулина, регулирующих метаболические процессы [14, 15]. Описано влияние направленного повреждения таницитов на ожирение, показана их роль в контроле пищевого поведения и связь с орексигенными нейронами аркуатного ядра [16; 17]. Из-за участия таницитов в системной регуляции энергетического обмена предполагается, что их дисфункция может быть одним из звеньев патогенеза как БА, так и диабета 2-го типа  [15, 18]. Реакция таницитов на внутрижелудочковое введение СТЗ подробно не описана. Детализация изменений структур гипоталамуса на этой популярной модели БА позволит приблизиться к пониманию вклада повреждения клеточных популяций гипоталамуса в патогенетические процессы при БА и диабете 2-го типа.  

Цель настоящей работы — охарактеризовать динамику морфологических изменений таницитов гипоталамуса при стрептозоцин-индуцированной модели болезни Альцгеймера.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные

В исследовании использовали 20 крыс линии Вистар (самцы, 320–350 г, возраст к началу эксперимента — 3 месяца), содержавшихся в условиях вивария, при постоянном доступе к воде и пище. Животным (n = 16) делали интрацеребровентрикулярные инъекции СТЗ

(Abcam; UK), а контрольной группе (n = 4) вводили 0,9%-й раствор NaCl. После введения токсина животных, получавших СТЗ, разделили случайным образом на четыре группы (по четыре особи в группе) и выводили из эксперимента декапитацией с помощью гильотины (OpenScience; Россия) через 2 недели, 4 недели, 3 месяца и 6 месяцев после инъекции.

Стереотаксическая операция

СТЗ растворяли в 0,9%-м NaCl в дозе 3 мг/кг, и при помощи стереотаксического манипулятора (Stoelting; США) вводили по 5 мкл раствора в оба боковых желудочка мозга. Для введения использовали следующие координаты: AP = –0,8; L = 1,5; V = 3,5 (по атласу G. Paxinos и C. Watson “The rat brain in stereotaxic coordinates”). В качестве анестезии применяли комбинированный препарат золазепама и тилетамина в дозе 3 мг/100 г и ксилазин в дозе 3 мг/кг внутримышечно, для премедикации использовали атропин в дозе 0,04 мг/кг подкожно за 10–15 мин до введения ксилазина гидрохлорида.

Иммуногистохимический анализ

Для иммуногистохимического исследования образцы мозга фиксировали 24 ч в 4%-м формалине, пропитывали 30%-й сахарозой и готовили замороженные фронтальные срезы толщиной 10 мкм в области гипоталамуса. Для демаскировки антигенов срезы нагревали 20 мин в пароварке в цитратном буфере (antigen retrieval buffer, pH = 6,0; Sigma; Германия). В работе использовали мышиные моноклональные антитела (Abcam; Великобритания) к маркерам таницитов — нестину (Nes) и виментину (Vim), кроличьи поликлональные антитела (Sigma; Германия) к белкам астроглии — кислому глиофибриллярному белку (GFAP) и глутаминсинтетазе (GS). Для выявления нейронов применяли мышиные антитела (Invitrogen; США) к РНК-связывающему белку HuC/D. Для оценки митохондриальных изменений использовали кроличьи антитела (Invitrogen; США) к PGC1α (коактиватор транскрипции, регулятор биогенеза митохондрий) и MTCO1 (субъединица I цитохром-C-оксидазы, комплекс IV дыхательной цепи митохондрий). Пролиферацию клеток оценивали с помощью кроличьих антител к Ki67 (Dako; Дания), а накопление β-амилоида выявляли с помощью кроличьих антител к β-амилоидному пептиду 1–42 (Sigma; Германия). Срезы инкубировали с первичными антителами 24 ч при комнатной температуре, разведение антител выбирали в соответствии с рекомендациями производителя. Для визуализации связывания использовали соответствующие пары вторичных антител к иммуноглобулинам мыши или кролика, конъюгированных с флуорохромами Alexa 488 или  Alexa 555 (Invitrogen; США). Срезы заключали под покровные стекла в среду FluoroShield (Abcam; Великобритания), содержащую диамидинофенилиндол для мечения ядер клеток (DAPI). Морфометрия и статистическая обработка данных

Препараты исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа Nikon  Eclipse NiU (Nikon; Япония), оснащенного камерой Nikon DS-Qi (Nikon; Япония) и программным обеспечением NIS Elements (Nikon; Япония). Измерения проводили на 12-битных изображениях, полученных при одинаковых настройках осветительной системы микроскопа, при увеличении объектива ×20 или ×40. На изображениях вручную при помощи графического планшета (Wacom; Япония) выделяли области интереса (просвет желудочка, ядра или сому клеток). Плотность клеток и интенсивность иммунофлуоресцентного окрашивания в областях интереса (результаты выражали в % от максимальной яркости — 4096 градаций серого) оценивали не менее чем в 25 полях зрения, на серии 6–8 фронтальных срезов, на разных уровнях гипоталамуса. Для оценки интенсивности  иммунофлуоресцентного окрашивания на MT-CO1 и PGC1α на изображениях выделяли по 150–300 клеток для каждого животного. Данные по каждому животному усредняли. Данные по группе представляли в виде медианы и интерквартильного размаха — Me [LQ; HQ]. Для статистического анализа использовали программы Statistica 12.0 (StatSoft; США) и GraphPad Prism (GraphPad software; США). Различия между группами оценивали при помощи непараметрического критерия Краскелла–Уоллиса и последующего теста Данна для парных межгрупповых сравнений. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Внутрижелудочковое введение СТЗ вызвало нарастающее со временем повреждение стенки третьего желудочка и структур гипоталамуса. Макроанатомически обнаружили увеличение просвета третьего желудочка (рис. 1A, Г), уже на второй неделе после введения СТЗ его площадь на срезе была статистически значимо (p < 0,001) выше, по сравнению с контрольными животными — более чем в два раза, а на более поздних сроках продолжала увеличиваться. К шестому месяцу после введения площадь третьего желудочка на срезе увеличилась более чем в 20 раз, а в прилежащих ядрах гипоталамуса были выявлены некротические изменения. Воспроизведение характерных для болезни Альцгеймера патоморфологических признаков под введением СТЗ было подтверждено накоплением β-амилоидного пептида 1–42 в структурах гипоталамуса (рис. 1Б).

При выявлении виментина обнаружили повреждение глиоэпендимных элементов стенки третьего желудочка (рис. 1А). К четвертой неделе после введения СТЗ интенсивность окрашивания статистически значимо снижалась (p = 0,003) в области локализации α1- и α2-таницитов (формирующих связи, соответственно с дорсо-медиальным и вентро-медиальным ядрами гипоталамуса), по сравнению с контролем. В области локализации β1-таницитов (проецирующихся в аркуатное ядро) снижение окрашивания на виментин было менее выраженным, и статистически значимые изменения (p < 0,001) выявили только через три месяца после введения СТЗ. Эпендимоциты дорсальных отделов стенки третьего желудочка оставались сохранными до четвертой недели после введения СТЗ. Отдельные Vim+-танициты срединного возвышения гипоталамуса сохранялись и после трех месяцев, тогда как в других зонах стенки третьего желудочка к шестому месяцу Vim+ глиоэпенедимных клеток уже не выявляли. В связи с быстро нарастающим повреждением таницитов в настоящем исследовании мы сосредоточились преимущественно на оценке изменений стенки третьего желудочка на  сроках 2 и 4 недели после введения СТЗ.

Выявление как нестина, так и виментина позволило продемонстрировать  морфологические изменения таницитов. Визуально, в области локализации β1-таницитов и переходной зоне (β1/α2-танициты) на 2-й неделе после введения СТЗ отмечали утолщение Vim+ отростков и деформацию эпендимального слоя стенки желудочка (рис. 2A). Аналогичные изменения обнаруживали и при выявлении нестина (рис. 2А). Интенсивность окрашивания на нестин снижалась к 4-й неделе после введения СТЗ, по сравнению с контролем (p = 0,024), как и плотность Nes+ β1-таницитов (p < 0,001)  (рис. 2В, Г). При этом число Ki-67 позитивных ядер таницитов статистически значимо снизилось (p = 0,049; рис. 2Г) уже ко 2-й неделе, что подтверждает влияние СТЗ на пролиферативную активность клеток.

Повреждению таницитов предшествовали изменения экспрессии белков, ассоциированных с митохондриальными функциями. Снижение по сравнению с контролем (p = 0,013) интенсивности окрашивания цитоплазмы таницитов в реакции с антителами к MT-CO1 (комплекс IV дыхательной цепи) выявляли со 2-й недели после введения СТЗ, до снижения плотности таницитов и уменьшения экспрессии нестина (рис. 3A, Б). При этом окрашивание на MT-CO1 в телах нейронов прилежащего аркуатного ядра сохранялось, а подсчет нейронов аркуатного ядра на 2-й и 4-й неделях после введения СТЗ не выявил значимого снижения их плотности по сравнению с контролем. Выявление коактиватора транскрипции PGC1a (регулятора ряда митохондриальных функций) показало ко 2-й неделе статистически значимое (p = 0,048) повышение интенсивности окрашивания ядер таницитов (рис. 3Б, В), тогда как на 4-й неделе после введения СТЗ интенсивность окрашивания на PGC1a снизилась до контрольных значений.

Для оценки изменений астроглии использовали иммуногистохимическое выявление GFAP и глутаминсинтетазы (GS). У интактных животных GFAP выявляли в  значительной части глиоэпендимных клеток, тогда как уровень экспрессии GS в таницитах, по сравнению с астроглией, по-видимому, незначителен. Морфологические изменения  GFAP-позитивных астроцитов в аркуатном ядре свидетельствовали о развитии реактивного глиоза под действием СТЗ уже ко 2-й неделе: наблюдали утолщение, деформацию отростков, усиление окрашивания на глиальные маркеры (рис. 4А, Б). Интенсивность окрашивания на GS возросла к 4-й неделе (p = 0,03), что, по-видимому, связано с увеличением площади астроцитов на срезе (рис. 4Б, Г). Вместе с тем, число (плотность) астроцитов не увеличивалось  на ранних сроках после введения СТЗ, а к третьему месяцу — статистически значимо снизилось относительно контроля (p = 0,019; рис. 4В). В целом, изменения астроглии свидетельствовали о нарастающей нейровоспалительной реакции в прилежащих к третьему желудочку структурах гипоталамуса. Хотя СТЗ и вызвал повреждение астроцитов, они оказались более устойчивыми к действию токсина, по сравнению с таницитами.

Обобщая полученные результаты, можно отметить, что введение СТЗ привело к накоплению β-амилоида в структурах гипоталамуса, в том числе нейронах аркуатного ядра, вызвало увеличение размеров желудочков, что, очевидно, связано с повреждением глиоэпендимных элементов. Танициты разных типов отличались чувствительностью к СТЗ, однако как α1/α2, так и β1-танициты, повреждались на ранних сроках после введения СТЗ, что проявилось снижением их пролиферативной активности и изменением экспрессии белков, ассоциированных с митохондриями. Эти изменения возникли до выявления выраженных нарушений морфологии таницитов. К 4-й неделе после введения СТЗ плотность β1-таницитов третьего желудочка снизилась. Кроме того, СТЗ вызвал реактивные изменения и повреждение астроглии, однако плотность как астроцитов, так и нейронов аркуатного ядра до 4-х недель после введения токсина осталась неизменной, что указывает на большую уязвимость таницитов к СТЗ, по сравнению с другими клеточными популяциями гипоталамуса.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Большая часть работ по оценке морфологических и нейрохимических изменений на стрептозоциновой модели посвящена исследованиям гиппокампа в связи с его ролью в когнитивных нарушения при БА. Эти данные согласуются с наблюдавшимися в нашей работе изменениями. Так, в экспериментах с внутрижелудочковым или интрацистернальным введением СТЗ показаны накопление β-амилоида в гиппокампе через три месяца после введения токсина, нарушение экспрессии синаптических белков, а также гибель нейронов и снижение объема гиппокампа [3, 19]. Выявлено влияние СТЗ и на астроциты гиппокампа: показано снижение количества и изменение структуры их отростков [20]. При введении СТЗ обнаружено снижение экспрессии рецепторов инсулина в гиппокампе [21]. Поскольку астроциты, предположительно, являются мишенью инсулина и нокаут инсулиновых рецепторов астроцитов вызывает когнитивные нарушения у животных [22], можно предположить что дисфункция глиальных элементов имеет ведущую роль в вызываемых СТЗ локальных метаболических нарушениях.

Данные по изменениям таницитов у человека при БА в литературе не представлены. Охарактеризованы лишь возраст-зависимые нарушения организации отростков таницитов [23]. Вместе с тем, в патоморфологических исследованиях обнаруживают дегенеративные изменения, накопление β-амилоида и митохондриальные нарушения в ядрах гипоталамуса [24].

Механизмы, лежащие в основе дисфункции гипоталамуса при БА у человека, не выяснены. Многие исследователи помимо нейродегенерации отводят значительную роль изменениям синтеза, секреции и транспорта гипоталамических гормонов и факторов [18, 24], участвующих в гомеостатической регуляции гипоталамогипофизарной системы, что может быть опосредовано нарушением функции таницитов. Например, танициты вовлечены в регуляцию высвобождения тиреолиберина и служат основным источником трийодотиронина в мозге. Причем, как для тиреолиберина, так и для трийодтиронина, показано нейропротекторное действие на моделях БА [25, 26].

Танициты экспрессируют GLUT2-транспортер [13, 27] и, соответственно, являются одной из клеточных мишеней СТЗ, и их повреждение, выявленное в нашей работе, — ожидаемый эффект введения токсина. Причины более выраженного повреждения α-таницитов в нашей работе могут быть связаны с неодинаковым уровнем экспрессии глюкозного транспортера и частотой обновления разных популяций таницитов, а также их метаболическими особенностями, для уточнения которых необходимы дальнейшие исследования. Наблюдавшиеся различия динамики изменений нестина и виментина могут быть объяснены тем, что хотя танициты всех типов экспрессируют эти белки, содержание виментина отличается для α и β-таницитов [18]. Кроме того, имеются данные о разнонаправленных изменениях регуляции белков цитоскелета в таницитах [28].

Важно, что изменения таницитов под действием СТЗ предшествовали другим нейродегенеративным и нейровоспалительным изменениям в гипоталамусе. В целом, учитывая, что танициты модулируют функции нейронов вентро-медиального, дорсо-медиального и аркуатного ядер гипоталамуса и вовлечены в механизмы регуляции как локального, так и системного энергетического обмена и в контроль пищевого поведения [15, 18, 29], их повреждение, вероятно, приводит к наблюдающимся на данной модели БА нарушениям углеводного обмена [30, 31]. Вместе с тем, дисфункцию структур гипоталамуса при введении СТЗ и показанные ранее нейродегенеративные изменения в гипоталамусе на поздних сроках [31] может провоцировать и нейровоспалительная реакция, затрагивающая помимо таницитов прочие клеточные популяции.

Выявленное нами снижение интенсивности окрашивания таницитов на MT-CO1 (субъединица 1 цитохром-С-оксидазы) согласуется со снижением активности цитохром-С-оксидазы на стрептозоциновой модели диабета [32]. При исследовании коры и гиппокампа животных, которым вводили СТЗ, было показано снижение активности пируватдегидрогеназы, α-кетоглутаратдегидрогеназы, и цитохром-С-оксидазы в митохондриях как неокортекса, так и гиппокампа [33]. При внутрижелудочковом введении СТЗ помимо этого было показано снижение активности комплексов I–III митохондрий [34]. Эти данные подчеркивают ранее охарактеризованную in vitro чувствительность митохондрий к СТЗ [35]. Наблюдавшееся увеличение экспрессии PGC1a (регулятора митохондриального биогенеза) на раннем сроке после введения СТЗ, по-видимому, можно рассматривать как компенсаторную реакцию в ответ на развивающиеся  нарушения. Возвращение к исходному уровню PGC1a, возможно, свидетельствует о частичной нормализации функций сохранных таницитов. В свою очередь, дизрегуляция PGC1a связана с нейровоспалительными процессами и может быть одним из факторов, вносящих вклад в повреждение нейронов при БА [36,37]. Динамику выявляемых митохондриальных нарушений в разных структурах под действием СТЗ еще предстоит оценить.

Обнаруженное снижение пролиферации таницитов под действием СТЗ интересно сопоставить с ранее выявленным влиянием этого токсина на нейральные стволовые клетки в гиппокампе [38], а также его высокой токсичностью по отношению к незрелым нейронам [39]. Поскольку танициты, по-видимому, имеют нейрогенный потенциал [40], нарушение пролиферации и гибель нейральных стволовых клеток гипоталамуса под действием СТЗ может иметь отсроченные эффекты, связанные с нарушением пластичности нейронных сетей гипоталамуса, контролирующих гомеостатические процессы.

На рис. 5 (по данным [14, 15, 17, 18]) обобщены некоторые функции α- и β- таницитов, предположительно вовлекаемые в патологические изменения на стрептозоцин-индуцированной модели БА. Вероятное вовлечение таницитов в патогенез БА предполагает возможность разработки фармакологических методов коррекции их функции. Ряд авторов считает возможной регуляцию пролиферации таницитов путем воздействия ростовых факторов [18].

ВЫВОДЫ

Полученные данные демонстрируют повышенную уязвимость таницитов гипоталамуса к СТЗ, снижение их пролиферативной активности и сопутствующие митохондриальные изменения. Изменения таницитов предшествовали активации астроглии и повреждению нейронов. Выявленные изменения в медио-базальном гипоталамусе позволяют предположить существенную роль повреждения таницитов в развитии локальных и системных метаболических нарушений при моделировании болезни Альцгеймера. Среди возможных функциональных последствий повреждения таницитов можно выделить: нарушение барьерных функций и снижение клеточного метаболизма в структурах гипоталамуса, дисбаланс орексигенных и анорексигенных эффектов, дизрегуляцию гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной системы.