Распространение раковых клеток по организму от материнской опухоли происходит через жидкие среды организма, такие как кровь или лимфа [1]. Определить начало метастазирования в региональные лимфатические узлы со 100%-й точностью можно при рассечении подмышечных узлов и биопсии сторожевого узла. При этом из-за высокой инвазивности высок риск осложнений, связанных со скоплением лимфатической жидкости в тканях [2, 3]. К неинвазивным методам диагностики регионального метастазирования относят ультразвуковое исследование (УЗИ), магнитнорезонансную и позитронно-эмиссионную томографию (МРТ и ПЭТ). УЗИ является стандартным методом для поиска метастазирования в лимфатические узлы, но его чувствительность и специфичность зависят от качества аппаратуры и опыта оператора [4]. Применение МРТ ограничено противопоказаниями для людей с почечной недостаточностью, аллергией, кардиостимуляторами. ПЭТ отличается невысокой чувствительностью для диагностики подмышечных узлов [5].

Анализ плазмы крови является малоинвазивным методом. Его можно использовать для диагностики по молекулярному профилю плазмы болезни Альцгеймера [6], рака шейки матки [7], легкого [8], муковисцидоза печени и легких [9]. Кроме того, в плазме крови были обнаружены белковые маркеры метастазирования опухолей прямой кишки [10] и ротовой полости [11], а также маркеры для определения регионального метастазирования, однако набор биомаркеров был специфичен для типа опухоли (лобулярной или протоковой) [12]. Липиды входят в состав молекулярного профиля и являются участниками важных метаболических процессов [13]. Липидный профиль плазмы, полученный с использованием высокоэффективной жидкостной хромато-массспектрометрии, позволил построить эффективную модель для классификации рака молочной железы или доброкачественной опухоли молочной железы на основе выбранных маркеров [14], что позволяет в совокупности с вышеприведенными примерами предположить наличие маркеров процессов метастазирования в плазме крови.

Целями данного исследования были поиск липидных маркеров регионального метастазирования в плазме крови у пациентов с зарегистрированным раком молочной железы методом жидкостной хромато-масс-спектрометрии и оценка возможности создания диагностической панели.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В исследование включили 55 женщин с диагностированным раком молочной железы, проходивших лечение в Национальном медицинском исследовательском центре акушерства, гинекологии и перинатологии имени В. И. Кулакова (Россия). Критериями включения были: наличие подписанного информированного добровольного согласия на проведение оперативного хирургического вмешательства и включение в дальнейшее исследование, возраст больных от 18 до 80 лет; наличие гистологически или цитологически подтвержденного диагноза рака молочной железы. Критерии исключения: неоадъювантная терапия и наличие злокачественных новообразований другой локализации до постановки диагноза РМЖ. У 28 женщин было выявлено метастазирование в региональные лимфоузлы, 27 женщин составили контрольную группу. Липиды экстрагировали из 40 мкл плазмы методом Фолча [15]: к 40 мкл плазмы и 5 мкл внутреннего стандарта добавляли 480 мкл CHCl₃ / MeOH (1 / 1) и выдерживали в ультразвуковой ванне 10 мин. После этого смесь перемешивали 10 с и центрифугировали 5 мин при 15 000 G. Органический слой, содержащий липиды, отбирали в отдельную виалу. К водному слою добавляли 250 мкл CHCl₃ / MeOH (1 / 1) и центрифугировали 5 мин при 15 000 G. Повторно отбирал нижний органический слой и соединял с отобранным ранее. Липидный раствор высушивали в потоке азота и перерастворяли в 200 мкл IPA / ACN (1 / 1) для дальнейшего анализа.

Анализ липидов из экстракта проводили на жидкостном хроматографе Dionex UltiMate 3000 (Thermo Scientific; Германия), соединенном с масс-анализатором Maxis Impact qTOF с источником ионов ЭРИ (Bruker Daltonics; Германия). Разделение образцов осуществляли методом обращеннофазовой хроматографии на колонке Zorbax C18 (150 × 2,1 мм, 5 мкм; Agilent, США) с линейным градиентом от 30 до 90% элюента В (раствор ацетонитрил / изопропанол / вода, в объемном соотношении 90 / 8 / 2, с добавлением 0,1%-й муравьиной кислоты и 10 ммоль/л формиата аммония) за 20 мин. В качестве элюента А использовали раствор ацетонитрил / вода в объемном соотношении 60 / 40 с добавлением 0,1% муравьиной кислоты и 10 ммоль/л формиата аммония. Скорость потока элюирования была 40 мкл/мин, объем инжектируемого образца — 3 мкл. Масс-спектры получали в режиме положительных ионов и в режиме отрицательных ионов в диапазоне m/z, равном 100–1700, со следующими установками: напряжение на капилляре — 4,1 кВ и 3,0 кВ для режима положительных ионов и режима отрицательных ионов; давление распыляющего газа — 0,7 бар; скорость потока осушающего газа — 6 л/мин, температура осушающего газа — 200 °C.

Липиды идентифицировали с использованием R-скрипта Lipid Match [16] по точной массе и по характерным тандемным масс-спектрам (МС / МС).

Для статистической обработки результатов использовали скрипты, написанные на языке R [17] в среде RStudio [18]. 

Поиск соединений, имеющих статистически значимую разницу уровней плазмы у пациенток с метастазированием и без него, осуществляли с помощью теста Манна–Уитни для попарного сравнения групп. Для описания количественных данных использовали медиану (Me) и квартили Q₁ и Q₃. Величину порогового уровня значимости p принимали равной 0,05.

Создание диагностической модели на основе логистической регрессии осуществляли путем вычисления значения проекции переменной при ортогональной проекции на скрытые структуры [19] и выбора соединений, характеризующихся значением проекции переменной больше 1. Из выбранных переменных на основе информационного критерия Акаике (AIC) [20] осуществляли поэтапный выбор переменных, пока это приводило к уменьшению AIC. Для получения финальной модели из регрессии поэтапно удаляли переменные, коэффициенты которых не были статистически значимо отличны от 0 (p > 0,05). Качество полученной диагностической модели тестировали внутренней кросс-валидацией с контролем по отдельным объектам. Для оценки использовали значения площади под операционной кривой, чувствительность и специфичность. 

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе исследования было выявлено 183 липидных соединения в режиме положительных ионов и 161 соединение в режиме отрицательных ионов, из них четыре характеризовались наличием статистически значимой разницы в уровнях при режиме положительных ионов (табл. 1) и шесть — при режиме отрицательных ионов (табл. 2). Уровень окисленных липидов (оксотриглицеридов в режиме положительных ионов и фосфатидилхолинов в режиме отрицательных ионов) повышается при наличии метастазирования. Уровень сфингомиелинов, наоборот, падает при наличии метастазирования.

По результатам построений ортогональных проекций на скрытые структуры (рис. 1) было выбрано 36 липидов в режиме положительных ионов и 29 — в режиме отрицательных ионов со значением проекции переменной (ПП)  больше 1.

Использовали семь соединений в режиме положительных ионов, которые позволили построить модель с площадью под операционной кривой, равной 0,84 (табл. 3; рис. 2А), и два соединения в режиме отрицательных ионов, которые позволили построить модель с площадью под операционной кривой, равной 0,71 (табл. 4; рис. 2Б). Чувствительность и специфичность составили для модели в режиме положительных ионов 79 и 74% соответственно, для модели в режиме отрицательных ионов — 50 и 85% соответственно.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 

Большая часть липидов, уровень которых статистически значимо повышается при наличии метастазирования, относится к окисленным. Окисленные липиды формируются преимущественно в подвергающихся апоптозу клетках, являясь при этом участниками воспалительных процессов [21]. Они были также выделены как предсказательные маркеры ишемической болезни сердца  в плазме крови [22]. Созданные панели содержат в основном сфингомиелины и лизо- и фосфатидилхолины, содержащие длинные ацильные цепи. На сегодняшний день известна связь синтаз жирных кислот и омега-6 ненасыщенных жирных кислот с процессами метастазирования [23, 24], а также зарегистрировано повышение уровня сфингомиелинов и лизофосфатидилхолинов относительно фосфатидилхолинов в плазме крови при прогрессирующем метастатическом раке молочной железы у мышей [25]. Однако в данном исследовании было зарегистрировано статистически значимое понижение уровня сфингомиелинов в плазме крови при начале метастазирования. Разное изменение уровней сфингомиелинов в начале метастазирования было обнаружено при анализе злокачественных тканей (понижение уровня) и при анализе граничных здоровых тканей молочной железы (повышение уровня) [26]. Из липидов, определенных в диагностическую панель, только два соединения имеют статистически значимые различия в уровнях при метастазировании и при его отсутствии. Это связано с тем, что для создания диагностической панели использовали методы многомерного анализа, в которых учитывали связи липидов между собой. Использование данного метода для выбора маркеров оправдано с точки зрения применения модели к многокомпонентному пространству с неортогональными компонентами, которую представляет липидный профиль крови. Использование методов одномерного анализа позволяет оценить изменение липидного профиля с точки зрения дальнейшего исследования патофизиологии процесса метастазирования.

ВЫВОДЫ

В данном исследовании проведен анализ липидного профиля пациенток с раком молочной железы методом высокоэффективной хромато-масс-спектрометрии. Липиды, имеющие статистически значимые различия в уровнях, относились к окисленным липидам и сфингомиелинам. Липиды, вошедшие в состав диагностических панелей, преимущественно относились к классам сфингомиелинов и фосфатидилхолинов и характеризовались высоким уровнем ненасыщенности ацильных цепей и длиной (20–24 атома углерода). Полученную диагностическую модель можно использовать в дальнейших исследованиях, связанных с разработкой метода малоинвазивной диагностики метастазирования.