ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Новый вирулентный бактериофаг Klebsiella pneumoniae KPPK108.1, инфицирующий штаммы серотипа K108

П. В. Евсеев1, М. М. Шнейдер1, Ю. В. Михайлова2, А. А. Шеленков2, Ю. Г. Янушевич3, М. Г. Карлова4, А. В. Моисеенко4, О. С. Соколова4, Д. А. Шагин3
Информация об авторах

1 Институт биохимии имени М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова, Москва, Россия

2 Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия

3 Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова, Москва, Россия

4 Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, Москва, Россия

Для корреспонденции: Михаил Маркович Шнейдер
ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10, г. Москва, 117997, Россия; ur.liam@nhs_mm

Информация о статье

Финансирование: работа выполнена при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Российской Федерации (ЕГИСУ НИОКТР № 121052800048-3).

Благодарности: авторы благодарят Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины РНИМУ им. Н. И. Пирогова за консультации по методической части исследования.

Вклад авторов: Д. А. Шагин — концептуализация, руководство исследованием, редактирование рукописи; П. В. Евсеев, А. А. Шеленков — формальный анализ данных секвенирования, редактирование рукописи; М. М. Шнейдер — методология, руководство исследованием; Ю. В. Михайлова — секвенирование, валидация данных; Ю. Г. Янушевич, А. Моисеенко, М. Г. Карлова — методология; О. С. Соколова — электронная микроскопия, методология.

Статья получена: 08.12.2021 Статья принята к печати: 22.12.2021 Опубликовано online: 30.12.2021
|

Современная фаготерапия с ее персонализированным подходом основана на детальном исследовании взаимодействия фагов и бактериальных клеток. Одной из важнейших детерминант специфичности в отношениях фаг–клетка являются бактериальные углеводы, экспонированные на клеточной поверхности: O-антигены и капсулярные полисахариды. Капсулярные полисахариды K. pneumoniae, являющиеся фактором вирулентности [1], весьма разнообразны по своей структуре. В настоящий момент биоинформационные базы указывают на наличие не менее 134 генетических вариантов [2]. Для решения задач терапевтической практики необходимо создание коллекции фагов, имеющих преохарактеризованную специфичность, в том числе по способности адсорбции через распознавание капсулярных полисахаридов определенной структуры. Целью исследования было выделить вирулентный фаг, специфически инфицирующий ранее охарактеризованные штаммы K. pneumoniae, имеющие капсулярный полисахарид KL108, и всесторонне изучить его с точки зрения биологии и генетики. Для создания всеобъемлющей характеристики вируса были использованы стандартные методы фаговой биологии, электронная микроскопия, а также биоинформатика, включая современные методы предсказания белковых структур (программа AlphaFold).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клинические штаммы K. pneumoniae P224 (1732) и P225 (1333), имеющие капсулярный полисахарид типа K108, были получены из коллекции Института эпидемиологии (Москва, Россия). Для выделения бактериофагов использовали образцы сточных вод из очистных сооружений г. Москвы. К предварительно осветленным центрифугированием образцам сточных вод добавляли сухие компоненты среды для культивирования бактерий (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта и 5 г/л NaCl), затем среды инокулировали культурой бактериальных клеток в экспоненциальной фазе роста. Культивирование проводили в течение 16 ч при 37 °C, после чего бактериальную культуру инактивировали хлороформом и образцы осветляли центрифугированием. Наличие фагов определяли титрованием по методу агаровых слоев. Выделенный фаг титровали до единичных негативных колоний дважды последовательно. Препаративное наращивание бактериофага проводили в 1 л культуры штамма Р224 при 37 °C. Бактериофаг осаждали полиэтиленгликолем и очищали ультрацентрифугированием в градиенте хлористого цезия [3].

Геномную ДНК фага выделяли из очищенного препарата фага путем инкубации в растворе 100 мM Tris-HCl (pH 7,5), 25 мM EDTA, 1,5 M NaCl, 2% (w/v) CTAB,  0,3% (v/v) β-меркаптоэтанола и 50 мг/мл протеиназы K при 50 °C 30 мин, с последующей экстракцией ДНК хлороформом и осаждением путем добавления 0,6 объема изопропилового спирта. Секвенирование генома выполняли на платформе MiSeq, используя набор Nextera DNA library preparation kit (Illumina; USA). Полученные последовательности собирали в единый контиг программой SPAdes v. 3.13 [4].

Эксперимент по оценке продукции фаговых частиц выполнен по описанному ранее протоколу [5].

Фаговые частицы визуализировали методом электронной микроскопии с негативным контрастированием. Препарат фага объемом 3 мкл наносили на покрытую углеродом сеточку 400 mesh. Препарат негативно контрастировали 1%-м уранилацетатом в течение 30 с, изображения получали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа JEOL JEM-2100 200 kV (JEOL USA Inc., США ) при увеличении ×30 000.

Геном бактериофага Klebsiella phage KPPK108.1 аннотировали с помощью Prokka [6], используя встроенные базы данных. Предсказание функций закодированных в геноме белков выполняли с помощью поиска BLAST [7] по известным гомологам и сравнения схожих мотивов HMM с помощью онлайн-сервисов HHpred [8] и Phyre2 [9] с использованием баз данных SCOPe70_2.07, ECOD_ ECOD_F70 и UniProt-SwissProt-viral70. В качестве критерия достоверного сходства BLAST использовали величину E value < 10–5, в качестве критерия достоверного сходства сравнения HMM — величины Phyre2 «confidence» и HHpred «probability» более 95%. Генетическую карту формировали с помощью программы Geneious Prime [10].

Последовательности геномов бактериофагов, использовавшиеся для сравнения с фагом KPPK108.1, были загружены из базы данных NCBI Genome [11]. Среднегеномное сходство рассчитывали с помощью онлайн-сервиса VIRIDIC [12] и программы orthoANIu [13]. Филогенетический анализ выполняли методом максимального правдоподобия, реализованным в программе RAxML [14], с применением модели замещения аминокислот GAMMA LG [15] и использованием конкатенированных выравниваний аминокислотных последовательностей основного капсидного белка, большой субъединицы терминазы, ДНК-полимеразы и РНКполимеразы. Выравнивания были получены с помощью программы MAFFT [16] и конкатенированы с помощью Geneious Prime [10]. Диаграмму межгеномного сравнения выполняли в программе Easyfig [17] с использованием TBLASTX [7] для нахождения гомологичных областей в геномах.

Модель третичной структуры продукта гена 8 и четвертичной структуры белка хвостового шипа бактериофага Klebsiella phage KPPK108.1 строили с помощью программы AlphaFold-Multimer [18, 19]. Структура белка хвостового шипа фага Enterobacteria phage φ92 была загружена из базы данных PDB [20]. Расчет электростатического поверхностного заряда белка хвостового шипа проводили с помощью программы APBS [21]. Выравнивание и визуализацию структур выполняли в программе UCSF Chimera [22].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На бактериальной культуре в агаризованной среде бактериофаг KPPK108.1 образует прозрачные негативные колонии диаметром 5 мм с прозрачным ореолом (рис. 1). Наличие ореола, как правило, свидетельствует о присутствии фаговой деполимеразы, что в дальнейшем подтвердили генетические исследования. Одностадийная кривая роста продемонстрировала латентный период 15 мин и урожайность фаговых частиц в количестве 46 на одну инфицированную клетку.

Бактериофаг Klebsiella KPPK108.1 имеет типичный для фагов семейства Autographiviridae геном, состоящий из двухцепочечной ДНК размером 43 755 п.н. с прямыми концевыми повторами размером 244 п.н. ГЦ-состав генома — 53,6%, что несколько ниже значения 57,5%, характерного для отсеквенированного штамма K. pneumoniae HS11286 (GenBank Accession CP003200.1). При поиске кодирующих последовательностей в геноме выявлено 56 генов, кодирующих белки, и не обнаружены гены, кодирующие тРНК (рис. 2). Поиск гомологичных и схожих последовательностей с применением алгоритмов BLAST и сравнения мотивов HMM, с использованием публичных баз данных и серверов, позволил предсказать функции 29 белков, закодированных в геноме. Функции 27 белков определить не удалось. Гены интегразы и других белков, присущих умеренным фагам, в геноме обнаружены не были.

Сравнение среднего общегеномного сходства (ANI) с использованием всех 14 923 генов хвостатых бактериофагов, депонированных в базу данных NCBI Genome, выявило группу бактериофагов Klebsiella, относящихся к роду Drulisvirus, наиболее близких по этому параметру к фагу KPPK108.1 (рис. 3). Значение ANI фага KPPK108.1 и типового фага рода Drulisvirus Klebsiella phage KP34 составляет 73,0%. Филогенетический анализ, проведенный с использованием конкатенированных аминокислотных последовательностей основного капсидного белка, большой субъединицы терминазы, ДНК-полимеразы и РНК-полимеразы, кластеризует бактериофаги Drulisvirus и фаг KPPK108.1 в одну монофилетическую группу (рис. 4). Состав генов и организация генома фага KPPK108.1 в целом напоминают бактериофаг Escherichia phage T7 и другие фаги семейства Autographiviridae (рис. 5) и практически идентичны таковым у других представителей Drulisvirus. Интересной особенностью обладает продукт гена 8. Структурное моделирование показало необычную Г-образную форму белка с C-концевой тубулообразной частью (рис. 6.1). Эта часть характеризуется увеличенным по сравнению со средним количеством положительно заряженных аминокислотных остатков. Моделирование электростатического поля продемонстрировало существенный (до –5) отрицательный поверхностный заряд C-концевой части продукта гена 8 (рис. 6.2).

Биоинформатический анализ генома фага KPPK108.1 выявил наличие генов, кодирующих белки хвостового адаптора и хвостового шипа. Структура белка хвостового шипа была моделирована и проанализирована (рис. 6). Поиск похожих структур показал высокую степень сходства хвостового шипа фага KPPK108.1 и хвостового шипа фага Enterobacteria phage –92 (PDB структура 6E0V) (рис. 6), обладающего коланидазной активностью, подтвержденной экспериментально [23].

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Значение общегеномного сходства фагов KPPK108.1 и KP34 выше 70% границы рода вместе с результатами филогенетического анализа с использованием конкатенированных последовательностей консервативных генов указывает на принадлежность бактериофага Klebsiella phage KPPK108.1 к роду Drulisvirus подсемейства Slopekvirinae семейства Autographiviridae. Этот вывод подтверждают и результаты межгеномного сравнения. Небольшие различия в организации геномов могут быть объяснены рекомбинационными событиями, сопровождавшими эволюцию бактериофагов Klebsiella, что подтверждается присутствием в геноме KPPK108.1 и других родственных бактериофагов генов NHNэндонуклеазы. Строение генома фага KPPK108.1 типично для бактериофагов семейства Autographivirinae и характеризуется наличием региона «ранних генов» [24], который включает ген 8, кодирующий гипотетический белок с необычной Г-образной третичной структурой.

Хотя функция этого белка была определена не поиском гомологов с помощью BLAST или схожих белков с помощью сравнения мотивов HMM, исходя из распределения поверхностного заряда можно было бы предположить, что этот белок мимикрирует нуклеиновую кислоту, как это встречается у белков Ocr, также расположенных в раннем регионе геномов других автографивирид и мимикрирующих ДНК [25, 26]. Было показано, что белок Ocr эффективно ингибирует систему рестрикции-модификации BREX, облегчая течение фаговой инфекции [27].

Биоинформатический анализ генома фага KPPK108.1 позволяет предсказать состав адсорбционного аппарата, который включает адаптор хвостового шипа и основной белок хвостового шипа, обладающий ферментативной активностью. По всей видимости, белок хвостового шипа является рецептор-связывающим белком (receptor-binding protein, RBP), определяющим специфичность и спектр хозяев фага [28]. Структурный анализ белка хвостового шипа свидетельствует о наличии деполимеризующей активности в отношении полисахарида, предположительно родственного колановой кислоте E. coli. Субстратом коланидаз является колановая кислота — внеклеточный полисахарид, состоящий из нескольких видов углеводных остатков (например, L-фукозы, D-глюкозы, D-галактозы и D-глюкуроновой кислоты), секретируемый в среду бактериями семейства Enterobacteriaceae [29]. Коланидазы были обнаружены в составе фаговых RBP сравнительно недавно [30], и присущи ряду вирулентных бактериофагов, относящихся к эволюционно далеким группам, включая подо- и миовирусы [23, 30], часть из которых показала высокую эффективность в составе фаговых коктейлей для фаговой терапии [30]. Необходимо установить структуру капсулярного полисахарида K. pneumoniae типа K108, чтобы прояснить вопрос о сходстве этого полимера с колановой кислотой.

ВЫВОДЫ

Бактериофаг Klebsiella KPPK108.1 представляет собой вирулентный бактериофаг, относящийся к роду Drulisvirus семейства Autographiviridae. Детальный биоинформатический анализ свидетельствует о литическом образе инфекционного цикла фага и позволяет предсказать структуру адсорбционного аппарата фага из адаптора хвостового шипа и белка хвостового шипа, обладающего коланидазной активностью. Предсказанные характеристики бактериофага KPPK108.1 свидетельствуют о перспективности его применения в составе фаговых коктейлей в целях фаговой терапии. Насколько нам известно, это первый полностью охарактеризованный фаг, специфичный капсулярному типу KL108.

КОММЕНТАРИИ (0)