Современная фаготерапия с ее персонализированным подходом основана на детальном исследовании взаимодействия фагов и бактериальных клеток. Одной из важнейших детерминант специфичности в отношениях фаг–клетка являются бактериальные углеводы, экспонированные на клеточной поверхности: O-антигены и капсулярные полисахариды. Капсулярные полисахариды K. pneumoniae, являющиеся фактором вирулентности [1], весьма разнообразны по своей структуре. В настоящий момент биоинформационные базы указывают на наличие не менее 134 генетических вариантов [2]. Для решения задач терапевтической практики необходимо создание коллекции фагов, имеющих преохарактеризованную специфичность, в том числе по способности адсорбции через распознавание капсулярных полисахаридов определенной структуры. Целью исследования было выделить вирулентный фаг, специфически инфицирующий ранее охарактеризованные штаммы K. pneumoniae, имеющие капсулярный полисахарид KL108, и всесторонне изучить его с точки зрения биологии и генетики. Для создания всеобъемлющей характеристики вируса были использованы стандартные методы фаговой биологии, электронная микроскопия, а также биоинформатика, включая современные методы предсказания белковых структур (программа AlphaFold).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клинические штаммы K. pneumoniae P224 (1732) и P225 (1333), имеющие капсулярный полисахарид типа K108, были получены из коллекции Института эпидемиологии (Москва, Россия). Для выделения бактериофагов использовали образцы сточных вод из очистных сооружений г. Москвы. К предварительно осветленным центрифугированием образцам сточных вод добавляли сухие компоненты среды для культивирования бактерий (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта и 5 г/л NaCl), затем среды инокулировали культурой бактериальных клеток в экспоненциальной фазе роста. Культивирование проводили в течение 16 ч при 37 °C, после чего бактериальную культуру инактивировали хлороформом и образцы осветляли центрифугированием. Наличие фагов определяли титрованием по методу агаровых слоев. Выделенный фаг титровали до единичных негативных колоний дважды последовательно. Препаративное наращивание бактериофага проводили в 1 л культуры штамма Р224 при 37 °C. Бактериофаг осаждали полиэтиленгликолем и очищали ультрацентрифугированием в градиенте хлористого цезия [3].

Геномную ДНК фага выделяли из очищенного препарата фага путем инкубации в растворе 100 мM Tris-HCl (pH 7,5), 25 мM EDTA, 1,5 M NaCl, 2% (w/v) CTAB,  0,3% (v/v) β-меркаптоэтанола и 50 мг/мл протеиназы K при 50 °C 30 мин, с последующей экстракцией ДНК хлороформом и осаждением путем добавления 0,6 объема изопропилового спирта. Секвенирование генома выполняли на платформе MiSeq, используя набор Nextera DNA library preparation kit (Illumina; USA). Полученные последовательности собирали в единый контиг программой SPAdes v. 3.13 [4].

Эксперимент по оценке продукции фаговых частиц выполнен по описанному ранее протоколу [5].

Фаговые частицы визуализировали методом электронной микроскопии с негативным контрастированием. Препарат фага объемом 3 мкл наносили на покрытую углеродом сеточку 400 mesh. Препарат негативно контрастировали 1%-м уранилацетатом в течение 30 с, изображения получали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа JEOL JEM-2100 200 kV (JEOL USA Inc., США ) при увеличении ×30 000.

Геном бактериофага Klebsiella phage KPPK108.1 аннотировали с помощью Prokka [6], используя встроенные базы данных. Предсказание функций закодированных в геноме белков выполняли с помощью поиска BLAST [7] по известным гомологам и сравнения схожих мотивов HMM с помощью онлайн-сервисов HHpred [8] и Phyre2 [9] с использованием баз данных SCOPe70_2.07, ECOD_ ECOD_F70 и UniProt-SwissProt-viral70. В качестве критерия достоверного сходства BLAST использовали величину E value < 10^–5, в качестве критерия достоверного сходства сравнения HMM — величины Phyre2 «confidence» и HHpred «probability» более 95%. Генетическую карту формировали с помощью программы Geneious Prime [10].

Последовательности геномов бактериофагов, использовавшиеся для сравнения с фагом KPPK108.1, были загружены из базы данных NCBI Genome [11]. Среднегеномное сходство рассчитывали с помощью онлайн-сервиса VIRIDIC [12] и программы orthoANIu [13]. Филогенетический анализ выполняли методом максимального правдоподобия, реализованным в программе RAxML [14], с применением модели замещения аминокислот GAMMA LG [15] и использованием конкатенированных выравниваний аминокислотных последовательностей основного капсидного белка, большой субъединицы терминазы, ДНК-полимеразы и РНКполимеразы. Выравнивания были получены с помощью программы MAFFT [16] и конкатенированы с помощью Geneious Prime [10]. Диаграмму межгеномного сравнения выполняли в программе Easyfig [17] с использованием TBLASTX [7] для нахождения гомологичных областей в геномах.

Модель третичной структуры продукта гена 8 и четвертичной структуры белка хвостового шипа бактериофага Klebsiella phage KPPK108.1 строили с помощью программы AlphaFold-Multimer [18, 19]. Структура белка хвостового шипа фага Enterobacteria phage φ92 была загружена из базы данных PDB [20]. Расчет электростатического поверхностного заряда белка хвостового шипа проводили с помощью программы APBS [21]. Выравнивание и визуализацию структур выполняли в программе UCSF Chimera [22].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На бактериальной культуре в агаризованной среде бактериофаг KPPK108.1 образует прозрачные негативные колонии диаметром 5 мм с прозрачным ореолом (рис. 1). Наличие ореола, как правило, свидетельствует о присутствии фаговой деполимеразы, что в дальнейшем подтвердили генетические исследования. Одностадийная кривая роста продемонстрировала латентный период 15 мин и урожайность фаговых частиц в количестве 46 на одну инфицированную клетку.

Бактериофаг Klebsiella KPPK108.1 имеет типичный для фагов семейства Autographiviridae геном, состоящий из двухцепочечной ДНК размером 43 755 п.н. с прямыми концевыми повторами размером 244 п.н. ГЦ-состав генома — 53,6%, что несколько ниже значения 57,5%, характерного для отсеквенированного штамма K. pneumoniae HS11286 (GenBank Accession CP003200.1). При поиске кодирующих последовательностей в геноме выявлено 56 генов, кодирующих белки, и не обнаружены гены, кодирующие тРНК (рис. 2). Поиск гомологичных и схожих последовательностей с применением алгоритмов BLAST и сравнения мотивов HMM, с использованием публичных баз данных и серверов, позволил предсказать функции 29 белков, закодированных в геноме. Функции 27 белков определить не удалось. Гены интегразы и других белков, присущих умеренным фагам, в геноме обнаружены не были.

Сравнение среднего общегеномного сходства (ANI) с использованием всех 14 923 генов хвостатых бактериофагов, депонированных в базу данных NCBI Genome, выявило группу бактериофагов Klebsiella, относящихся к роду Drulisvirus, наиболее близких по этому параметру к фагу KPPK108.1 (рис. 3). Значение ANI фага KPPK108.1 и типового фага рода Drulisvirus Klebsiella phage KP34 составляет 73,0%. Филогенетический анализ, проведенный с использованием конкатенированных аминокислотных последовательностей основного капсидного белка, большой субъединицы терминазы, ДНК-полимеразы и РНК-полимеразы, кластеризует бактериофаги Drulisvirus и фаг KPPK108.1 в одну монофилетическую группу (рис. 4). Состав генов и организация генома фага KPPK108.1 в целом напоминают бактериофаг Escherichia phage T7 и другие фаги семейства Autographiviridae (рис. 5) и практически идентичны таковым у других представителей Drulisvirus. Интересной особенностью обладает продукт гена 8. Структурное моделирование показало необычную Г-образную форму белка с C-концевой тубулообразной частью (рис. 6.1). Эта часть характеризуется увеличенным по сравнению со средним количеством положительно заряженных аминокислотных остатков. Моделирование электростатического поля продемонстрировало существенный (до –5) отрицательный поверхностный заряд C-концевой части продукта гена 8 (рис. 6.2).

Биоинформатический анализ генома фага KPPK108.1 выявил наличие генов, кодирующих белки хвостового адаптора и хвостового шипа. Структура белка хвостового шипа была моделирована и проанализирована (рис. 6). Поиск похожих структур показал высокую степень сходства хвостового шипа фага KPPK108.1 и хвостового шипа фага Enterobacteria phage –92 (PDB структура 6E0V) (рис. 6), обладающего коланидазной активностью, подтвержденной экспериментально [23].

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Значение общегеномного сходства фагов KPPK108.1 и KP34 выше 70% границы рода вместе с результатами филогенетического анализа с использованием конкатенированных последовательностей консервативных генов указывает на принадлежность бактериофага Klebsiella phage KPPK108.1 к роду Drulisvirus подсемейства Slopekvirinae семейства Autographiviridae. Этот вывод подтверждают и результаты межгеномного сравнения. Небольшие различия в организации геномов могут быть объяснены рекомбинационными событиями, сопровождавшими эволюцию бактериофагов Klebsiella, что подтверждается присутствием в геноме KPPK108.1 и других родственных бактериофагов генов NHNэндонуклеазы. Строение генома фага KPPK108.1 типично для бактериофагов семейства Autographivirinae и характеризуется наличием региона «ранних генов» [24], который включает ген 8, кодирующий гипотетический белок с необычной Г-образной третичной структурой.

Хотя функция этого белка была определена не поиском гомологов с помощью BLAST или схожих белков с помощью сравнения мотивов HMM, исходя из распределения поверхностного заряда можно было бы предположить, что этот белок мимикрирует нуклеиновую кислоту, как это встречается у белков Ocr, также расположенных в раннем регионе геномов других автографивирид и мимикрирующих ДНК [25, 26]. Было показано, что белок Ocr эффективно ингибирует систему рестрикции-модификации BREX, облегчая течение фаговой инфекции [27].

Биоинформатический анализ генома фага KPPK108.1 позволяет предсказать состав адсорбционного аппарата, который включает адаптор хвостового шипа и основной белок хвостового шипа, обладающий ферментативной активностью. По всей видимости, белок хвостового шипа является рецептор-связывающим белком (receptor-binding protein, RBP), определяющим специфичность и спектр хозяев фага [28]. Структурный анализ белка хвостового шипа свидетельствует о наличии деполимеризующей активности в отношении полисахарида, предположительно родственного колановой кислоте E. coli. Субстратом коланидаз является колановая кислота — внеклеточный полисахарид, состоящий из нескольких видов углеводных остатков (например, L-фукозы, D-глюкозы, D-галактозы и D-глюкуроновой кислоты), секретируемый в среду бактериями семейства Enterobacteriaceae [29]. Коланидазы были обнаружены в составе фаговых RBP сравнительно недавно [30], и присущи ряду вирулентных бактериофагов, относящихся к эволюционно далеким группам, включая подо- и миовирусы [23, 30], часть из которых показала высокую эффективность в составе фаговых коктейлей для фаговой терапии [30]. Необходимо установить структуру капсулярного полисахарида K. pneumoniae типа K108, чтобы прояснить вопрос о сходстве этого полимера с колановой кислотой.

ВЫВОДЫ

Бактериофаг Klebsiella KPPK108.1 представляет собой вирулентный бактериофаг, относящийся к роду Drulisvirus семейства Autographiviridae. Детальный биоинформатический анализ свидетельствует о литическом образе инфекционного цикла фага и позволяет предсказать структуру адсорбционного аппарата фага из адаптора хвостового шипа и белка хвостового шипа, обладающего коланидазной активностью. Предсказанные характеристики бактериофага KPPK108.1 свидетельствуют о перспективности его применения в составе фаговых коктейлей в целях фаговой терапии. Насколько нам известно, это первый полностью охарактеризованный фаг, специфичный капсулярному типу KL108.