Инсульт является важнейшей причиной заболеваемости, инвалидности и смертности населения многих стран. При сахарном диабете 2-го типа (Т2СД) риск развития ишемического инсульта (ИИ) увеличивается в 2–2,5 раза, риск смерти от инсульта в 3 раза [1, 2]. Гипергликемия в первые часы инсульта может явиться стрессовой реакцией организма на ишемию мозга [3]. Выраженность нейрогормональных и метаболических нарушений отражает тяжесть течения ИИ и влияет на прогноз заболевания [4].

Установлена высокая частота атеросклероза внутренних сонных артерий (ВСА) у пациентов с Т2СД по сравнению с пациентами без него. В связи с этим у лиц с Т2СД наиболее часто патогенетическим подтипом ИИ является атеротромботический инсульт [5].

Одним из ведущих факторов патогенеза ИИ является окислительный стресс. Накопление продуктов свободнорадикального окисления вызывает блок SH-групп ферментов и их инактивацию, гидроксилирование ДНК, ее фрагментацию и обусловленную этим дестабилизацию клеточных мембран [6, 7].

Низкомолекулярные аминотиолы (НМАТ) высокочувствительны к окислительному стрессу. В плазме крови преобладают их окисленные формы; отношение восстановленных форм к общему содержанию каждого тиола характеризует редокс-статус (РС). В проведенных экспериментальных и клинических исследованиях установлено снижение уровня восстановленных форм в остром периоде ИИ, что может свидетельствовать об активации окислительных процессов при недостаточности антиоксидантной защиты [8, 9].

У больных с Т2СД выявлено как увеличение уровня общего гомоцистеина (оГцис), так и снижение уровня общего глутатиона (оГлн) у женщин [10].  В других работах при Т2СД было отмечено снижение редокс-статуса глутатиона

(РС Глн) в плазме [11] и цельной крови [12]. При ишемической болезни сердца (ИБС) установлена обратная зависимость между гипергликемией и уровнем оГлн в плазме крови (r = –0,328; р = 0,011), кроме того, показано, что Т2СД является фактором, оказывающим дополнительное отрицательное влияние на уровень оГлн [13]. Возможно, что низкий уровень оГлн в плазме крови связан с повышением активности γ-глутамилцистеинтрансферазы при гипергликемии [10]. Было также показано, что в эритроцитах больных Т2СД наблюдается снижение cинтеза Глн и, возможно, возрастает скорость его потребления [14].

Цель исследования — оценить влияние Т2СД на общее содержание (о), восстановленные формы (в) и РС НМАТ в плазме крови у пациентов с ИИ.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В исследование были включены 175 пациентов с ИИ в бассейне ВСА (89 мужчин и 86 женщин в возрасте 46–84 лет (средний возраст 62 (55–69) года), поступившие в Научный центр неврологии (Москва, Россия) в первые 10–24 ч с момента возникновения неврологических нарушений.  В основную группу вошли 68 пациентов (41,2% мужчин) с ИИ и Т2СД.  Группу сравнения составили 107 пациентов (57% мужчин) с ИИ и стрессовой гипергликемией, контрольную группу — 31 пациент (54,8% мужчин) с хронической цереброваскулярной патологией (ЦВП) без СД (средний возраст 69 (60–75) лет).

Критерии включения: возраст от 45 лет до 85 лет; первичный ИИ; время поступления — первые 6–24 ч с момента развития неврологической симптоматики; инфаркт в бассейне ВСА, подтвержденный данными нейровизуализации; Т2СД или стрессовая гипергликемия в момент поступления; информированное согласие на участие в исследовании.

Критерии исключения: СД 1-го типа; острый инфаркт миокарда; декомпенсированная почечная, печеночная, дыхательная недостаточность; сердечная недостаточность III–IV ФК.

Всем пациентам проводили общеклиническое и неврологическое обследования.

Оценку тяжести неврологических нарушений при поступлении больных и в конце острого периода ИИ проводили при помощи шкалы инсульта Национальных институтов здоровья (National Institutes of Health Stroke Scale (NIHSS) [15]. Неврологические нарушения соответствуют легкой степени тяжести при NIHSS < 7; средней степени тяжести при 7 ≤  NIHSS < 14; тяжелому инсульту при 14 ≤ NIHSS. Повседневную деятельность и самообслуживание больных при поступлении и в 21-е сутки ИИ оценивали с помощью индекса Бартел (Bartel Index, BI) [16], функциональный статус — с использованием модифицированной шкалы Рэнкина (modified Renkin scale, mRs). Способности выполнять все обычные обязанности и участвовать в повседневной деятельности соответствовала оценка к 21 суткам 0–2 баллов по данной шкале, неблагоприятному функциональному прогнозу — ≥ 3 баллов [17].

Диагноз ИИ устанавливали на основании клинической картины и данных магнитно-резонансной томографии (Magneton Symphony и Magneton Avanto, 1,5 T) в стандартных режимах (Т2, Т1, Т2-FLAIR, T2*). Исследование церебральных артерий проводили с помощью МРангиографии в режиме 3D-TOF. Дуплексное исследование артерий головного мозга выполняли на приборе Philips iU22 (Philips; Нидерланды).

Патогенетический подтип ИИ определяли в соответствии с международными критериями TOAST (Trial of ORG 10172 in Acute Stroke Treatment) [18].

Исследование фибриногена проводили на автоматическом коагулометре ACL 9000 (Instrumentation Laboratory; CША).

Уровни глюкозы (гексокиназным методом), гликированного гемоглобина (НbA1c) (иммунотурбометрическим методом), общего холестерина, липопротеинов низкой плотности, мочевины и креатинина исследовали на биохимическом анализаторе Konelab 30i (Thermo Fisher Scientific; Финляндия) с использованием наборов реагентов (Randox; Великобритания).

Всем пациентам с ИИ проводили определение гликемии при поступлении. HbA1c исследовали при гликемии от 6,1 ммоль/л и более при поступлении. Уровень HbA1c отражает гликемию за последние три месяца. Диагноз Т2СД устанавливали на основании критериев Американской диабетической ассоциации [19].

Всем пациентам с ИИ осуществляли базисную терапию, включающую гипотензивные, антитромботические и гиполипидемические препараты. Сахароснижающую терапию проводили под контролем гликемии.

Содержание НМАТ определяли, как описано ранее [8]. Венозную кровь собирали в пробирки с цитратом натрия (0,38%) и центрифугировали при 3000 g в течение 3 мин. Плазму для анализа общего содержания НМАТ отбирали и хранили при –20 °C. Для дериватизации 100 мкл плазмы смешивали с 10 мкл 50 мМ дитиотеритола и 10 мкл внутреннего стандарта (пеницилламин 0,45 мМ). Растворы дитиотреитола и пеницилламина содержали 10 мМ ЭДТА-Na. Смесь инкубировали при 37 °C в течение 15 мин. Затем вносили в пробу 5,5'-дитиобиснитробензойную кислоту (600 мкл, 20 мМ) в этаноле и инкубировали смесь при 4 °C в течение 30 мин. После центрифугирования в течение 5 мин при 15 000 g осушали супернатант под вакуумом при 60 °C в течение 2 ч. Перед анализом осадок ресуспендировали в 30 мМ NaOH.

Для определения восстановленных форм НМАТ к плазме (100 мкл) добавляли к 25 мкл раствора 5-сульфосалициловой кислоты (230 г/л) сразу после ее выделения, замораживали и хранили при –80 °C. Перед дериватизацией образцы центрифугировали в течение 5 мин при 15 000 g. Затем 40 мкл супернатанта смешивали с 40 мкл 20 мМ 5,5'-дитиобиснитробензойной кислоты и с 2,5 мкМ пеницилламина в 0,4 М Na-фосфатном буфере (pH 8,0). Затем добавляли 10 мкл 1 М NaOH, раствор перемешивали в течение 5 с и добавляли 12,5 мкл 1 М HCl с 20 мМ N-этилмалеимида для остановки реакции.

Для анализа использовали хроматографическую систему Waters ACQUITY (Waters, Милфорд; США), оснащенную УФ-детектором PDA (поглощение 330 нм; разрешение 10,8 нм; частота 5 с-1) и колонку Poroshell 120 SBC18 (2,8 мкм, 150 мкм — 2 мм) (Agilent; США). Температуру колонки и образцов поддерживали на уровне 50 и 10 °C соответственно. Объем ввода образца составлял 10 мкл, а скорость потока составляла 0,2 мл/мин. Элюент A — 0,1 М ацетат аммония с 0,12% (об./об.) HCOOH, элюент Б — ацетонитрил. Хроматографию проводили с элюированием Б с линейным градиентом от 2,5 до 10% в течение 5 мин. Регенерацию выполняли с использованием 70% Б в течение 1,5 мин, уравновешивание — с помощью 2,5% Б в течение 4 мин.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программного пакета IBM SPSS Statistics Version 20.0 (IBM Corp.; США). Для получения дискриминативных данных использовали модуль «описательные статистики». Количественные признаки описывали с помощью медианы, 25%- и 75%-го квартилей (Ме (Q₁–Q₃%)), качественные данные представляли в виде абсолютных частот и процентов. При сравнении групп по количественному признаку использовали тесты Краскела–Уоллиса и Манна–Уитни. Для обнаружения прогностических факторов использовали методы логистической регрессии. Отбор переменных проводили методом условного включения переменных. Для оценки качества модели логистической регрессии использовали ROC-анализ и вычисление статистических характеристик тестов (чувствительность, специфичность). Для оценки прогностической силы модели проводили оценку площади под кривой AUC (Area Under Curve). Для определения оптимального порога отсечения учитывали требование соблюдения баланса между чувствительностью и специфичностью. Для всех сравнений и тестов применяли двусторонний критический уровень значимости, равный 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основные характеристики пациентов с ИИ и хронической ЦВП представлены в табл. 1. Группы пациентов не различались по возрасту, полу, показателям липидного и белкового обмена. Пациенты с ИИ до включения в исследование постоянно принимали гипотензивные препараты в 46 случаях (26,3%), антиагреганты — в 22 случаях (12,6%), антикоагулянты — в 11 (6,3%) и статины — в 8 случаях (4,6%). В группе с хронической ЦВП профилактическую терапию до включения пациентов в исследование не проводили.

Инсульт, обусловленный атеротромбозом ВСА, был диагностирован в 35 случаях (20%), кардиогенный эмболический инсульт — в 50 (28,6%), лакунарный инсульт, обусловленный патологией мелких артерий, — в 90 случаях (51,4%).

При атеротромботическом инсульте имели место ступенеобразное развитие неврологических нарушений и возникновение одиночных больших инфарктов корковоподкорковой локализации вне областей смежного кровоснабжения.

Причинами тромбоэмболии артерий мозга из сердца были эмбологенные формы ИБС (пароксизмальная форма фибрилляции предсердий в 29 случаях (58%), постоянная форма фибрилляции предсердий — в 17 случаях (34%), постинфарктный кардиосклероз — в 4 случаях (8%)). У 34 пациентов фибрилляция предсердий была диагностирована впервые в остром периоде ИИ. Клинически для кардиогенного эмболического инсульта было характерно внезапное появление стойкой неврологической симптоматики. По данным МРТ корковоподкорковые инфаркты локализовались преимущественно в бассейне средней мозговой артерии. 

ИИ, обусловленный гипертоническими малыми глубинными инфарктами головного мозга, характеризовался постепенным нарастанием неврологических нарушений в виде лакунарных синдромов. Малые глубинные инфаркты локализовались в базальных ядрах, белом веществе полушарий большого мозга, внутренней капсуле. У 71 пациента (78,9%) с лакунарным инсультом выявлена артериальная гипертония 3-й степени, у 19 пациентов (21,1%) — артериальная гипертония 2-й степени.

Исходная оценка тяжести ИИ позволила выявить неврологические нарушения легкой степени (NIHSS < 7) в 92 случаях (52,6%), средней степени (7 ≤ NIHSS < 14) — в 67 случаях (38,3%), тяжелой степени (14 ≤ NIHSS) — в 16 случаях (9,1%) (см. табл. 1).

Уровень гликемии при поступлении среди пациентов с ИИ составил 6,50 (6,22–7,72) ммоль/л.

Проведенный анализ НМАТ показал, что в группе ИИ по сравнению с пациентами группы хронической ЦВП показатели оГлн, вГлн, РС Глн были значительно ниже (р < 0,0001), а вГцис и РС Гцис — выше (р = 0,018 и р = 0,041) (табл. 2).

При анализе общей выборки уровень вГцис у мужчин с ИИ был выше, чем у женщин (0,17 (0,14–0,24) мкМ против 0,15 (0,12–0,21) мкМ; p = 0,026).

В группе пациентов с ИИ, включенных в исследование, Т2СД был диагностирован в 68 случаях, стрессовая гипергликемия — в 107 случаях (табл. 3). Длительность заболевания Т2СД менее 5 лет отмечена у 22 пациентов (32,4%), более 5 лет — у 46 (67,6%) пациентов. В группе пациентов с ИИ в сочетании с Т2СД уровень HbA1c составил 7,8% (6,8–9,6). Уровень менее 6,5% определен у 107 (61,1%) пациентов, от 6,5 до 6,9% — у 32 (18,3%), от 7 до 7,9% — у 20 (11,4%), от 8% и выше — у 16 (9,2%).  

Инсульт, обусловленный тромбоэмболией артерий мозга из сердца, чаще отмечали среди пациентов с Т2СД (р < 0,0001), атеротромботический инсульт — среди пациентов со стрессовой гипергликемией (р < 0,0001). Отличий в частоте лакунарного инсульта между группами не выявлено (р = 0,162). По степени тяжести неврологических нарушений и функциональному статусу в остром периоде инсульта обследованные группы пациентов были сопоставимы (см. табл. 3). 

В группе пациентов с ИИ в сочетании с Т2СД выявлено значительное снижение уровней оЦис, оГлн и оГцис по сравнению с пациентами группы ИИ и стрессовой гипергликемии (р < 0,0001). При этом уровни вЦис, вГлн и вГцис не имеют достоверных различий между группами пациентов с Т2СД и cтрессовой гипергликемией. Возможно, что с этим связаны более высокие показатели РС Цис, РС Глн и РС Гцис в группе пациентов с ИИ и Т2СД (р < 0,0001) (табл. 4).

Статистически значимой связи между уровнем глюкозы крови и уровнями НМАТ не выявлено как в общей группе пациентов с ИИ, так и в отдельных группах пациентов (Т2СД и стрессовой гипергликемии).

При разделении пациентов с ИИ в сочетании с Т2СД в зависимости от степени функционального восстановления к 21 суткам анализ НМАТ показал, что в группе пациентов с легкими ограничениями повседневной деятельности (mRS — 0 до 2 баллов) показатели РС Цис и РС Глн были значительно выше, по сравнению с пациентами с тяжелыми нарушениями функциональной активности (РС Цис — 5,26 против 3,51 мкМ, р = 0,043; РС Глн — 4,92 против 2,79 мкМ, р = 0,018) (табл. 5).

Для выявления маркеров неблагоприятного прогноза (mRS ≥ 3) у пациентов с ИИ в сочетании с Т2СД использовали методы логистической регрессии. Прогностическая значимость РС Глн представлена на рисунок.  ROC-анализ 68 пациентов с ИИ в бассейне ВСА в сочетании с Т2СД показал, что пороговый уровень РС Глн ≤ 4,06% в первые сутки ИИ является предиктором неблагоприятного прогноза ИИ (mRS ≥ 3 баллов через 21 день после ИИ). Чувствительность модели составила 63,6%, специфичность — 69,6%, площадь под ROC-кривой — 0,74 ± 0,09, что соответствует хорошему качеству для прогнозирования функционального восстановления при ИИ.

ОБСУЖДЕНИЕ  РЕЗУЛЬТАТОВ

Хроническую гипергликемию при Т2СД рассматривают как один из неблагоприятных факторов риска развития ИИ. Глюкоза — химическое соединение, активно вступающее в реакции взаимодействия с белками и липидами с образованием конечных продуктов гликозилирования [20, 21]. Гипергликемия, хронический окислительный стресс, митохондриальная дисфункция при Т2СД приводят к дисфункции эндотелия, нарушению ангиогенеза, активации гемостаза, повышенной проницаемости гематоэнцефалического барьера [22]. Гипергликемия резко усиливает окислительные процессы путем снижения уровней витаминов Е, С и других антиоксидантов (мочевой кислоты) [11], а также является дополнительным фактором, стимулирующим и облегчающим образование активных форм кислорода [23].   

Хроническую гипергликемию определяют по степени связывания гемоглобина с глюкозой и процентному содержанию НbA1c.  Чем выше уровень НbA1, тем более высокие значения гликемии отмечали у пациента в последние три месяца. В норме этот показатель не превышает 6,5%. Увеличение НbA1c на каждый 1% повышает риск развития инсульта на 17% [24]. В проведенном нами исследовании длительность Т2СД составила 7 лет, уровень НbA1c — 7,8 %.

При ИИ воздействие гипергликемии на головной мозг опосредовано как нарушением церебральной микроциркуляции, так и токсическим воздействием на ткань мозга. С гипергликемией связывают накопление лактата, образование свободных радикалов, развитие цитотоксического отека мозга, нарушение проницаемости гематоэнцефалического барьера [25, 26].

Гипергликемия при Т2СД и ИИ приводит к истощению антиоксидантной системы и нарушению всех видов тканевого обмена. Показателем окислительновосстановительного гомеостаза в клетках и тканях и индикатором антиоксидантного потенциала плазмы крови служит соотношение «тиолы / дисульфиды» или «SH / SS» [11, 27].  

Глутатион — тиолсодержащий эндогенный трипептид, образованный цистеином, глутаминовой кислотой и глицином. Он синтезируется непрерывно, однако с относительно низкой скоростью [28]. Глутатион является также фактором, регулирующим метаболизм глюкозы у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями [13]. Полиморфизм глутатион-S-трасферазы, фермента глутатион-опосредованной детоксикации ксенобиотиков, способствует раннему развитию сердечно-сосудистых осложнений при сахарном диабете [29].

При остро возникшем окислительном стрессе уровень общего глутатиона (Gsh) снижается, уровень окисленного глутатиона увеличивается (GSSG), в результате чего ускоряется цикл Gsh / GSSG [27].

Гипергликемия в остром периоде ИИ связана с неблагоприятным функциональным прогнозом [4], однако эффективность влияния сахароснижающей терапии с применением инсулина на тяжесть и исход инсульта остается недоказанной [1].

Полученные результаты показывают, что Т2СД у пациентов с ИИ ассоциируется с резким снижением оЦис, оГлн и оГцис, вГлн и РС Глн, но при этом наблюдается повышение РС Цис и РС Гцис в плазме крови.

Возможно, что хронический окислительный стресс приводит к истощению НМАТ в плазме крови. Необратимая утилизация Глн может происходить при высокой интенсивности окислительного стресса, когда Глн экспортируется из клеток, чтобы предотвратить значительный сдвиг в окислительно-восстановительном равновесии [28]. По-видимому, это основной механизм, объясняющий отсутствие связей между оГлн, оЦис и оГцис, а также оГлн и вГлн. Статистически значимых связей между уровнями глюкозы крови и НМАТ также не выявлено. Это свидетельствует о том, что изменения в метаболизме НМАТ при Т2СД опосредованы негликемическими механизмами.

Уровень РС Глн, равный 4,06% и менее в первые сутки ИИ, является предиктором неблагоприятного прогноза ИИ (mRS ≥ 3 через 3 недели после ИИ). В связи с этим поиск подходов к коррекции метаболизма глутатиона у пациентов с Т2СД можно рассматривать как потенциальную задачу терапии в остром периоде ИИ.

ВЫВОДЫ

Т2СД является фактором, оказывающим значительное влияние на метаболизм НМАТ у пациентов с ИИ. Несмотря на отсутствие связи между уровнями глюкозы и НМАТ, наличие Т2СД было ассоциировано со снижением общего содержания гомоцистеина, цистеина и глутатиона, а редокс-статус глутатиона, равный 4,06% и менее в первые сутки ИИ, был связан с неблагоприятным функциональным прогнозом.  Коррекция метаболизма глутатиона при ИИ в сочетании с Т2СД может оказывать положительное влияние на течение ИИ.