Туберкулез, вызываемый микобактериями туберкулезного комплекса, представляет собой глобальную проблему для современного здравоохранения. По экспертным оценкам ВОЗ, в 2020 г. число умерших от заболевания возросло по сравнению с 2019 г. на 100 тыс. человек и составило 1,3 млн. В первую очередь это связано с уменьшением расходов на диагностику и лечение туберкулеза и повышенной нагрузкой на систему здравоохранения, вызванной пандемией COVID-19. Ожидается, что негативная тенденция сохранится в ближайшие несколько лет [1].

Несмотря на применение противотуберкулезной терапии, успех лечения туберкулеза, осложненного лекарственной устойчивостью, не превышает 60%. Повсеместно отмечаются случаи возникновения резистентности к новым препаратам, таким как линезолид, бедаквилин, клофозамин и т. д. [2]. В связи с этим актуальным становится поиск новых лекарственных препаратов, отличающихся принципиально иным механизмом действия, а также мишеней для противотуберкулезной терапии.

Одной из мишеней могут стать G-квадруплексы (G4) — неканонические вторичные структуры, формирующиеся в физиологических условиях гуанинсодержащими последовательностями ДНК и РНК. Структурная единица G4 — G-квартет — образован четырьмя гуаниновыми основаниями. Между собой G-квартеты удерживаются π-π-стекинг-взаимодействием, а также дополнительно стабилизируются катионами металлов [3].

Представленные структуры достаточно хорошо изучены у эукариотических организмов и играют важную роль в регуляции и поддержании стабильности генома [4]. В 2000-х гг. потенциальные квадруплекс-формирующие последовательности (putative quadruplex sequence, PQS) были обнаружены в геномах многочисленных бактерий и архей, однако их функциональная роль до сих пор до конца не исследована [5]. Установлено, что G4 могут влиять на различные аспекты физиологии бактерий, в том числе на выживание в неблагоприятных условиях, взаимодействие с макроорганизмом у патогенных бактерий, на антигенную изменчивость и т. д. [6].

G4-лиганды, часто представленные низкомолекулярными соединениями, способны связываться с квадруплексными последовательностями, тем самым влияя на их термическую стабильность, что в дальнейшем может приводить к нарушению действия различных белковых факторов и ферментов, функционально связанных с ДНК или РНК, и подавлять или активировать транскрипцию и трансляцию. К числу наиболее известных лигандов принадлежат производное акридина BRACO-19 и катионный порфирин TMPyP4 (рис. 1). Возможность применения G4-лигандов в качестве потенциальных антимикробных соединений продемонстрирована для таких распространенных патогенов, как Vibrio cholerae, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae и Mycobacterium tuberculosis [6].

Для микобактерий туберкулеза, имеющих высокий GC-состав и значительную плотность PQS, исследование влияния G4-стабилизирующих лигандов на патоген представляется весьма перспективным. На бактериях уже показан ингибирующий эффект микромолярных концентраций известных лигандов c-exNDI-2, BRACO-19 и TMPyP4. В случае с c-exNDI-2 и BRACO-19 дополнительно продемонстрирован стабилизирующий эффект на отдельные квадруплексные последовательности, находящиеся в промоторных областях генов [7]. Для TMPyP4 установлено стабилизирующее действие на квадруплексы в генах, ассоциированных с вирулентностью [8].

Следует подчеркнуть, что во всех приведенных работах было исследовано влияние лигандов на отдельные G4-формирующие последовательности, причем наличие G4 всегда приводило к уменьшению экспрессии соответствующего гена под действием соединения. Ранее в нашей лаборатории был проанализирован транскриптомный ответ модельного микроорганизма Mycobacterium smegmatis MC²155 в ходе воздействия ингибирующих концентраций лигандов TMPyP4 (4 мкМ) и BRACO-19 (10 мкМ). Суммарно, изменение экспрессии было выявлено для 10 и 12% генов бактерии под действием TMPyP4 и BRACO-19 соответственно, однако статистической связи между дифференциально экспрессирующимися генами и наличием PQS обнаружено не было [9].

Целью работы было провести анализ влияния субингибирующих концентраций лигандов TMPyP4 (2 мкМ) и BRACO-19 (5 мкМ) на экспрессионный профиль M. smegmatis MC²155 и его сравнение с ранее полученными данными.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальный штамм и условия культивирования

В исследовании использовали штамм Mycobacterium smegmatis MC²155. Культивировали при 37 °С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО₂, с использованием жидкой среды Миддлбрук 7H9 (HiMedia; Индия) или твердой среды Миддлбрук 7H11 (HiMedia; Индия) с добавлением 0,5% глицерина и 10% ростовой добавки Middelbrook OADC (HiMedia). Замороженные клетки высевали из музея на чашки и выращивали в течение 24 ч перед посевом в жидкую среду.

Культивирование бактерий для транскриптомного анализа проводили согласно предыдущей публикации [9]. Клетки M. smegmatis выращивали до оптической плотности 0,47 о.е, измеренной при 570 нм, что соответствовало середине экспоненциальной фазы, и переносили в пробирки объемом 5 мл (NUOVA APTACA; Италия). В пробирки добавляли G4-стабилизирующие соединения до конечной концентрации, соответствующей половине минимальной ингибирующей концентрации (5 мкМ для BRACO-19 и 2 мкМ для TMPyP4). К контрольным образцам добавляли такой же объем ДМСО (1% по объему). Бактериальные клетки инкубировали в течение 4 ч (время деления клеток описано ранее [10]) при 37 °C во влажной атмосфере, содержащей 5% СО₂ в термостатируемом шейкере (250 об./мин). Эксперимент проводили в трех биологических повторах.

Выделение РНК и транскриптомный анализ

Экстракцию РНК и транскриптомное исследование проводили по методике, описанной ранее [9]. Бактериальные клетки собирали центрифугированием (8000 g, 10 мин, 4 °C), культуру промывали буфером PBS, затем добавляли RNAprotect Bacteria Reagent (Qiagen; США) для стабилизации РНК. Разрушение клеток проводили в двухмиллилитровых пробирках Lysing Matrix B на приборе MagNA Lyzer (Roche; Швейцария) в течении 30 с. Далее РНК выделяли на автоматической станции King Fisher (Thermo Fisher Scientific; США) набором MagMAX mirVana Total RNA Isolation Kit (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с протоколом производителя. Тотальную РНК обрабатывали набором TURBO DNA-free kit (Thermo

Fisher Scientific) в объеме 50 мкл. Дополнительную очистку РНК проводили Agencourt RNA Clean XP kit (Beckman Coulter; США).

Для приготовления библиотек использовали 300 нг тотальной РНК. Удаление рибосомной РНК проводили набором Ribo-Zero Plus rRNA Depletion Kit (Illumina; США) в соответствии с протоколом производителя. Набор

NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit (NEB; США) был использован для приготовления транскриптомных библиотек. Далее библиотеки в эквимолярном количестве смешивали, разводили до конечной концентрации 12 пМ и использовали для высокопроизводительного секвенирования на платформе HiSeq 2500 Illumina наборами HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 циклов) и HiSeq SR Rapid Cluster Kit v2 с добавлением в качестве контроля 1% Phix (Illumina). Данные секвенирования депонированы в NCBI под номером PRJNA765512.

Биоинформатический анализ

Секвенированные чтения были картированы на геном M. smegmatis MC2155 (CP000480.1) с использованием HISAT2 [11]. Программное обеспечение SAMtools [12] использовали для сортировки и преобразования файлов SAM в BAM и их последующего индексирования. Качество картирования и покрытие по генам оценивали с помощью QualiMap [13], отдельные отчеты объединяли с помощью MultiQC [14].

Картированные чтения были отнесены к генам с помощью featureCounts [15]. Дифференциальный анализ экспрессии генов выполняли с использованием пакета edgeR [16] для R. Гены с отсечкой частоты ложных обнаружений (FDR) 0,05 и порогом кратности изменения (log2FC) |1| (т. е. ≥ |2|-кратное изменение) считали дифференциально экспрессируемыми. Для межвыборочного сравнения подсчеты были нормализованы с использованием усеченного среднего значения M с поправкой на длину гена [17]. Дальнейший анализ функционального обогащения терминов GO и путей KEGG для дифференциально экспрессируемых генов был выполнен с использованием пакета clusterProfiler [18], категории считали обогащенными, если FDR ≤ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Влияние G4-стабилизирующих лигандов BRACO-19 и TMPyP4 на экспрессию генов M. smegmatis MC²155

Для оценки влияния лигандов BRACO-19 и TMPyP4 на экспрессию генов клетки M. smegmatis обрабатывали субингибирующими концентрациями соединений (5 мкМ и 2 мкМ соответственно) в течение 4 ч. Результаты РНКсеквенирования сравнивали между собой, а также с ранее полученными данными.

Метод главных компонент показал кластеризацию повторов в каждом эксперименте, а также выраженную вариацию между обоими лигандами и контролем (рис. 2A). Однако в ходе анализа не было обнаружено существенной вариации между различными концентрациями одного лиганда.

Под действием BRACO-19 было идентифицировано 589 (316↑; 273↓) и 865 (555↑; 310↓) дифференциально экспрессированных генов, для 5 мкМ и 10 мкМ соответственно (рис. 2Б). Напротив, в случае с TMPyP4 обнаружено снижение числа дифференциально экспрессированных генов с 754 (337↑; 417↓) до 702 (359↑; 343↓) для концентраций 2 мкМ и 4 мкМ соответственно.

Влияние лигандов на экспрессию генов, связанных с потенциальными квадруплекс-формирующими последовательностями

Связь между изменением уровня экспрессии генов под действием лигандов и наличием потенциальных квадруплекс-формирующих последовательностей цепях гена (n = 665) для 615 генов, PQS в смысловой цепи (n = 267) для 255 генов, PQS в матричной цепи (n = 398) для 360 генов, PQS в межгенных регионах (n = 53; 14/53 для двух генов), PQS в промоторных областях (n = 17) [9]. В ходе анализа для двух концентраций каждого из лигандов по сравнению с контрольными образцами не было выявлено статистически значимых различий ни для одной из представленных групп (Games-Howell post-hoc test padj. >> 0,05; рис. 3).

Число дифференциально экспрессированных генов, ассоциированных с квадруплексами, увеличивалось (58 → 75) с повышением концентрации BRACO-19 (5 мкМ → 10 мкМ), но уменьшалось (72 → 59) при повышении концентрации TMPyP4 (2 мкМ → 4 мкМ) (рис. 4).  

Изменения в системе репликации и репарации под действием лигандов

Анализ результатов РНК-секвенирования показал, что под действием лигандов BRACO-19 и TMPyP4 профили генов репликативной и репарационной систем M. smegmatis существенно различались (таблица). Так, воздействие BRACO-19 приводило к повышению экспрессии генов, кодирующих ДНК-гиразы, ДНК-полимеразы транслезионного синтеза (ТЛС), хеликазы и белки системы репарации. ТЛС ДНК-полимеразы являются белками SOSответа и отвечают за активное восстановление хромосомы [19]. ДНК-гиразы (ДНК-топоизомеразы типа II) участвуют в синтезе ДНК, катализируя введение отрицательных суперскрученных витков [20]. Метилтрансфераза Ogt и ДНК-гликозилаза AlkA противодействуют повреждению ДНК в процессе алкилирования [21]. Стоит отметить, что воздействие субингибирующей концентрации BRACO-19 (5 мкМ) приводило к изменению экспрессии меньшего числа генов. При этом повышение концентрации BRACO-19 вызывало увеличение экспрессии в два и более раза только генов ogt и alkA, что может свидетельствовать о дозозависимом эффекте.

В случае с TMPyP4 единственным геном системы репарации с повышенной экспрессией был ssbb. Ген ssbb кодирует белок, который препятствует комплементарному спариванию одноцепочечной ДНК и участвует в процессах репликации и рекомбинационной репарации. Кроме того, экспрессия ДНК-хеликазы RecQ повышалась под действием обоих лигандов.

Изменения в метаболических путях M. smegmatis MC2155, вызванные G4-лигандами

Анализ GO-категорий и KEGG-путей выявил обогащение (FDR < 0,05; рис. 5) категорий, связанных с транскрипцией (GO:0006351), процессом биосинтеза аргинина (GO:0006526), транспортом (GO:0006810), метаболизмом серы (msm00920), биосинтезом нерибосомных пептидных сидерофоров (msm01053) и ABC-транспортерами (msm02010).

Как и в случае использования ингибирующих концентраций BRACO-19, воздействие меньшим количеством соединения привело к изменению единственного метаболического пути, связанного с железом. В ходе анализа была детектирована гиперэкспрессия генов, продукты которых ответственны за биосинтез сидерофоров, их транспорт и обратный захват. Напротив, гены, вовлеченные в запасание железа, имели пониженную экспрессию. Важно отметить, что по уровню обогащения ответ бактериальной клетки на субингибирующие концентрации лиганда был сильнее.

Использование лиганда TMPyP4 привело к гиперэкспрессии генов транскрипционных факторов (GO:0006351) и путей, участвующих в метаболизме серы (msm00920). Последний путь был связан с обогащением транспортных систем при разных концентрациях соединения: гены категорий GO:0006810, msm02010 и msm00920 в большинстве пересекались между группами. В свою очередь гены, вовлеченные в биосинтез аминокислоты аргинина, характеризовались уменьшенной экспрессией, которая не зависела от концентрации лиганда.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Данное исследование является продолжением проведенной ранее работы, в которой был рассмотрен транскриптомный ответ M. smegmatis на действие ингибирующих концентраций G4-стабилизирующих соединений BRACO-19 и TMPyP4 [9]. В представленной работе в ходе воздействия субингибирующих концентраций лигандов была предпринята попытка найти взаимосвязь PQS с изменением экспрессии генов, а также определить метаболические пути, являющиеся первичными ответчиками.

В ходе биоинформатического анализа было определено, что воздействие даже субингибирующими концентрациями лигандов приводит к изменению экспрессии существенного числа генов (рис. 2). Соединения показали противоположные результаты: увеличение концентрации лигандов приводило к увеличению (в случае с BRACO-19) и уменьшению (TMPyP4) числа дифференциально экспрессированных генов. Дальнейший анализ результатов не выявил убедительных доказательств значимого повышения или понижения регуляции генов, связанных с PQS, вызванных G4-лигандами, в том числе не удалось найти конкретных доказательств опосредованной лигандами G4-стабилизации, зависимой от концентрации (рис. 3). Кроме того, мы проанализировали общие эффекты лигандов, изучив специфические гены, которые имели схожий для обоих лигандов вектор изменения экспрессии. Однако даже для генов, регулируемых одинаково обоими лигандами, нам не удалось найти конкретных доказательств опосредованной лигандами G4-стабилизации и дозозависимых эффектов. В ходе анализа не удалось также подтвердить стабилизацию ранее описанных для M. tuberculsis квадруплексных структур, в связи с существенной разницей в геномных последовательностях M. tuberculosis и M. smegmatis.

При анализе KEGG-путей и GO-категорий дозозависимый эффект тоже не был обнаружен. Все эффекты, наблюдаемые на уровне транскриптома и вызванные воздействием лигандов в субингибирующих концентрациях, коррелировали с таковыми при ингибирующих, результаты воздействия которых были опубликованы ранее [9] (рис. 5). Стоит отметить лишь систему метаболизма железа в случае с BRACO-19, показавшую больший уровень обогащения при воздействии субингибирующими концентрациями соединения. Данная система активируется в условиях дефицита железа, при окислительном и нитрозативном стрессах, а также в случае потребности в металлопротеинах, участвующих в репликации и репарации ДНК [22]. При субингибирующей концентрации BRACO-19 был перепредставлен путь биосинтеза нерибосомных пептидных сидерофоров (msm01053), включающий гены синтеза микобактина. Рассмотрение других систем пути выявило постепенное повышение экспрессии генов с увеличением концентрации лиганда.

Анализ генов системы репликации и репарации выявил единственный ген recQ, экспрессия которого была увеличена под действием субингибирующих концентраций BRACO-19 и TMPyP4. Для E. coli показано, что хеликаза RecQ способна разрешать квадруплексные структуры, однако белок RecQ в M. smegmatis не является гомологом белка из E. coli и отсутствует в M. tuberculosis [23]. Данное наблюдение говорит о необходимости дальнейшего исследования функций белка RecQ M. smegmatis на предмет его способности разрешать G4-структуры.

В дополнение следует отметить, что транскрипционный ответ микроорганизмов представляет собой сложное явление, модулируемое множественными факторами, включая специфичные системы регуляции, воздействие факторов внешней среды и др. Так, к примеру, в последнее время получены свидетельства того, что при определенных условиях квадруплексы, помимо ингибирующего действия, могут выступать в роли активаторов транскрипции. Для эукариотических организмов показано, что квадруплексы могут служить центрами связывания факторов транскрипции, изменять архитектуру хроматина, стабилизировать R-петли и т. д. [24]. Эксперименты на бактериях показали также, что стабилизация квадруплексов посредством производных нафталин диимида способна не только ингибировать экспрессию у грамотрицательных микроорганизмов, но и усиливать ее у грамположительных, что указывает на двойственную природу квадруплекс-опосредованной регуляции [25]. Следует также отметить, что несмотря на то, что РНК-квадруплексы бактерий исследованы слабо, существуют свидетельства их наличия у микроорганизмов, как и их участия в регуляции биологических процессов [26]. Таким образом, разработка новых методов обнаружения и подтверждения квадруплексных структур, в том числе и протеомными экспериментами, в будущем обеспечит значительный прогресс в понимании роли отдельных G4 в регуляции генов.

ВЫВОДЫ

В настоящее время квадруплексы обнаружены в геномах значительного большинства микроорганизмов и, несомненно, являются важным элементом регуляции. Тем не менее в представленном исследовании не удалось выявить прямую связь между стабилизацией потенциальных квадруплексных структур и экспрессией генов, ассоциированных с ними. Оба соединения действовали на микроорганизм и приводили к изменению существенного количества транскриптов и метаболических путей. А обнаруженные изменения в генах факторов транскрипции и системы репликации и репарации, в случае использования лигандов, указывают на потенциальное действие на уровне РНК/ДНК, что согласуется с последними данными по квадруплекс-опосредованной регуляции генома. В свою очередь гиперэкспрессия гена хеликазы RecQ может служить основой для последующих исследований белка в качестве фермента, участвующего в разрешении квадруплексных структур.