Трансфекция  —  это процесс доставки экзогенной ДНК или РНК в эукариотическую клетку [1], широко используемый для наработки рекомбинантных белков [2] и введения репортерных конструкций для изучения самых разнообразных сигнальных путей [3–6]. Особенно важную роль в развитии метода сыграли исследования инфекционности вирусных геномов [7]. В настоящее время трансфекция незаменима для создания рекомбинантных вирусных штаммов, а также наработки лентивирусных  и аденоассоциированных вирусных векторов [8, 9].

Химические методы трансфекции классифицируют по типам реакционных агентов: фосфат кальция, полиэтиленимин (PEI), катионные полимеры (хитозан), липосомы, полиамидоамины (PAMAM) [10]. Все эти методы имеют свои преимущества и недостатки, выбор одного из них зависит от баланса цитотоксичности и эффективности введения генетической конструкции в клетку [11]. Существует широкий спектр готовых коммерческих решений, таких как Lipofectamine 3000, TurboFect, SuperFect, FuGENE HD [12], однако доступные и хорошо изученные методы кальций-фосфатной и катионной трансфекции все еще широко применяют [10].

Кальций-фосфатная трансфекция (КФТ) была впервые описана в 1973 г. [13], ее применяли для изучения инфекционности геномной ДНК аденовируса, однако сам механизм действия кальций-фосфатных преципитатов как трансфекционных комплексов был описан спустя 17 лет [14]. Было показано, что доставка экзогенной ДНК происходит через эндосомы напрямую в ядро. С этого момента началось активное применение метода. Традиционный протокол основан на копреципитации кальция и ДНК с формированием гидроксиапатита ДНК, который образуется в строгих химико-физических условиях перенасыщенного раствора, определенном диапазоне температур и концентраций кальция и фосфата. В связи с этим хорошая воспроизводимость протокола требует определенной методической подготовки [15–18]. На сегодняшний день существуют модификации стандартного метода КФТ, которые позволяют обойти ограничения традиционного способа [19, 20].

Другим доступным и распространенным методом трансфекции является катионная трансфекция с использованием полиэтиленимина  (polyethyleneimine, PEI) [10, 21], модификацией которой стало использование коммерчески доступного TurboFect. Один из определяющих факторов эффективности этого метода — соотношение ДНК/PEI, а также молекулярный вес PEI, уменьшение которого снижает цитотоксичность и эффективность, и наоборот. Коммерческие решения в большинстве своем предлагают PEI с молекулярным весом 25 кДа [22]. На рынке представлена также химическая модификация высокомолекулярного PEI со сниженной цитотоксичностью PEI «MAX» 40 кДа [10, 23]. Бесспорным преимуществом PEI являются его высокая трансфекционная активность, простота использования и универсальность. Один из серьезных недостатков — его непригодность к длительному хранению, обусловленная окислением PEI атмосферным кислородом, но предложено частичное решение данной проблемы [24]: разведение PEI в 0,2 М соляной кислоте позволяет продлить срок его хранения, а снизить уровень цитотоксичности позволяет разведение смеси PEI/ДНК в лактатном буфере.

Широко используемый трансфекционный реагент Lipofectamine 3000 обладает исключительной эффективностью, хорошо хранится при +4 °С, однако его цена для одного эксперимента по трансфекции 10 млн клеток составляет более 50 USD, данная ценовая категория трансфекционных реагентов в статье не будет рассмотрена.

Одновременная доставка нескольких генетических конструкций часто необходима в рамках решения задач синтетической биологии, создания рекомбинантных вирусных штаммов [8, 9], наработки лентивирусных и аденоассоциированных вирусных частиц, а также для широкого ряда методов биотехнологической промышленности. Подобные эксперименты связаны с трансфекцией большого объема клеток [25]. Применение готовых коммерческих наборов является удобным, воспроизводимым вариантом, однако их высокая стоимость и логистические проблемы, связанные с отсутствием отечественных аналогов, создают некоторую проблему выбора. Целью нашего исследования было сравнить эффективность КФТ, PEI и готового коммерческого реагента TurboFect для одновременной трансфекции тремя репортерными плазмидными конструкциями и количественно оценить эффективность методом проточной цитометрии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные линии

Линии HEK293T (ATCC #CRL-3216), BHK21 (ATCC #C-13), MRC5 (ATCC #CCL-171), CHO K1 (ATCC #CCL-61) были приобретены в коллекции ATCC (American Type Culture Collection; США), клеточные линии CHO DG-44 и HUH7 были любезно предоставлены А. В. Ивановым (ИМБ РАН; Россия) из коллекции клеточных линий лаборатории биохимии вирусных инфекций ИМБ РАН. Клетки культивировали на среде DMEM (Gibco, США) с добавлением 10% FBS (HyClone, США) в присутствии антибиотиков в стандартных концентрациях (пенициллин 50 ед./мл и стрептомицин 50 мкг/мл); CHO DG-44 культивировали на DMEM/F12 (PanEco; Россия) c 10% FBS и антибиотиками.

Плазмидные конструкции и трансфекционные реагенты

Плазмидные конструкции, кодирующие флуоресцентные белки (Katushka, BFP и eGFP), были клонированы в вектор pL-CMV-PL4-Puro, разработанный ранее в лаборатории пролиферации клеток (ИМБ РАН; Россия). После подтверждения успешной инсерции и секвенирования соответствующих фрагментов плазмидные конструкции были наработаны в бактериях штамма TOP-10 (New England Biolabs; США) в объеме 200 мл среды LB, после чего из бактериального осадка была выделена плазмидная ДНК с использованием набора Plasmid Midiprep 2.0 (Евроген; Россия). Чистоту полученной ДНК оценивали путем спектрометрического анализа (Nanodrop 2000; ThermoFisher, США) по соотношению поглощения на длинах волн 260 и 280 нм (для используемых образцов соотношение было от 1,9 и выше).

За сутки до трансфекции на шестилуночный планшет клетки были посеяны в количестве 1,5 × 10⁵ в объеме 4 мл среды DMEM с 10% фетальной бычьей сыворотки в условиях инкубатора при 37 °С при 5% СО₂.

Трансфекцию с использованием PEI проводили как было описано ранее [24].

Сухой PEI (Polysciences Inc., USA; Cat# 23966) растворяли в 0,2М HCl до концентрации 5 мкг/мкл, затем аликвотировали и подвергнули отсроченному хранению при –80 °С. Лактатный буфер (20 мM лактата натрия, 150 мM NaCl, pH 4,0) хранили при +4 °С.

В день эксперимента смешивали 3 мкг ДНК и 150 мкл лактатного буфера. Отдельно смешивали 15 мкг PEI и 150 мкл лактатного буфера. Растворы ДНК в лактатном буфере и PEI в лактатном буфере перемешивали на вортексе и смешивали между собой, выдерживали при комнатной температуре 10–15 мин, после чего капельно добавляли в культуральную среду. При последовательном добавлении в 300 мкл лактатного буфера ДНК и PEI эффективность трансфекции сохранялась (данные не приведены). Анализ флуоресценции проводили через 48 ч.

Кальций-фосфатную трансфекцию проводили в соответствии с опубликованной ранее методикой [26].

За час до трансфекции среду меняли на DMEM (Gibco), содержащий 10% FBS (HyClone), для шестилуночного планшета объем среды составлял 2,25 мл. Двухкратный HBS (табл. 1) объемом 125 мкл был смешан с равным объемом ДНК (3 мкг) / 2 M CaCl₂/dH₂O, молярность CaCl₂ в итоговой смеси ДНК / CaCl₂ / dH₂O должна составлять 148 мM. Далее 2× HBS, буфер смешивали с ДНК/CaCl₂/dH₂O при постоянном перемешивании и инкубировали 10–20 мин при комнатной температуре. Капельно добавляли в культуральную среду. Спустя 14 ч проводили шок клеточной мембраны. Для этого культуральную среду удаляли и добавляли 1 мл 10%-го раствора ДМСО в PBS. После инкубации в течение 2,5 мин клетки дважды промывали 3 мл PBS, затем добавляли свежую культуральную среду.

Трансфекцию с помощью TurboFect™ проводили в соответствии с рекомендациями производителя. В день эксперимента 4 мкг  плазмидной ДНК смешивали с бессывороточной средой DMEM, после чего добавляли 6 мкл реагента TurboFect, который предварительно тщательно перемешивали на вортексе, инкубировали при комнатной темпрературе в течение 20 мин и капельно добавляли в культуральную среду.

Оценка жизнеспособности клеток

Эксперименты по оценке жизнеспособности проводили с помощью 24-луночных планшетов. Оценку проводили спустя 24 ч после трансфекции, так как при более длительной инкубации в результате пролиферации клеток сложно оценить разницу в токсических эффектах. Использовали стандартный MTT-тест. Раствор МТТ (Диа-М; Россия) приготавливали в PBS в концентрации 5 мкг/мл. Инкубация с клетками длилась 3 ч, после чего среду удаляли и добавляли 300 мкл ДМСО (ПанЭко; Россия). В качестве контролей использовали клетки без обработки. Детекцию проводили с использованием планшетного ридера CLARIOSTAR (BMG LABTECH; США) путем измерения поглощения на длине волны 595 нм с нормализацией по длине волны 490 нм.

Проточная цитометрия и обработка данных

Количественную оценку флуоресценции определяли с помощью цитофлуориметра BD LSR Fortessa (Beckman Dickinson; США). Детекцию проводили в каналах PE (561/ (586/15) нм — Katushka), FITC (488/(530/30) нм — eGFP) и Pacific Blue (405/(450/50) нм — tagBFP). Настройку компенсации, а также первичную обработку данных проводили с помощью программного обеспечения FACS Diva. Дальнейший анализ выполняли с использованием программы Flowing Software 2.0 (Perttu Terho; Центр биотехнологии Турку, Финляндия). Исследование проводили в трех независимых экспериментах (каждый в трех биологических повторностях).

Наработка лентивирусных стоков и оценка их титра

Для наработки лентивирусных частиц использовали плазмидные конструкции с упаковочными белками pREV, pGAG-pol, p-VSV-G и pL-CMV-eGFP-puro из коллекции лаборатории пролиферации клеток (ИМБ РАН; Россия). Клетки HEK293T высевали на чашки Петри в конфлюэнтности 35%, на следующий день трансфецировали плазмидами (в соотношении 2 : 1 : 1 : 4 в соответствии с порядком перечисления) согласно одной из описанных выше методик [27]. Спустя 16 ч культуральную среду заменяли на DMEM c 2% FBS. Еще через 8 ч собирали первый сток и затем дважды в сутки повторяли сбор лентивирусных частиц. Оценку вирусного титра объединенных пяти стоков проводили модифицированным методом конечных разведений на линии HEK293T. Приготавливали 10-кратные серийные разведения лентивируса в бессывороточной среде DMEM, затем добавляли к свежей культуре, высаженной на 48-луночные планшеты, по 15 000 клеток на лунку. Среду заменяли на DMEM с 2% FBS и добавляли разведения лентивирусных стоков. Опыт проводили в четырех технических параллелях. Спустя 72 ч проводили подсчет флуоресцентных бляшек в лунках с максимально разведенным вирусом.

Статистический анализ результатов

Статистический анализ проводили в программном пакете GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, Inc.; ЛаХойя, Калифорния, США). Для анализа достоверности статистических различий использовали однофакторный ANOVA-анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценка жизнеспособности клеток после трансфекции

Спустя 24 ч после добавления к клеткам трансфекционных реагентов и ДНК проводили оценку жизнеспособности методом МТТ-анализа (рис. 1).

Как видно из полученных данных, более 80% клеток всех исследуемых линий успешно переживают процедуру трансфекции. Через 48 ч после проведения трансфекции оценка жизнеспособности не является информативной, так как в связи с эффектом контактного торможения количество клеток в контрольных лунках не увеличивается после достижения полной конфлюэнтности, в то время как трансфецированные клетки продолжают пролиферировать.

Оценка эффективности монотрансфекции

Для сравнения эффективности КФТ и трансфекции с помощью PEI была проведена трансфекция плазмидной конструкцией (pL-CMV-Katushka-puro) (рис. 2).

Была проведена оптимизация следующих условий:

• время инкубации клеток с ДНК/кальций-фосфатным преципитатом (6 и 14 ч);
• использование шока клеточной мембраны, вызываемого инкубацией с ДМСО в течение 2,5 мин.

Инкубация в течение 14 ч с ДНК/кальций-фосфатным преципитатом для клеточных линий HEK293T и CHO K-1 приводит к увеличению числа трансфецированных клеток с 27% при шестичасовой до 97% при инкубации в течение 14 ч (p-value < 0,01) для HEK293Т и с 1,5 до 13% для CHO K-1, соответственно (p-value < 0,01). Тогда как клеточные линии MRC5 и HUH7 показали снижение числа трансфецированных клеток с 25 до 3% (p-value < 0,01) для MRC5, с 8 до 1% (p-value < 0,01) — для HuH7.

Инкубация клеток с 10% ДМСО приводила к значительному увеличению доли трансфецированных клеток только для клеточной линии MRC5 (p-value < 0,05). На всех исследованных клеточных линиях, за исключением BHK21 КФТ, она оказалась более эффективной. Трансфекция с применением PEI также оказалась эффективным методом для большинства линий со сравнимым цитотоксическим эффектом на клетках.

Для линий HEK293T и CHO DG-44 была проведена проверка влияния культуральной среды на эффективность КФТ (рис. 2A, В). Для линии CHO DG-44 было показано заметное увеличение числа трансфецированных клеток на среде DMEM/F12 (p-value < 0,01). Для образцов на среде DMEM/F12 ДМСО-шок клеточной мембраны достоверно не повышал эффективность.

Оценка эффективности котрансфекции

На следующем этапе исследования мы проверили эффективность трансфекции двумя плазмидными конструкциями, кодирующими флуоресцентные белки eGFP и Katushka (рис. 3А; табл. 2). Наиболее эффективно проходит котрансфекция клеточной линии HEK293T, для CHO КФТ оказалось лучше, чем PEI (p-value < 0,01). Трансфекция с применением TurboFect была наименее эффективной. Микрофотографии результатов КФТ на линии HEK293T представлены на рис. 4.

Оценку эффективности котрансфекции тремя плазмидными конструкциями, кодирующими флуоресцентные белки BFP, eGFP и Katushka, также проводили методом проточной цитометрии (рис. 5). Тенденции, отмеченные при трансфекции двумя генетическими конструкциями, сохраняются. Процент клеток, трансфецированных одновременно тремя плазмидными конструкциями, ожидаемо снижается (рис. 3Б, табл. 3). Анализ результатов проточной цитометрии проводили в соответствии с параметрами, приведенными на рис. 5. Популяции положительных по флуоресценции клеток отделялись по границе аутофлуоресценции нетрансфецированных клеток.

Из полученных результатов следует, что общедоступные методы химической трансфекции демонстрируют очень высокую эффективность при моно- и котрансфекциях, сравнимую с самыми эффективными коммерчески доступными системами FuGENE и Lipofectamine 3000 [28].

Оценка эффективности сборки лентивирусных частиц, несущих интеграционную кассету с eGFP

Лентивирусную трансдукцию широко применяют для получения клеточных сублиний, стабильно экспрессирующих экзогенные белки, для репрограммирования клеток и многих других задач молекулярной и клеточной биологии. Для наработки лентивирусных стоков необходимо трансдуцировать упаковочную линию клеток HEK293T тремя или четырьмя плазмидными конструкциями, кодирующими белки HIV-1, гликопротеид VSV-G, а также плазмидой, несущей целевой трансген. Эффективность сборки частиц зависит от эффективности трансфекции и жизнеспособности клеток. Для решения этой практической задачи на основании полученных ранее данных были выбраны методы КФТ + ДМСО, PEI и Turbofect.

Трансфекцию проводили на 6 млн клеток (чашка Петри диаметром 10 см в конфлюэнтности 70%). Титр лентивирусных частиц оценивали методом конечных разведений (рис. 6).

Эффективность наработки лентивирусных частиц максимальна в случае использования КФТ (9 × 10⁵ и.е./мл), PEI дает сравнимый результат (105 и.е./мл), однако титр достоверно ниже (p-value <  0,05), как и в случае Turbofect (6 × 10⁴ и.е./мл; p-value < 0,01).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Методы химической трансфекции демонстрируют различную токсичность и эффективность трансфекции в зависимости от их химической природы и соотношения ДНК и трансфекционного реагента. На эффективность трансфекции влияют многие параметры, при этом различия в условиях проведения экспериментов затрудняют детальное сравнение результатов в различных работах [16, 24]. В настоящем исследовании был проведен сравнительный анализ эффективности трех методов трансфекции в нескольких клеточных линиях различного происхождения.

Среди всех линий наиболее эффективно трансфецируются клетки HEK293T. Данная линия широко используется для наработки рекомбинантных белков и лентивирусных стоков и является одной из самых изученных модельных линий. КФТ дает очень хороший воспроизводимый результат на данной линии (более 95% трансфецированных клеток). Для HEK293T время инкубации с ДНК / кальций / фосфатным преципитатом является ключевым фактором для увеличения эффективности трансфекции с 6 до 14 ч и составляет 29 и 97% соответственно (p-value < 0,01), тогда как роль шока клеточной мембраны не играет существенной роли, статистически значимой разницы не выявлено. Эффективность трансфекции КФТ и PEI составляет 68 и 21%, соответственно (p-value < 0,01) для трансфекции двумя плазмидными конструкциями, 40 и 15% соответственно (p-value < 0,01) для трехплазмидной котрансфекции. Эффективность же PEI и TurboFect составляет 21 и 5,9% для трансфекции двумя конструкциями и 15 и 5% — для трехплазмидной трансфекции (p-value < 0,01).

Для оценки практической эффективности котрансфекций четырьмя плазмидными конструкциями, кодирующими упаковочные белки лентивируса, и одной, кодирующей целевой ген (eGFP), нами были получены лентивирусные стоки, которые эффективно трансдуцируют клетки, в результате чего можно наблюдать экспрессию eGFP. Лентивирусные стоки, полученные методом КФТ, имели самый высокий титр 9 × 10⁵ и.е./мл, тогда как полученные с помощью PEI и TurboFect существенно более низкий 10⁵ и.е./мл и 6 × 10⁴ и.е./мл соответственно (p-value < 0,05).

Что касается линии BHK-21, то КФТ продемонстрировала менее высокую эффективность, чем PEI, — 6,6 и 15% соответственно (p-value < 0,01) и 4,6% против 8,3% при тройной трансфекции (p-value < 0,01), что частично согласуется с опубликованными ранее данными [24]. Различие в результатах можно объяснить несколькими критически важными факторами, в частности, методом приготовления PEI. Одним из важных требований для сохранения высокой эффективности является оперативное приготовление раствора PEI без длительного хранения в сухом виде после производства, так как окисление PEI атмосферным кислородом снижает его эффективность [24]. Трансфекция PEI во многом оказалась эффективнее, чем Turbofect (11 и 6% соответственно, p-value < 0,01) для трансфекции двумя плазмидами и 8% против 4% при тройной трансфекции (p-value < 0,01). TurboFect хранится при +2‒8 °С, и несоблюдение этих условий существенно снижает его эффективность, что могло бы объяснить низкие показатели его эффективности во всех проведенных нами экспериментах.

КФТ показала себя как эффективный метод и на других клеточных линиях, использованных в нашем исследовании в сравнении с PEI (p-value < 0,001 — для линий HEK293T, Huh7, CHO DG-44, CHO K-1 и p-value < 0,05 — для MRC5). Следует отметить, что шок клеточной мембраны, вызванный инкубацией с ДМСО для клеточных линий CHO-K1 (p-value < 0,05) и MRC5, приводил к незначительному увеличению эффективности трансфекции, как при двойной, так и при тройной котрансфекции. Клетки линии HuH7 не были эффективно котрансфецированы ни одним из исследованных нами методов, однако монотрансфекция КФТ с шоком мембраны приводила к трансфекции более 7% клеток.

Одним неоспоримым преимуществом PEI перед КФТ является простота применения для трансфекции суспензионных культур клеток, которые не были использованы в нашем исследовании. Клеточная линия Еxpi293, широко применяемая для наработки белков, может быть эффективно трансфецирована с использованием PEI вместо весьма дорогостоящего Expifectamine [29].

ВЫВОДЫ

Кальций-фосфатный метод позволяет добиться высокого уровня трансфекции и воспроизводимых результатов на панели клеточных линий широко используемых для исследовательских и биотехнологических задач. Его выполнение требует определенной методической подготовки, но при этом отсутствует проблема хранения трансфекционного агента, что гарантирует высокую воспроизводимость метода. Для задач получения лентивирусных стоков на клетках HEK293T данный метод дает очень хороший результат (9 × 10⁵ и.е./мл без концентрирования), не уступающий готовым коммерческим лентивирусным частицам, что особенно актуально с учетом логистических сложностей. Катионная трансфекция PEI также демонстрирует высокую эффективность при сравнительно простом протоколе выполнения. Подготовка реактивов с учетом особенностей хранения делает метод простым для масштабирования без снижения эффективности. TurboFect дает приемлемые результаты, хотя эффективность этого трансфекционного реагента ниже. Тем не менее метод очень легкий в исполнении и хорошо подходит для небольших исследовательских задач. Однако высокая стоимость и длительная доставка не позволяют использовать его в качестве метода трансфекции для масштабных проектов.