Самые ранние сведения о существовании Listeria monocytogenes относятся к 1926 г., когда была описана летальная инфекция у кроликов, у которых развивался выраженный моноцитоз [1]. Грамположительная бактерия L. monocytogenes вызывает листериоз — тяжелое системное заболевание животных и человека [2]. У людей основными клиническими признаками листериоза являются сепсис, менингит и менингоэнцефалит [3]. Иммунологическая защита от L. monocytogenes обусловлена в основном системой врожденного и адаптивного клеточного иммунитета. Первыми эффекторными клетками являются макрофаги. L. monocytogenes относится к факультативным внутриклеточным бактериям, фагоцитируется клетками системы мононуклеарных фагоцитов и может размножаться внутри них.

Критическим этапом инфекционного процесса является инвазия L. monocytogenes в непрофессиональные фагоциты. Для этого L. monocytogenes имеет на клеточной поверхности белки интерналин А (InlA) и интерналин В (InlB). InlA ковалентно связан с бактериальной поверхностью и его взаимодействие с целевым рецептором Е-кадгерином опосредует ремоделирование цитоскелета и бактериальную интернализацию [4]. InlB присутствует в двух формах: одна из них связана с бактериальной поверхностью и опосредует активную инвазию бактерий внутрь клеток непрофессиональных фагоцитов; роль второй формы (растворимой) может заключаться в неспецифичной активации сигнальных путей при связывании с целевыми рецепторами, и ее функциональное значение до конца не изучено. c-Met и gC1q-R — эукариотические рецепторы InlB [5–6]. c-Met — это рецептор для фактора роста гепатоцитов. Его активация приводит к запуску сигнальных путей, опосредующих пролиферацию и миграцию клеток, а также контролирующих иммунный ответ в некоторых типах клеток [7]. c-Met экспрессируется во множестве эпителиальных клеток, а также в клетках иммунной системы: макрофагах, моноцитах, дендритных клетках и Т-клетках [8]. Известно также, что передача сигналов от c-Met смещает макрофаги M1-фенотипа в сторону M2подобного фенотипа [9].

Второй таргетный рецептор InlB gC1q-R представляет собой повсеместно экспрессируемый белок, который первоначально идентифицировали как рецептор глобулярных головок C1q [10]. Позднее было установлено, что gC1q-R многофункционален и взаимодействует с широким спектром лигандов эндогенного и экзогенного происхождения [11]. Связывание InlB c gC1qR способствует проникновению листерий в клетки млекопитающих. Продемонстрировано, что взаимодействие InlB c c-Met и gC1qR существенно влияет на динамику фосфорилирования в сигнальных каскадах, контролируемых PI3-и MAPK-киназами в эпителиальных клетках человека, и описаны структурнофункциональные особенности взаимодействий между InlB и его таргетными рецепторами [12–14]. Как и рецептор c-Met, gC1qR активно экспрессируется на поверхности В-лимфоцитов и макрофагах [15].

Таким образом оба рецептора для InlB вовлечены во множество сигнальных путей, опосредующих иммунные реакции организма. Была высказана гипотеза, что InlB может быть вовлечен в регуляцию врожденного иммунного ответа макроорганизма за счет активации NFkappaB и запуска PI3-киназного пути в макрофагах [16]. В пользу гипотезы свидетельствуют опубликованные факты о том, что взаимодействие c-Met c InlB способствует миграции некоторых типов иммунных клеток и приводит к продукции перитонеальными дендритными клетками провоспалительного цитокина IL6 [17]. Однако экспериментальных данных о роли InlB во взаимодействии L. monocytogenes с макрофагами до настоящего времени опубликовано не было.

Целью данной работы было изучение роли InlB во взаимодействиях листерий с макрофагами человека.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение макрофагов человека из периферической крови

Макрофаги человека дифференцировали из моноцитов, выделенных из мононуклеарной фракции периферической крови. Кровь получали от здоровых доноров. Выделение моноцитов осуществляли методом центрифугирования в градиенте плотности с использованием Ficoll-Paque Premium (HyClone; США) и с последующей адгезией [18]. Моноциты инкубировали при 37 °C и 5% CO₂ в течение 6 дней в среде RPMI-1640, содержащей 2%-ю инактивированную сыворотку крови человека, 2 мМ L-глютамин, 10 мм HEPES, 50 мкм β-меркаптоэтанол, 2 мМ пируват натрия и 2 мМ витаминов MEM (HyClone; США). В первый день в среду добавляли 50 нг/мл GM-CSF (SciStore; Россия). Обновление среды проводили на 4-й день с добавлением 50 нг/мл GM-CSF. Клетки окрашивали конъюгированными с флуорофором первичными антителами против CD11b (APC-Cy7), CD80 (PE-Cy5), CD86 (BV421), HLA-DR (PE-Cy7) и анализировали с помощью проточного цитометра (Beckman Coulter; США).

Бактериальные штаммы и условия культивирования

В работе использовали следующие штаммы L. monocytogenes: типовой штамм EGDe, и штамм EGDe∆inlB (с хромосомной делецией гена inlB), а также штамм EGDe∆inlB::pInlB, содержащий плазмиду, несущую ген inlB, которая комплементировала делецию хромосомной копии гена. Штамм EGDe∆inlB был любезно предоставлен профессором J. Vazquez-Boland, Univ. Эдинбург, Великобритания. InlB-экспрессирующая плазмида и штамм EGDe∆inlB::pInlB были описаны ранее [14]. Все штаммы L. monocytogenes культивировали на жидкой питательной среде BHI (Becton, Dickinson and Company; США) при 37 °C и постоянном встряхивании при 200 об./мин. Штаммы, несущие InlB-экспрессирующую плазмиду, выращивали в присутствии 10 мкг/мл эритромицина для поддержания плазмиды. Для получения заражающих культур бактерии выращивали до середины логорифмической фазы, трижды промывали PBS (Amresco; США), разделяли на аликвоты по 100 мкл и замораживали в присутствии 10% глицерина (Sigma-Aldrich; СШA).

Анализ эффективности захвата бактерий

Макрофаги выращивали в 24-луночных планшетах. Концентрацию бактериальных клеток в замороженной культуре определяли методом серийных разведений. К макрофагам в питательной среде вносили бактерии в соотношении 1 : 100 (MOI). Через 1 ч инкубации при 37 °C и 5% СО₂ клетки трижды промывали PBS, после добавляли среду DMEM (ПанЭко; Россия), содержащую гентамицин (Sigma-Aldrich; США) в концентрации 100 мкг/мл для уничтожения внеклеточных бактерий. После 1 ч инкубации клетки тщательно промывали PBS для удаления гентамицина и лизировали 1% Triton X 100 (Sigma-Aldrich; США). Далее делали серийные разведения и высевали бактерии на твердую питательную среду BHI. Для комплементированных штаммов высевы делали на среду с добавлением эритромицина 10 мкг/мл. Эффективность захвата оценивали по соотношению количества захваченных бактерий к количеству добавленных бактерий. 

Анализ выживаемости L. monocytogenes в макрофагах человека

Через 1 ч инкубации при 37 °C и 5% СО₂ клетки трижды промывали PBS, после добавляли среду DMEM (ПанЭко; Россия), содержащую гентамицин (Sigma-Aldrich; США) в концентрации 100 мкг/мл для уничтожения внеклеточных бактерий. Через 1 ч инкубации с высокой концентрацией гентамицина среду удаляли, клетки промывали, в лунки 24-луночных планшетов вносили DMEM (ПанЭко; Россия) с содержанием гентамицина (Sigma-Aldrich; США) 20 мкг/ мл для препятствия выживанию листерий вне макрофагов. Планшеты инкубировали 24 ч (от начала инфекции) при 37 °C и 5% СО₂. Далее клетки трижды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) для удаления гентамицина и макрофаги лизировали добавлением 100 мкл 1% Triton X 100. Лизат доводили до 1 мл добавлением 900 мкл PBS. Далее делали серийные разведения и высевали бактерии на твердую питательную среду BHI. Для комплементированного штамма высевы делали на среду с добавлением эритромицина 10 мкг/мл. Эффективность выживания оценивали по соотношению количества выживших бактерий на количество захваченных бактерий.

ИФА-тест система для определения уровня экспрессии InlB

Штаммы L. monocytogenes были выращены в BHI в течение 18 ч. Супернатант и клетки отделяли центрифугированием (4200 об/мин, 15 мин). Клетки были отмыты трижды PBS и ресуспендированы в 500 мкл карбонатно-бикарбонатном буфере (pH 9,6). Для проведения анализа уровня InlB на клеточной поверхности мы использовали прямой метод. В лунки 96-луночного планшета добавляли 100 мкл образца. Инкубировали ночь при + 4 °С. Затем отмывали TTBS трижды по 250 мкл. Далее к образцам добавляли по 200 мкл блокирующий буфер и инкубировали 1 ч при комнатной температуре (NT). Конъюгированные с HRP антитела к InlB добавляли к образцам в разведение 1 : 4000 по 100 мкл на лунку и инкубировали в течение 1 ч при NT. Затем отмывали 6 раз по 250 мкл TTBS. Для визуализации добавляли по 100 мкл ТМB (Thermofischer scientific; СШA). Реакцию останавливали внесением в каждую лунку по 100 мкл 2 М H₂SO₄. Оптическую плотность измеряли при длине волны 450 нм на планшетном фотометре iMark (Bio-Rad; СШA). Для проведения анализа уровня секретируемого InlB использовали «Сэндвич»-метод. В лунки 96-луночного планшета добавляли 100 мкл антител против InlB (4 мкг/мл), разведенных в карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,6), и инкубировали ночь при + 4 °С. Затем промывали TTBS 3 раза по 250 мкл. Далее в лунки вносили по 200 мкл блокирующего буфера (2% BSA) и инкубировали 1 ч при RT. Затем удаляли блокирующий буфер и добавляли 100 мкл образца и инкубировали 1 ч при RT. После отмывали 3 раза TTBS по 250 мкл. Конъюгированные с HRP антитела к InlB в разведение 1 : 4000 добавляли в объеме 100 мкл на лунку и инкубировали 1 ч. Отмывали 6 раз по 250 мкл TTBS. Проявляли ТМВ-субстратом 100 мкл. Для остановки реакции использовали 100 мкл серной кислоты (2 М). Измерение оптической плотности проводили при длине волны 450 нм на планшетном фотометре iMark (Bio-Rad; СШA). Концентрацию InlB определяли по калибровочной кривой и пересчитывали на число клеток в образце.

Статистический анализ

Все эксперименты проводили в трех повторениях и не менее четырех раз. Для статистического анализа использовали односторонний ANOVA с post hoc-Tukey (https://www.socscistatistics.com/tests/anova/default2.aspx). Значение p < 0,05 считали показателем статистически значимой разницы (см. Приложение 1 и 2).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика дифференцированных макрофагов

Макрофаги играют важную роль во врожденном иммунном ответе и в стимулировании дифференцировки иммунных эффекторных клеток; в целом ответ первых инфицированных клеток в организме хозяина формирует последующий врожденный и адаптивный иммунитет к L. monocytogenes. Макрофаги были проанализированы с использованием проточной цитометрии. Фенотип клеток, полученных из моноцитов, характеризовался наличием на поверхности CD11b, CD80, CD86 и HLA-DR — маркеров, экспрессируемых на провосполительных макрофагах М1-типа [19] (рис. 1). Клетки содержали крупное округлое ядро с гетерохроматином, локализованным под ядерной мембраной, и имели множество отростков на поверхности. Клетки были прочно адгезированы к поверхности лунок (рис. 2).

Фагоцитоз L. monocytogenes макрофагами зависит от наличия InlB

Взаимодействие c-Met непрофессиональных фагоцитов с InlB, который связан с бактериальной поверхностью, опосредует перестройки цитоскелета эукариотической клетки, приводит к формированию фагосомной чаши с последующей интернализацией бактерий внутрь клеток. Однако значение InlB для взаимодействия с профессиональными фагоцитами остается неизвестным. В первом эксперименте мы проанализировали, влияет ли наличие InlB на эффективность захвата макрофагами L. monocytogenes. Для этого мы добавили к макрофагам М1-типа три штамма L. monocytogenes: типовой штамм EGDe, штамм EGDe∆inlB (∆InlB) — лишенный гена inlB и полученный на основе штамма EGDe, и штамм EGDe∆inlB::pInlB (InlB) — содержащий плазмиду, несущую ген inlB. Полученные данные показали, что наличие InlB в  3,5 раза достоверно улучшает поглощение L. monocytogenes макрофагами (рис. 3). Достоверных различий между штаммами дикого типа EGDe и EGDe∆inlB::pInlB выявлено не было (см. Приложение 1).

Выживаемость L. monocytogenes в макрофагах зависит от наличия InlB

Через 24 ч мы оценили, влияет ли наличие InlB на выживаемость листерий внутри макрофагов человека. Мы обнаружили, что через это время штамм, лишенный InlB, увеличил численность внутри макрофагов в 182,5 ± 16,7 раз, типовой штамм EGDe размножался менее эффективно и увеличил свою численность в 96 ± 12 раз. Удивительно, что штамм EGDe∆inlB::pInlB, комплементированный плазмидной копией гена inlB, размножался хуже всего и увеличил свою численность только в 13,3 ± 3 раз (рис. 4) (см. Приложение 2). Такой эффект мог быть связан с тем, что штамм комплементирован на основе плазмиды и экспрессия плазмиды может потреблять дополнительные клеточные ресурсы. Для подтверждения возможности данного факта мы провели инфицирование клеток линии HEp-2, аналогично анализу захвата макрофагами, штаммами EGDe и EGDe∆inlB::pInlB. Через 24 ч штамм EGDe увеличил свою численность в 515,78 раз, а штамм EGDe∆inlB::pInlB увеличил свою численность в 508,9 раз (n = 3). Таким образом размножение штамма «дикого типа» и штамма, несущего дополнительную плазмиду, было сопоставимым в клетках линии HEp-2.

Учитывая, что наличие InlB снижает выживаемость типового штамма EGDe по сравнению со штаммом, лишенным гена inlB, мы предположили, что наблюдаемый эффект сниженной выживаемости комплеметированного штамма может быть связан с уровнем продукции InlB.

Для определения уровня продукции между штаммами мы использовали ИФА-тест систему, чтобы оценить количество InlB на бактериальной поверхности и в окружающей среде. Мы обнаружили, что на клеточной поверхности количество InlB было сопоставимо между штаммами EGDe и EGDe∆inlB::pInlB. Однако в супернатанте уровень InlB для EGDe∆inlB::pInlB был в 3,3 раза выше, чем для типового штамма EGDe (рис. 5). Таким образом наблюдаемые результаты свидетельствуют в пользу нашего предположения, что выживаемость и/или размножение L. monocytogenes в макрофагах человека зависит от количества InlB.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В данной работе мы показали, что взаимодействие L. monocytogenes с макрофагами зависит от экспрессии бактериями фактора патогенности белка InlB: наличие InlB на бактериальной поверхности усиливает захват бактерий макрофагами, а также существенно снижает выживаемость листерий внутри макрофагов. Более того, чем выше уровень продукции InlB, тем хуже выживаемость L. monocytogenes внутри макрофагов.

Анализируя литературные данные, мы обнаружили исследование, где сравнивали различия в уровне экспрессии гена inlB между клиническими и неклиническими изолятами и продемонстрировали, что уровень продукции InlB достоверно ниже у клинических изолятов [20]. При этом чем ниже уровень продукции InlB, тем ниже был уровень IL8 вырабатываемого непрофессиональными фагоцитами [20]. Авторы предположили, что более низкая способность клинических штаммов индуцировать IL8, возможно, является механизмом уклонения от иммунитета, хотя это приводит к уменьшению эффективности инвазии в клетки непрофессиональных фагоцитов [20]. Результаты нашего исследования, демонстрирующие, что высокие уровни продукции InlB негативно сказываются на выживаемости листерий внутри макрофагов человека, подтверждают эти наблюдения.

Из двух таргетных рецепторов InlB выбрать рецептор, ответственный за наблюдаемый эффект, пока не представляется возможным. Известно, что активация c-Met его физиологическим лигандом — фактором роста гепатоцитов (HGF) — приводит к изменению фенотипа макрофагов с М1 на М2 [9]. Взаимодействие InlB с c-Met мимикрирует активность HGF, что приводит к активации NF-kappaB и запуску PI3-киназного и MAPK-киназного путей, в том числе в макрофагах [14, 16]. Известно, что взаимодействие c-Met c InlB может способствовать миграции некоторых типов иммунных клеток. Позже появились работы, доказывающие, что взаимодействие c-Met c InlВ приводит к продукции перитонеальными дендритными клетками про-воспалительного цитокина IL6 [16]. В то же время в нашей работе дозозависимый эффект наблюдался после захвата листерий макрофагами, что может указывать на роль внутриклеточных рецепторов InlB. Таким рецептором может быть gC1qR, для которого были описаны как внеклеточная, так и внутриклеточная локализация. Не исключено также существование еще не описанных внутриклеточных рецепторов InlB.

Наши результаты продемонстрировали, что InlB оказывает негативное влияние на уклонение листерий от врожденного иммунитета. В то же время InlB необходим для полноценной инвазии в клетки непрофессиональных фагоцитов. Баланс между взаимодействием с клетками иммунной системы и таргетными клетками организма может определять вирулентность разных штаммов L. monocytogenes.

ВЫВОД

Целью данной работы было изучение влияния фактора патогенности L. monocytogenes InlB на взаимодействие листерий с макрофагами человека. Наши результаты показали, что InlB статистически значимо улучшает захват листерий макрофагами и уменьшает выживание / размножение листерий внутри макрофагов. Таким образом, мы впервые показали, что InlB оказывает негативное влияние на уклонение листерий от врожденного иммунитета. Баланс между положительным эффектом InlB на взаимодействие L. monocytogenes с непрофессиональными фагоцитами и отрицательным эффектом на уклонение листерий от врожденного иммунитета и механизмы поддержания этого баланса должны быть более детально изучены для лучшего понимания процессов взаимодействия возбудителя с разными типами клеток в организме.