Гипоксическая ишемическая энцефалопатия новорожденных

Гипоксическая ишемическая энцефалопатия новорожденных (ГИЭ) — одна из наиболее частых причин неонатальной смертности и инвалидности. Среди недоношенных детей (гестационный возраст < 28 недель) она составляет около 4–48 случаев на 1000 беременностей, однако их число начинает стремительно расти с уменьшением гестационного возраста [1–4]. На долю ГИЭ приходится 6–9% всех неонатальных смертей и 21–23% смертей доношенных детей. По данным литературы, до 10% новорожденных умирают после рождения, у 25% развиваются тяжелые неврологические нарушения: детский церебральный паралич, судороги, умственная отсталость, когнитивные нарушения и эпилепсия [5–9].

При лечении младенцев с данной патологией основная проблема связана с ее прогнозированием, выявлением и классификацией, поскольку все эти факторы влияют на стратегию дальнейшей терапии. Среди младенцев с признаками перинатальной асфиксии около 20% находятся в группе риска ГИЭ с энцефалопатиями различной степени тяжести, из них 40–50% будут подвержены риску инвалидизации, включая умственную отсталость, эпилептические приступы, нарушения зрения и слуха, а также возможен смертельный исход [10].

Терапевтическая гипотермия (ТГ) является доказанным, эффективным методом лечения ГИЭ, она улучшает выживаемость и долгосрочный прогноз у детей [11, 12]. Современные рекомендации по применению ТГ включают детей с ГИЭ от умеренной до тяжелой степени, начиная с 37-й недели гестации, исключая применение гипотермии у детей с легкой степенью ГИЭ. По результатам национального исследования в Великобритании, 75% центров проводили ТГ младенцам с легкой степенью ГИЭ [13]. Проспективное исследование младенцев с легкой энцефалопатией (PRIME) показало, что у 52% младенцев с легкой формой ГИЭ при выписке были выявлены ранние аномальные изменения на эЭЭГ или судороги, патологическое МРТ головного мозга или неврологическая симптоматика [14]. При последующем наблюдении в среднем через 19 месяцев 16% младенцев имели инвалидность, а у 40% баллы по шкале Бейли III были < 85. Отмечено, что у детей с легкой ГИЭ, не проходивших курс ТГ, когнитивные исходы были такими же, как у детей с ГИЭ средней степени тяжести, которым не проводили ТГ. Систематический обзор результатов у младенцев с легкой степенью ГИЭ показал, что 25% (n = 341) имели патологический исход развития нервной системы [15–17].

Клиническая диагностика и прогнозирование развития ГИЭ

Ранняя и точная оценка тяжести ГИЭ остается одной из самых сложных задач неонатальной помощи. В неонатологии используют разнообразные клинические методы оценки морфофункционального состояния нервной системы для прогнозирования долгосрочных исходов, такие как нейровизуализация и нейрофизиологические инструменты и их комбинации [18–22]. Однако современные методы оценки риска повреждения головного мозга у новорожденного имеют ограничения, присущие первым часам жизни, и неопределенность в отношении тяжести продолжающегося повреждения головного мозга и возможного неврологического исхода сохраняется в этот ранний период [23, 24].

Наиболее доступные инструменты клинической оценки ГИЭ включают: оценку амплитудно-интегрированной электроэнцефалографии (аЭЭГ), нейровизуализацию и исследование мозгового кровотока [22, 24–27]. Многочисленные исследования показали, что около 80% судорог на ЭЭГ у новорожденных не имеют связи с клинической картиной и, следовательно, не могут быть идентифицированы без постоянного мониторинга ЭЭГ даже опытными клиницистами. Более того, нет различий в степени ГИЭ и частотой возникновения судорожной активности клинически или по данным ЭЭГ [28–30].

Амплитудно-интегрированные фоновые паттерны ЭЭГ при ГИЭ тесно коррелируют с неврологическим исходом [31]. Однако их прогностическая ценность зависит от того, как долго изменяются фоновые паттерны по отношению к ГИЭ, а большая прогностическая ценность неблагоприятных исходов у детей, которым проводили лечебную гипотермию, составляет 48–72 ч жизни [27]. Качественная оценка повреждения головного мозга, по данным МРТ-диагностики, в течение первых 48 ч может быть недооценена [32–34].

Выявлены различные факторы риска, влияющие на лечебный эффект ТГ у новорожденных с асфиксией, такие как тяжесть ГИЭ, отсроченное начало лечения, гипо- и гипергликемия, судороги, гипероксия и гипокапния во время TГ. Кроме того, несколько сопутствующих заболеваний могут влиять на нейропротекторную активность TГ. Одним из хорошо известных факторов риска неблагоприятного неврологического исхода у новорожденных является перинатальный сепсис. Доказано, что ТГ не обладает нейропротективным действием после сенсибилизированной воспалением гипоксически-ишемической энцефалопатии [35–39].

Метаболические нарушения редко вызывают ГИЭ [40]. Врожденные нарушения метаболизма (ВНМ) возникают в неонатальном периоде после нормального периода родов при отсутствии признаков перинатальной асфиксии. У новорожденных развиваются неврологические нарушения и признаки полиорганной недостаточности, которые могут иметь сходные клинические признаки с ГИЭ. Подробный семейный анамнез для установления таких факторов риска, как кровное родство родителей или гибель ребенка в анамнезе, имеет важное значение, так как большинство врожденных нарушений метаболизма имеют аутосомнорецессивный тип наследования. Все новорожденные с риском ВНM должны быть обследованы на предмет метаболических нарушений, так как у этих пациентов могут оказаться эффективными специфические методы лечения, а не гипотермия.

Еще одна категория детей с генетической причиной неврологических нарушений, схожих с ГИЭ, — это дети с неонатальными миопатиями и энцефалопатиями. У пациентов, унаследовавших миопатию (центронуклеарную миопатию), при рождении выявляют мышечную гипотонию в сочетании с дыхательной недостаточностью и ранней смертью, что так же может имитировать ГИЭ [41]. Широкое применение методов полногеномного секвенирования позволило выявить целый ряд новых патологических мутаций, ассоциированных с нарушением функционирования центральной нервной системы, и имеющих схожие клинические признаки с ГИЭ, например в гене GNAO1 [42, 43]. Таким образом, ТГ показала свою эффективность не у всех пациентов с ГИЭ. Для ранней дифференциальной диагностики ГИЭ новорожденных могут быть применимы подходы по анализу метаболических изменений в крови новорожденных с использованием новых аналитических методов, в частности хромато-масс-спектрометрии. Данный метод позволяет идентифицировать сотни метаболитов в течение нескольких часов, что укладывается во временные рамки, необходимые для получения результатов анализов и принятия решения о назначении ТГ.

Новые подходы к диагностике ГИА: протеомные исследования

В последние годы постоянно повышается интерес к системной биологии — науке, которая объединяет несколько уровней информации для достижения более полного знания о биологической системе. Геномика, транскриптомика, протеомика и метаболомика входят в состав системной биологии и формируют так называемую группу «омикс»-наук. Активное развитие «омикс»-наук обусловлено значительным усовершенствованием экспериментальных технологий и, в первую очередь, успехами в области хроматографии, масс-спектрометрии и секвенирования. Технологии, используемые для создания «омикс»-платформ, представляют собой аналитические подходы для получения информации о входящих в состав биологического образца молекулах различного уровня организации: нуклеиновых кислотах, белках, метаболитах. Эти методы позволяют одновременно регистрировать количественное и качественное содержание нескольких тысяч соединений, создавая тем самым уникальный «отпечаток пальца», характеризующий текущее состояние организма. «Омикс»-науки комплементарны друг другу: геномика показывает, что организм потенциально способен делать; транскриптомика, что он собирается делать; протеомика, что он делает, метаболомика отражает влияние окружающей среды на геном. В то время как гены и белки создают основу для того, что происходит в клетке, большая часть реальной активности происходит на уровне метаболитов. Более того, метаболизм может изменяться в зависимости от физиологичного или патологического состояния клетки, ткани, органа или организма [44].

Развитие методов поиска биомаркеров различных, в том числе социально значимых, заболеваний, одно из наиболее динамично развивающихся направлений геномики, протеомики, метаболомики и инструментальных методов, в частности, ядерного магнитного резонанса (ЯМР), масс-спектрометрии (МС), высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС), иммуноферментными методами (ИФА). Об этом свидетельствует возрастающее из года в год число публикаций, специализированных конференций и специальных секций на отраслевых конференциях, посвященных данной проблеме.

Следует отметить, что клинические исследования в неонатальный период очень ограничены; при исследовании динамики молекулярного состава биологических жидкостей преимуществом обладают неинвазивные образцы (моча, стул), а также малоинвазивные образцы (кровь, сухое пятно крови). Некоторое количество таких образцов остается после рутинных клинических анализов, и их можно использовать для проведения дальнейших исследований, не прибегая к дополнительному отбору биологического материала.

В настоящее время в литературе представлены отдельные исследования крови, мочи и спинномозговой жидкости для поиска маркеров различных неонатальных патологий нервной системы, в частности ГИЭ [45]. Следует отметить, что сбор цереброспинальной жидкости (ликвора) является высокоинвазивным методом. Несмотря на наличие в нем специфичных нейрональных маркеров глиального фибриллярного кислого белка GFAP и S100B, эти маркеры не будут доступны в первые критические 6 ч послеродовой жизни и скорее будут подходить для прогнозирования исхода уже развившейся ГИЭ [46]. Предприняты также попытки анализа состава мочи, например, соотношения лактата и креатинина у младенцев с подозрением на патологию ГИЭ, но младенцы с врожденной неонатальной асфиксией, как правило, не выделяют мочу долгое время в связи с повреждением почек. Поэтому моча тоже не подходит для данной клинико-диагностической задачи [47].

В связи с этим, основное внимание исследований направлено на циркулирующие биомаркеры крови, по большей части белкового происхождения, а также нейрональные экзосомы и воспалительные цитокины и метаболиты. Последние достижения в области метаболомики, протеомики и транскриптомики тоже смещают фокус внимания исследователей, направленный на поиск целых молекулярных паттернов биологических молекул, которые бы позволили четко дифференцировать ГИЭ в течение первых 6 ч жизни младенцев от других сопутствующих повреждений (почек, миокарда), которые неизбежны при перинатальной асфиксии. Исследований, позволяющих охарактеризовать первый этап повреждения головного мозга (гипоксическую фазу или первые 6 ч после рождения), недостаточно, чтобы можно было сделать практические выводы для клинической медицины.

Поиск подобных маркеров затруднителен, что в первую очередь связано с процессом развития самой патологии. Гипоксические условия приводят к переключению клеток головного мозга на анаэробный метаболизм, к которому они, в особенности нейроны, не приспособлены. В итоге, довольно быстро в условиях стресса, эксайтотоксичности и накопления метаболитов происходит истощение всех энергетических запасов и как следствие — некротическая гибель клеток головного мозга, которая служит предтечей последующей воспалительной реакции. Наступающая после ишемии/гипоксии фаза реперфузии/реоксигенации способствует продукции активных форм кислорода, инициации апоптозных каскадов и воспалению. После этого наступает перманентная фаза хронического воспаления, которая лишь способствует прогрессии эксайтотоксичности, нарушению окислительного метаболизма, активации протеаз и каспаз, которые в итоге приводят к органическому повреждению головного мозга и нарушению функций [48]. Таким образом, в связи с динамически изменяющимся ходом развития молекулярнобиохимических каскадов, так же динамически изменяется и молекулярный состав крови новорожденных; кроме того многие потенциальные кандидатные молекулы «не попадают» во временной диапазон срочного принятия решения (6 ч). Например, упомянутые выше GFAP, S100B, а также специфичная нейрональная енолаза и основный белок миелина проявляют свои повышенные уровни в крови после первых 6 ч жизни (12–24 ч) [49–51]. Помимо этого, проблема усугубляется еще и тем, что неонатальную ГИЭ довольно сложно дифференцировать от сепсиса или врожденных метаболических заболеваний. Сепсис может сопровождать ГИЭ, изменяя клиническую картину. Важно отметить, что неправильная постановка диагноза и соответственно, назначение гипотермии может принести вред пациентам с энцефалопатиями неишемической природы [52]. Данный факт указывает на необходимость поиска маркеров повреждения головного мозга новорожденных, ассоциированных именно с ишемическим / гипоксическим генезом повреждения.

Еще одним препятствием для молекулярной диагностики ГИЭ служит специфичность самого маркера по отношению к повреждению нейрональных клеток. Предполагается, что большинство подобных маркеров должны относиться к белкам, поддерживающим структурную целостность нервной ткани, соответственно при нарушении проницаемости гематоэнцефалического барьера эти маркеры попадают сначала в спинномозговую жидкость, а затем уже в кровь [53]. Но очень часто ситуация складывается таким образом, что выявить специфичные маркеры на фоне общего воспалительного процесса или других дисфункций, сопутствующих при неонатальной асфиксии, становится довольно непростой задачей. Например, было показано, что в пуповинной крови 25 новорожденных с полным сроком беременности, но с развившейся тяжелой формой ГИЭ уровень креатинфосфокиназы мозгового типа (BT-CC) был повышен в несколько раз по сравнению со здоровыми детьми в течение первых 6 и 24 ч жизни [54]. BT-CC при этом не является ферментом, специфичным для повреждения головного мозга, а экспрессируется в большинстве тканей и может быть связан с повреждением других органов при асфиксии [55]. Еще одним кандидатом для использования был фермент убиквитин-С-терминальная гидролаза L1 — специфичный для цитоплазмы нейронов маркер апоптоза. Исследование крови, проведенное у 50 новорожденных (средний гестационный возраст — 37 недель), показало, что уровень этого белка значительно повышается в первые 24 ч жизни новорожденных со средней и тяжелой формой ГИЭ, но обладает очень слабой корреляцией с изменениями, детектируемыми на МРТ уже на пятые сутки жизни и в более позднем периоде (1 год) [56]. Была также показана роль белка легкой цепи нейрофиламента (NFL): он повышался в крови новорожденных со средней и тяжелой формами ГИЭ, проходящих процедуру гипотермии. Первая временная точка была взята по достижении необходимой температуры в камере (18 ч). Несмотря на его высокую корреляцию с картиной МРТ в последующих временных интервалах, повышенный уровень этого белка в первые 6 ч жизни остается под вопросом, и его можно, скорее всего, рассматривать как прогностический признак дальнейшего исхода, а не постановки диагноза [57].

При нарушении целостности гематоэнцефалического барьера происходят активация эндотелиальных клеток и секреция ими неспецифичных маркеров ангиогенеза, например васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF). Помимо того, VEGF могут также секретировать и астроциты с микроглией. Однако данные о его повышении в сыворотке крови у новорожденных с ГИЭ остаются под вопросом [58], и эта молекула не специфична для тканей головного мозга [59]. Примерно схоже ситуация выглядит с адреномодулином и секретонейрином, которые помимо нейрональной ткани секретируются эндокринной и нейроэндокринной системами, и их экспрессия значительно повышается в условиях гипоксии [60, 61].

Маркеры воспаления тоже могут иметь диагностическое значение, так как различные виды иммунных клеток и воспалительных факторов участвуют в повреждении и последующей регенерации после повреждения головного мозга. Было отмечено, что как у доношенных, так и недоношенных детей с неонатальной асфиксией уровни провоспалительных цитокинов в сыворотке крови, таких как TNFα, интерлейкины IL1β, IL6, IL8, IL10 и ряд других, значительно возрастают [62]. Более того, по результатам исследования 20 новорожденных с ГИЭ с гестационным возрастом в среднем 36 недель, в случае развития асфиксии уровень цитокинов в плазме, особенности IL6 и IL8, значительно повышается в диапазоне 6–24 ч жизни и коррелирует с тяжестью течения ГИЭ [63]. Однако необходимо принимать во внимание, что воспалительному процессу при гипоксии-ишемии подвержена любая система организма, особенно у недоношенных детей. Вдобавок сами роды способны провоцировать воспалительную реакцию, а в условиях ГИЭ она может многократно усиливаться [64]. Исследования новорожденных (35 недель гестации) с ГИЭ, прошедших гипотермическую терапию (при 33 °С в течение 72 ч, начатую в первые 6 ч жизни) и без нее, показали важную роль IL6, IL1β, IL8, TNFα и IL10 в развитии ГИЭ и их корреляцию с тяжестью исхода, однако говорить об их специфичности к повреждению тканей головного мозга говорить не приходится. Было показано, что в случае успешной гипотермической терапии уровни IL6, 8 и 10 значительно снижались к 36 ч жизни [65]. В другом исследовании также проводили оценку цитокинового профиля у новорожденных (36 месяцев гестации) с развившейся ГИЭ и помещенных в условия гипотермии в течение первых 6 ч жизни (72 ч 33,5 °С). Образцы крови, отобранные в первые 24 и 72 ч жизни, показали, что только IL6 оставался повышенным в течение 72 ч в группе с тяжелой формой ГИЭ [51].

Из выше проведенных исследований можно сделать следующие выводы: подход, основанный на использовании уникальных единичных маркеров ГИЭ, не показал свою высокую прогностическую способность и целесообразность их дальнейшей трансляции в клиническую практику остается под вопросом. Можно предположить, что для дифференцированной диагностики ГИЭ необходим паттерн биологических молекул, которые могут быть выявлены с помощью омиксных технологий, в частности масс-спектрометрическими методами анализа различных классов молекул, включая белки, липиды, а также различные метаболиты.

На сегодняшний день в литературе представлено всего несколько работ, где авторы применяли протеомный анализ биологических жидкостей новорожденных с ГИЭ [66, 67]. В первом исследовании (2020 г.) было 12 пациентов по 4 новорожденных для каждой степени тяжести ГИЭ и группа контроля (16 детей). Все включенные в исследование пациенты имели гестационный срок 37 недель. Кровь объемом 3 мл отбирали до процедуры гипотермии в течение первых 5–7 ч жизни. Анализ крови проводили методом количественной масс-спектрометрии с применением изобарической метки для относительного количественного определения (iTRAQ). Дальнейший биоинформатический анализ показал, что пациенты с ГИЭ с различной степенью тяжести отличались  от участников контрольной группы по уровню экспрессии белков. Наибольшие изменения были зарегистрированы в группе с максимальной степенью тяжести. Было обнаружено 133 уникальных белка, из них 14 были повышены в крови новорожденных. В основном данные белки участвовали в процессах клеточного повреждения, острого и хронического воспаления, входили в состав мембран внеклеточных органелл и экзосом. Результаты анализа методом Вестерн-блота и ПЦР смогли подтвердить изменения только в двух наиболее сильно изменяющихся белках: гаптоглобине и S100A8. Белок S100A8 участвует в ряде важных биологических процессов, включая воспаление и регуляцию гомеостаза кальция посредством взаимодействия с S100A9 [68]. Комплекс S100A8/A9 ингибирует продукцию провоспалительных цитокинов, подавляя чрезмерно выраженную воспалительную реакцию [69]. В свою очередь гаптоглобин, экспрессирующийся в тканях печени и мозга, является антиоксидантным белком, связывающим свободный гемоглобин, что защищает головной мозг от активных форм кислорода (АФК) при кровоизлияниях [70]. На сегодняшний день это пока единственная работа, в которой был применен протеомный анализ крови новорожденных с ГИЭ [67].

Еще рядом авторов в 2020 г. был  проведен протеомный анализ цереброспинальной жидкости. У четырех новорожденных со сроком гестации 38–39 недель с ГИЭ и менее 5 балов по Апгар при рождении брали образцы цереброспинальной жидкости в течение первых суток жизни. Масс-спектрометрический анализ методом iTRAQ выявил разницу в экспрессии 34 пептидов от 25 белков по сравнению с группой контроля. Биоинформатический анализ показал, что большинство из них связано с процессом укладки хроматина в ядре. Пептид белка теплового шока 90α был наиболее выраженно снижен. Данный пептид вовлечен в процесс гибели клеток путем образования пор в мембране. Для подтверждения данной функциональной активности пептида было проведено исследование in vitro. Эксперименты на линии клеток PC12 продемонстрировали, что пептид белка теплового шока 90α действительно защищает клетки от пироптоза, вызванного глюкозно-кислородной депривацией в течение 6 ч [66]. Подобный подход показывает возможность трансляции данных, полученных на животных и клеточных моделях повреждения головного мозга, с целью выявления специфичных паттернов повреждения для внедрения в клиническую практику. Таким образом, удается анализировать непосредственно клиническую картину повреждения ткани головного мозга, не осложненную сопутствующими при асфиксии заболеваниями и функциональными нарушениями.

Клеточные модели для определения маркеров повреждения головного мозга

С целью упростить многофакторность системы у пациентов с ГИЭ и выявить специфические паттерны повреждения головного мозга применяют протеомный и метаболомный анализ на in vivo и in vitro моделях. Полученные данные можно учитывать при анализе и интерпретации клинических результатов исследования для поиска новых молекулярных паттернов повреждения головного мозга. Так, в одном из исследований проводили процедуру ишемии-гипоксии (перевязка сонной артерии и камера с гипоксическим газом 92% N₂ / 8% O₂ в течение 30 мин) семидневным мышам, а через 24 ч анализировали ткань головного мозга методом масс-спектрометрии. Уже через сутки после гипоксического воздействия была значительно снижена экспрессия белков-медиаторов реакции коллапсина, которые активно участвуют в направлении роста аксонов и роста нейронов в целом [71]. Другие авторы проводили метаболомные исследования на новорожденных свиньях. Животных подвергали процедуре перевязки левой яремной вены и правой сонной артерии, после чего помещали в условия гипоксии для моделирования асфиксии (12–36 ч жизни). У животных отбирали кровь до процедуры, после гипоксии и через 120 мин после гипоксии в течение фазы реоксигенации. Результаты были получены методом жидкостной хроматографии с времяпролетной масс-cпектрометрией: в плазме крови при гипоксии значительно увеличилось содержание метаболитов, свидетельствующих о переходе на анаэробный тип метаболизма, в частности, производных цитидина и уридина, свободных жирных кислот и холина. Авторы предлагают использовать эти соединения в качестве ранних маркеров диагностики ГИЭ у новорожденных [72]. В литературе описан ряд in vitro исследований на клеточных культурах, которые можно рассматривать как подходы по идентификации маркеров повреждения клеток головного мозга. Так, линию клеток гиппокампа мыши HT22 подвергали гипоксии в течение 17,5 ч с целью выяснить позитивное влияние низких концентраций глюкозы 0,69 мM на эти клетки. Протеомный анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии — тандемной масс-спектрометрии позволил выявить около 105 уникальных белков между экспериментальной группой и группой контроля (нормоксия). Дальнейший биоинформатический анализ показал, что большинство из этих 105 белков являются мишенями фактора HIF-1α, индуцируемого гипоксией; несмотря на то, что сам белок определить в протеоме не удалось, его увеличение было обнаружено Вестерн-блоттом. Результатом индукции мишеней HIF-1α стали запуск гликолиза, активация антиоксидантных систем, блокировка воспаления [73]. В другой работе тоже моделировали повреждения, возникающие в первичной культуре нейронов при ацидозе (pH = 6,2) в течение суток, с последующим протеомным анализом. Обнаружено 69 «уникальных» белков, связанных с клеточной гибелью, нарушением синаптической пластичности и окислительным стрессом [74]. Подобные работы показывают применимость клеточных моделей для идентификации уникальных белков, ассоциированных с повреждением нейрональных клеток для решения дальнейших поисковых задач дифференциальной диагностики повреждения нервной системы.

Метаболомные подходы для диагностики и прогноза развития ГИЭ

Анализ метаболомного профиля крови может быть высокочувствительным методом при таких патологиях, как сепсис, ГИЭ, наследственные метаболические нарушения. Некоторые метаболиты-кандидаты могут служить многообещающими биомаркерами для ранней диагностики ГИЭ. Во всех исследованиях бактериального сепсиса у новорожденных были обнаружены изменения в метаболизме глюкозы и лактата, отражающие возможное перераспределение потребления глюкозы от митохондриального окислительного фосфорилирования к пути гликолиза и пентозофосфата, так же как признаки повышенного окислительного стресса и окисления жирных кислот при сепсисе [75].

Следует отметить еще один немаловажный факт — степень тяжести и динамика развития ГИЭ зависит и от гестационного возраста. В связи с этим не исключено, что в зависимости от времени гестации будут меняться протеомные и метаболомные профили как качественно, так и количественно [76, 77]. Показано, что метаболомный профиль специфичен для созревания доношенных и недоношенных новорожденных. Уровни продуктов метаболизма тирозина, биосинтеза триптофана, фенилаланина, цикла мочевины, метаболизма аргинина и пролина в моче демонстрируют значительную корреляцию с гестационным возрастом [78].

Успехи современной масс-спектроскопии и ЯМР с недавнего времени позволяют применять метаболомный анализ и для ГИЭ, потому что стал возможным одномоментный анализ сотен метаболитов в единицу времени, что крайне важно при таких динамически развивающихся патологиях, как ГИЭ. Соответственно природе патологии, метаболомный анализ направлен на обнаружение доказательств клеточной гипоксии и нарушения обмена веществ. Таким образом, исследователи применяют три метаболомных подхода: целевой (т. е. анализ небольшого количества предопределенных метаболитов), полуцелевой (анализ большого количества метаболитов) и нецелевой (анализ всех обнаруженных метаболитов). На данный момент в литературе описано около десятка исследований метаболома мочи и крови новорожденных с ГИЭ. При исследовании мочи использовали ЯМР- и МС- методы.

В одной из работ 2018 г. анализировали мочу, полученную от 10 новорожденных с ГИЭ, средним гестационным возрастом 38 недель и баллом по Апгар от 5 до 7. Мочу отбирали в течение первых 6 и 48 ч жизни во время гипотермии и после терапии (72 ч), а также после месяца жизни. Методом ЯМР было показано, что в образцах мочи погибших пациентов были значительно увеличены уровни лактата, миоинозитола и бетаин, а промежуточные продукты цикла Кребса (цитрат, α-кетоглутарат, сукцинат), ацетон, диметиламин (DMA), глютамин, пируват, N-ацетильные группы, аргинин и ацетат, наоборот, снижены по сравнению с контролем (здоровые дети) [79]. В другой работе 2017 г. применяли метод ВЭЖХ-МС/МС для метаболомного анализа мочи у 13 новорожденных с ГИЭ со средним гестационным возрастом 36 недель и средним баллом по Апгар, равным 2–3. Мочу отбирали на 12 ч, третьи и девятые сутки жизни. Результаты показали достоверное снижение уровня ряда аминокислот (разветвленные лейцин, изолейцин, а также ароматические фенилаланин, тирозин, триптофан) и кинуренина и гиппуровой кислоты, повышение уровня ацилкарнитина между группой ГИЭ и контролем (здоровые дети) [80].

Были проведены и исследования метаболома крови новорожденных с ГИЭ. В одной из работ применен нецелевой метод метаболомного анализа пуповинной крови новорожденных с гестационным возрастом 36 недель и оценке по Апгар 6 баллов с неонатальной асфиксией без ГИЭ, асфиксией с признаками ГИЭ. Пуповинную кровь собирали в течение первых 20 мин после выхода плаценты во время родов. Показано, что между группой младенцев с неразвившейся ГИЭ и ГИЭ существовали статистически достоверные различия в уровне мелатонина, лейцина, кинуренина и 3-гидроксидодекановой кислоты. Были также выявлены маркеры степени тяжести ГИЭ, среди которых D-эритрозофосфат, ацетон, 3-оксотетрадекановая кислота и метилглутарилкарнитин. Биоинформатический анализ показал, что ГИЭ нарушает около 50 и 75% метаболических путей триптофана и пиримидина [81]. В одном из недавних исследований (2021 г.) был применен метод газовой хроматографии с времяпролетной масс-спектрометрией. В данной работе у 24 новорожденных с тяжелой и среднетяжелой формами ГИЭ (гестационный возраст 35 недель, оценка по Апгар меньше 7 баллов) и у 24 новорожденных группы контроля сразу после рождения из бедренной артерии отбирали 2 мл крови с целью получения плазмы и ее дальнейшего метаболомного анализа. Обнаружено, что 52 метаболита в крови новорожденных четко дифференцируют ГИЭ от группы контроля. Эти метаболиты были связаны с путями, участвующими в метаболизме аминокислот, энергетическом обмене, биосинтезе нейротрансмиттеров, метаболизме пиримидина, регулировании HIF кислородом и передаче сигналов от рецепторов, связываемых с G-белком, GPCR. Около 14 метаболитов показали высокую прогностическую значимость для ГИЭ, в частности, аланин, глутаминовая кислота, глутамин, L-яблочная кислота, янтарная кислота, пировиноградная кислота и таурин. Помимо этого, α-кетоглутаровая кислота и гидроксиламин обладали высокой прогностической ценностью между средней и тяжелой формами ГИЭ, площадь под ROC-кривой составила 0,729 [82].

Обнаруженные в данных работах закономерности согласуются с нарушением энергетического обмена и повреждением митохондрий, которые инициируются при ГИЭ. Так, изменения в энергетических метаболитах, которые указывают на переход в сторону анаэробного метаболизма (увеличение лактата) и нарушение цикла Кребса, были наиболее часто встречаемыми результатами в описанных выше работах. Накопление лактата и промежуточных продуктов цикла Кребса (цитрата, альфакето-глутарата, сукцината и фумарата) можно объяснить истощением АТФ и дисфункцией дыхательной цепи. У новорожденных с тяжелой формой ГИЭ повышенный уровень сукцината также может коррелировать с уровнем тяжести энцефалопатии [83]. Стоит также отметить, что в ряде работ неоднократно было отмечено, что и после 48 ч реанимации новорожденные с успешно купированной ГИЭ обладают особенностями метаболизма, отличающими их от здоровых детей [84]. Отдельно стоит упомянуть изменения в глутамине: он необходим для синтеза глутамата — основного медиатора возбуждения во время перинатальной травмы мозга [85]. В подобных работах часто обнаруживают и гипоксантин, который при взаимодействии с ксантиноксидазой образует АФК, губительные для тканей. Его увеличение считают основной характерной биохимической клинической чертой асфиксии [86].

Метаболомный анализ позволил выявить важную роль липидов в перинатальной асфиксии. У холина наиболее повышенный уровень среди липидных метаболитов во время ГИЭ [83]. Холин и его производные необходимы для структурной целостности клеточных мембран и передачи сигналов (фосфолипиды), нейротрансмиссии (синтез ацетилхолина), транспорта липидов (липопротеины) и метаболизма метильных групп (снижение гомоцистеина) [87]. Уровень инозитола, основного предшественника для синтеза фосфорилированных соединений-передатчиков сигналов, значительно увеличивается в крови после перинатальной асфиксии у новорожденных, однако не специфичен к повреждению нервной системы [46, 77]. Подводя итог, можно предположить, что наиболее эффективным и целесообразным направлением движения в области ранней диагностики ГИЭ будет поиск маркеров нейронального повреждения методом метаболомного анализа.

Внеклеточные везикулы в диагностике ГИЭ

В качестве альтернативы стоит рассмотреть и таргетный анализ внеклеточных везикул нейрональных клеток во время ГИЭ. Внеклеточные везикулы (ВВ) — это специализированные контейнеры клеточного происхождения, состоящие из цитоплазмы, окруженной фосфолипидной мембраной [88]. Известно, что ВВ принимают участие в большинстве важных биологических процессов: иммунной регуляции, модуляции воспаления, передаче сигналов от клетки к клетке, ангиогенезе и других. Известно, что ВВ, высвобождающиеся из нейронов, играют важную роль в поддержании их функциональной активности и развитии [89]. Было также  показано, что в случае механического повреждения головного мозга или инсульта число нейрональных ВВ возрастает по сравнению с нормой [90, 91]. ВВ довольно привлекательны для исследователей в качестве диагностических маркеров. Они несут на своей поверхности трансмембранные белки, специфичные для клеток, их продуцирующих, что позволяет отбирать определенные классы ВВ для анализа. На поверхности нейрональных ВВ обнаружены молекулы адгезии, а также лиганды или рецепторы для таргетного взаимодействия с клетками-реципиентами (мишенями), которые, вероятно, могут играть важную роль в синаптогенезе и теоретически служить важными диагностическими маркерами нарушения развития нервной системы. Содержимое ВВ защищено от деградации, что указывает на их прогностическую ценность даже с течением времени или при условии длительного хранения [92–94].

На сегодняшний день в литературе описано всего несколько клинических исследований, где применяли нейрональные ВВ в качестве маркеров повреждения при ГИЭ. В одной из работ (2015 г.) у 14 новорожденных (36 недель гестации, оценка по Апгар — 2–5 баллов) с ГИЭ и помещенных в условия гипотермии в течение первых 6 ч жизни отбирали венозную кровь (500 мкл) через 8, 10 и 14 ч после начала гипотермии. В данной работе был разработан метод получения нейрональных ВВ, суть которого в том, что 100 мкл плазмы, полученной из крови, инкубировали с коммерческим реагентом для осаждения экзосом (EXOQ; System Biosciences, Inc.; Mountainview, CA), после чего полученную суспензию инкубировали с биотинилизированными антителами на контактин-2 — специфичную молекулу адгезии, которые затем преципитировали с помощью стрептавидина. К сожалению, в работе не указана концентрация полученных ВВ, однако сами исследователи говорят о том, что их было довольно мало, так как в дальнейшем методом ИФА в полученных ВВ определяли содержание только четырех маркеров: синаптодопина, синаптофизина, нейрональной енолазы и митохондриальной цитохром-С-оксидазы. Оказалось, что лишь синаптоподин обладает диагностической ценностью, но его изменение отражает уже вторичное повреждение, возникающее после 6 ч жизни [95]. Следует отметить, что данная химическая модификация ВВ делает их не пригодными для масс-спектрометрического или метаболомного анализа. Более того, концентрация частиц в образце позволяет предположить, что измерения, вероятно, будут статистически недостоверны или пройдут на уровне фонового сигнала. В другой работе (2021 г.) этот же коллектив авторов провел исследование венозной крови 26 новорожденных с ГИЭ (гестационный возраст 39 недель, оценка по Апгар — 5 баллов) 0–6, 12, 24, 48 и 96 ч жизни. После выделения нейрональных ВВ способом, описанным выше, методом ИФА определяли нейрональные маркеры: синаптоподин, нейтрофильный, связанный с желатиназой, липокаллин (NGAL) и нейропетраксин-2 [96]. Известно, что NGAL хорошо коррелирует со степенью тяжести и исходом при гемморагическом инсульте, в то же время является маркером почечного повреждения [97, 98]. В свою очередь нейропетраксин-2 входит в систему возбуждающего синаптического окончания, связываясь с α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионат (или АМРА) глутаматным рецептором [99]. Как и в предыдущем исследовании, синаптоподин обладал прогностической значимостью и коррелировал со степенью повреждения на МРТ при незначительном повреждении, но при более серьезной степени повреждения его прогностическая ценность была незначимой, тогда как чувствительность его в диапазоне от 0–12 часов падала с 40 до 18%. Была также обнаружена прогностическая ценность NGAL относительно картины МРТ при средней и высокой степени тяжести, но в диапазоне 12–48 ч. Попытки обнаружить корреляцию между снижением уровня синаптоподина и ростом NGAL во времени не имели успеха [96]. Остается неясным вопрос о возможности применения данного метода для ранней диагностики ГИЭ из-за крайне малого количества образца нейрональных ВВ.

Таким образом, показана перспективность использования методов, основанных на протеомном и метаболомном анализе, для диагностики ГИЭ на ранних этапах развития патологии. Однако требуются исследования, направленные на поиск специфичных для повреждения головного мозга молекулярных паттернов для дифференциальной диагностики в виду сочетания с повреждениями других органов при системном воздействии гипоксии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сохраняющиеся высокие показатели заболеваемости и смертности у новорожденных с ГИЭ свидетельствуют о необходимости поиска дополнительных методов диагностики, подтверждающих перенесенную гипоксию для своевременного принятия решения о проведении терапевтической гипотермии и для исключения пациентов со схожей клинической картиной, таких как ранний неонатальный сепсис, и детей с подозрением на наследственные болезни обмена. Существует прямая зависимость времени начала терапевтической гипотермии и долгосрочным неврологическим исходом: чем раньше начата терапевтическая гипотермия, тем лучший прогноз для пациента. Для ранней дифференциальной диагностики ГИЭ новорожденных могут быть применимы подходы к диагностике метаболических изменений в крови новорожденных с использованием хромато-масс-спектрометрии с выявлением метаболитовкандидатов, имеющих высокий диагностический потенциал при ГИЭ. Использование дополнительных критериев, таких как метаболомные маркеры, будет способствовать более точной постановке диагноза ГИЭ и дифференциальной диагностике с другими заболеваниями.