Изучение процессов патогенеза воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), а также поиск новых подходов для прогноза ответа пациентов на терапию является актуальной проблемой в современной педиатрии. В Российской Федерации распространенность ВЗК составляет 5,1 случай на 100 тысяч населения [1]. Особую обеспокоенность у педиатров вызывает прирост заболеваемости ВЗК среди детей за последнее десятилетие на 30% и выявление тяжелых форм заболевания в раннем детском возрасте [2, 3]. Известно, что к возникновению ВЗК приводит сочетание нескольких неблагоприятных факторов: генетическая предрасположенность, дисфункция иммунной системы, нарушения кишечной микрофлоры, воздействие вредных факторов окружающей среды [4]. Однако наиболее значимыми факторами развития ВЗК считают нарушения в иммунной системе. Показана значимость определения Th17-лимфоцитов (Th17) и регуляторных Т-клеток (Treg) для оценки тяжести патологического процесса и эффективности применяемой терапии при ВЗК [5, 6]. Наивные Т-клетки могут дифференцироваться в Th1, Th2, Th17 и Treg под действием цитокинов, продуцируемых антигенпрезентирующими клетками. Th17 и Treg имеют общий сигнальный путь, опосредованный TGFβ. В присутствии IL6, IL21, TGFβ наивные CD4⁺-Т-клетки дифференцируются в Th17 в отсутствие же провоспалительных цитокинов — в Tregклетки. Нарушение баланса между Th17 и Treg приводит к возникновению различных аутоиммунных заболеваний, включая ВЗК [7, 8].

В последнее десятилетие идет интенсивное изучение пуринергической системы регуляции, оказывающей непосредственное влияние на иммунную систему. Гипотеза о пуринергической передаче сигнала была предложена Джеффри Бернстокком еще в 1972 г. [9]. В современном понимании внеклеточная аденозинтрифосфорная кислота (eATP) играет роль провоспалительного медиатора, участвующего в регуляции клеточного метаболизма, миграции, пролиферации и апоптозе клеток через сигнальные пути, запускаемые рецепторами P2Y и P2X [10, 11]. Ферменты эктонуклеотидазы (CD39, или ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1, E-NTPDase1; CD73, или ecto-5'-nucleotidase, Ecto5'NTase) участвуют в последовательном дефосфорилировании ATP до аденозина, обладающего противовоспалительными свойствами [11]. Дисбаланс между количеством eATP и аденозина может приводить к активации воспалительного процесса [12]. Эктонуклеотидаза CD39 играет важную роль в регуляции воспаления кишечника: высокая экспрессия CD39 в циркулирующих Treg коррелирует с клинической и эндоскопической ремиссией у пациентов с ВЗК [13, 14]. Показано также, что однонуклеотидные полиморфизмы, связанные со снижением экспрессии CD39, повышают риск возникновения болезни Крона [15].

Эктонуклеотидазы экспрессируются в различных популяциях лимфоцитов, в том числе в Тreg и Th17 клетках. Показано, что 90% TregFoxp3⁺ несут на своей поверхности CD39 [16]. Популяция Тreg неоднородна по экспрессии CD39. Т-клетки CD4⁺CD25^highCD39⁺ и CD4⁺CD25^highCD39^–, как было показано при множественном склерозе, подавляли пролиферацию и продукцию Т-эффекторами IFNγ [17]. Но только клетки с фенотипом CD4⁺CD25^highFoxP3⁺CD39⁺ подавляли продукцию IL17, в то время как CD4⁺CD25^highCD39-Тreg продуцировали IL17 [17]. Необходимо отметить, что популяция Th17клеток также неоднородна по экспрессии CD39 и, помимо популяции, оказывающей провоспалительное воздействие на окружающие клетки, есть еще популяция супрессорных Th17-лимфоцитов (supTh17), экспрессирующая высокие уровни CD39 и способствующая продукции аденозина. SupTh17 определяются в периферической крови и в ткани собственной пластинки кишечника у здоровых людей, тогда как их количество снижено у пациентов с БК, что подчеркивает их важность для контроля воспаления в кишечнике [18, 19]. Большинство исследований, посвященных изучению пуринергической передачи сигнала, ранее было проведено у взрослых пациентов с ВЗК [12–14].

В связи с этим, целью настоящего исследования было оценить количество клеток, экспрессирующих эктонуклеотидазы (CD39/CD73) в субпопуляциях CD4⁺лимфоцитов у детей с ВЗК.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Было обследовано 67 пациентов с ВЗК (с болезнью Крона (БК) — 34 пациента, язвенным колитом (ЯК) — 33 пациента) в возрасте 3,4–18 лет, прошедших терапию блокаторами TNF. По течению заболевания дети были разделены на группы: группа 1 — обострение БК (n = 18), группа 2 — ремиссия БК (n = 16), группа 3 — обострение ЯК (n = 22), группа 4 — ремиссия ЯК (n = 11). Разделение пациентов на группы проводили с использованием педиатрических индексов активности болезни PCDAI для БК (≤ 10 — ремиссия, > 10 — обострение) и PUCAI для ЯК (≤ 10 — ремиссия, > 10 — обострение). Группу сравнения (группа 5, n = 45) составили условно здоровые дети в возрасте 3,7–17,5 лет. Критерии включения пациентов в группу 5: отсутствие в стандартном клиническом и биохимическом лабораторном исследовании результатов, выходящих за диапазон референсных значений; отсутствие какихлибо острых или обострения хронических состояний; отсутствие травм; отсутствие в анамнезе аутоиммунных, онкологических и психических заболеваний. Образцы венозной крови для иммунологических тестов получали путем забора из локтевой вены натощак в пробирки BDVacutainer® с антикоагулянтом К2ЭДТА. Иммунофенотипирование лимфоцитов и оценку экспрессии рецепторов пуринэргической передачи сигнала (СD39 и CD73) в Th17-лимфоцитах, в Treg и Т-активированных лимфоцитах (Tact) проводили методом проточной лазерной цитофлуориметрии (Novocyte, ACEA Biosciences; США). Использовали моноклональные антитела, конъюгированные с различными флюорохромами: CD4-FITC (cat. A07750, Beckman Coulter; США), CD127PE (cat. IM 10980U, Beckman Coulter; США), CD25-PC7 (cat. A52882, Beckman Coulter; США), CD161-PE (cat. IM 3450, Beckman Coulter; США), CD3-PC5 (cat. A07749, Beckman Coulter; США), CD39-APC-Cy7 (Clone A1, cat. RT2241130 Sony Biotechnology; США), CD73-APC-Cy7 (Clone AD2, cat. RT2320110; Sony Biotechnology, США). Для лизирования эритроцитов использовали лизирующий раствор BD FACS™ Lysing Solution (BD Biosciences; США), длительность инкубации с которым в темноте при комнатной температуре не превышала 10–12 мин. Выделение популяций клеток, экспрессирующих CD39 и CD73 в регуляторных Т-клетках (CD4⁺CD127^lowCD25^high), Тact-лимфоцитах (CD4⁺CD25⁺CD127^high), Th17-лимфоцитах (CD4⁺CD161⁺CD3⁺) проводили с помощью пошагового гейтирования (рис. 1).

Статистическую обработку полученных данных выполняли с использованием программы Statistica 10.0 (StatSoft; США). Описательная статистика количественных признаков представлена в формате: медиана (нижние и верхние квартили) — Me (Q_0.25–Q_0.75), минимум/максимум (Min/Max). Достоверность различий между группами оценивали с использованием непараметрического U-критерия Манна–Уитни. Различия в распределениях оценивали с помощью критерия χ². Статистически значимыми считали различия при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

CD39 и CD73 в популяциях Т-лимфоцитов у детей с ВЗК в сравнении с группой условно здоровых детей

Анализ числа клеток с экспрессией  CD39 и CD73 у детей с ВЗК показал, что наибольшее число клеток CD39⁺ выявлено в популяции Treg и составило 6–58% от Treg, наименьшее значение — в популяции Tact и составляет 0–14% от Tact. Экспрессия CD73 наиболее выражена в Tact — 2–30% от Tact (табл. 1). В группе сравнения наблюдали аналогичные соотношения по экспрессии CD39 и CD73 в популяциях Т-лимфоцитов (табл. 1).

Соотношение экспрессии CD39 и CD73 у пациентов с ВЗК, так же как и в группе сравнения, зависело от популяции клеток: в популяции Treg экспрессия CD39 (CD39Treg) была достоверно выше, чем CD73 (CD73Treg) (р = 0,000), а в популяции Tact экспрессия CD39 соответственно достоверно ниже CD73 (р = 0,000) (рис. 2A). Число клеток с экспрессией ферментов CD39 и CD73 в Th17-лимфоцитах достоверно не отличалось (табл. 1; рис. 2Б).

У пациентов с ВЗК относительно группы сравнения выявлено достоверное снижение числа клеток с экспрессией CD39 и CD73 в Treg клетках и Tact (табл. 1). Что касается Th17-лимфоцитов, то по экспрессии CD39 группы не различались, а экспрессия CD73 была достоверно ниже в группе детей с ВЗК.

Выявлена прямая корреляционная зависимость между относительным количеством CD39Treg и CD39Tact (r = 0,69; p = 0,000; рис. 3А), CD39Treg и CD39Th17 (r = 0,69; p = 0,000; рис. 3Б) у пациентов с ВЗК. Аналогичные зависимости были выявлены для СD73: число CD73Treg коррелирует с CD73Tact (r = 0,45; p = 0,000); CD73Treg с CD73Th17 (r = 0,46; p = 0,000).

Анализ показал, что экспрессия CD39 в Treg, Tact и Th17 у пациентов с ВЗК не зависела от возраста ребенка. В то же время в группе сравнения выявлена обратная зависимость экспрессии CD39 от возраста для Th17-лимфоцитов (r = –0,39; p = 0,009). Группы пациентов с ВЗК и условно здоровых детей не различались по возрасту (p = 0,435).

Экспрессия CD73 в Th17-лимфоцитах у пациентов с ВЗК, так же как и в группе сравнения, повышалась с возрастом (r = 0,43; p = 0,000).

Длительность заболевания у пациентов в группах составляла от 5 месяцев до 7,7 лет, а длительность проводимой терапии — 2–288 недели. Зависимости количества клеток с экспрессией CD39/CD73 от длительности заболевания и длительности терапии выявлено не было.

Экспрессия CD39/CD73 в популяциях CD4⁺-клеток в группах детей при обострении ВЗК и ремиссии заболевания

Был проведен сравнительный анализ экспрессии CD39 и CD73 в популяциях CD4⁺-лимфоцитов у пациентов с БК и ЯК при обострении (группа 1, группа 3) и при ремиссии заболевания (группа 2, группа 4) между собой и по сравнению с группой условно здоровых детей (группа 5) (табл. 2). Для пациентов с БК выявлено достоверное снижение относительного числа клеток с экспрессией CD39 в группе 1 по сравнению с группой 2 в популяциях Treg и Tact. В группе детей с БК при обострении (группа 1) было получено достоверное снижение экспрессии CD39 и CD73 в популяциях Treg, Tact, Th17 относительно группы 5 (табл. 2). Между группой пациентов с БК в ремиссии и группой сравнения достоверных различий выявлено не было, за исключением снижения экспрессии CD73 в Treg (табл. 2).

Для пациентов с ЯК выявлено достоверное снижение процента Tact, экспрессирующих CD39, в группе пациентов с обострением заболевания относительно группы 5. Кроме того, в группе пациентов с обострением ЯК было выявлено достоверное снижение экспрессии CD73 в Treg и Th17 по сравнению с группой условно здоровых детей (табл. 2). В то же время между группой пациентов с ЯК при ремиссии и группой сравнения достоверных различий получено не было.

Выявлены достоверные различия в экспрессии CD39 в Treg у пациентов с БК в состоянии обострения и ремиссии (рис. 4А). Из-за большого разброса показателей у детей с ЯК достоверных различий между группами 3 и 4 по экспрессии CD39 в Treg получено не было (рис. 4В). Графики на рис. 4Б и рис. 4Г отражают распределение пациентов с БК (группы 1 и 2) и ЯК (группы 3 и 4) по экспрессии CD39 в Treg: в каждой группе выявляются пациенты с низкой и высокой частотой экспрессии. На графиках видно, что точка разделения пациентов в обострении с высокой и низкой экспрессией CD39 в Treg приходится на 20% клеток. При проведении анализа распределения пациентов с БК по количеству клеток с экспрессией CD39 в Treg было отмечено, что у 78% пациентов в обострении субпопуляция CD39Treg составляла менее 20% клеток (рис. 4В). Напротив, в состоянии ремиссии у 82% пациентов субпопуляция CD39Treg составляла более 20% клеток (рис. 4В). В группе 3 у трети пациентов маркер CD39 в Treg экспрессировался менее чем в 20% клеток, у 67% — более 20% Treg (рис. 4Г). У 100% пациентов группы 4 CD39 экспрессировали более 20% Treg (рис. 4Г).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

При изучении взрослых здоровых доноров показано, что уровень экспрессии СD39 в Treg может варьировать в диапазоне 2–60%, что отражается на способности этих клеток к гидролизу ATP [20]. Клетки доноров с большим числом CD39 в Treg осуществляют гидролиз ATP более эффективно. Нами было показано, что у здоровых детей экспрессия СD39 в Treg колеблется от 19–49%. Оценка содержания клеток с экспрессией эктонуклеотидаз в CD4⁺лимфоцитах у детей с ВЗК, принимавших блокаторы TNF, показала, что экспрессия СD39 превалирует у пациентов в стадии ремиссии заболевания, что согласуется с данными других авторов [13].

Известно также, что лечение анти-TNF-препаратами у взрослых вызывало увеличение экспрессии CD39 в Treg [21]. В нашем исследовании группа пациентов в стадии обострения БК имела достоверно более низкие количества Treg с экспрессией CD39 по сравнению с группой пациентов в стадии ремиссии БК. При сравнении пациентов с БК и ЯК при обострении заболевания оказалось, что число пациентов, имеющих низкую экспрессию CD39 в Treg, больше при БК, чем при ЯК.

В одной из работ, посвященных оценке функциональной активности CD39 в Treg у пациентов с аутоиммунными гепатитами, показано снижение гидролиза ATP и образования аденозина [22]. Можно предположить, что у пациентов с ВЗК тоже снижена эффективность гидролиза ATP за счет снижения активности CD39. Этим можно объяснить факт наличия пациентов с БК с высокой экспрессией CD39 в Treg при недостаточном эффекте от анти-TNFтерапии и обострении заболевания. Вероятнее всего, увеличение количества Treg, несущих на своей поверхности эктонуклеотидазу CD39, имеет компенсаторный характер и происходит в ответ на недостаточную активность фермента.

В нашем исследовании показано, что количество лимфоцитов субпопуляции supTh17, обладающих супрессорной активностью, у детей в обострении БК было достоверно ниже, чем в группе условно здоровых детей. Представляется перспективным определение supTh17популяции в качестве дополнительного маркера состояний обострения/ремиссия. Кроме того, как у здоровых детей, так и у детей с ВЗК, количество данной популяции снижается с возрастом. Можно предположить, что снижение популяции supTh17 увеличивает вероятность развития воспалительного процесса с возрастом.

CD73 играет важную роль в поддержании гомеостаза кишечника [23–25]. На нокаут-мышах было продемонстрировано, что отсутствие CD73 приводит к выраженному воспалению толстой кишки и повреждению тканей у мышей [26]. В нашем исследовании у детей с ВЗК относительно группы сравнения выявлено снижение экспрессии CD73 в Treg, Tact, Th17. CD73 оказывает свою ферментативную активность, расщепляя AMP до аденозина, не только в виде заякоренного белка на мембране, но и в растворимой форме [27]. Возможно, что для оценки состояния пациента необходимо определять не только экспрессию CD73 в CD4⁺-клетках, но и исследовать активность его растворимой формы, которая, как показано, коррелирует с тяжестью воспалительного процесса [28].

ВЫВОДЫ

Результаты нашего исследования показывают, что число клеток, экспрессирующих эктонуклеотидазы CD39 и CD73 в популяциях CD4⁺-лимфоцитов, зависит от популяции клеток и в значительной степени связано с состоянием обострения или ремиссии, и, соответственно, с эффективностью проводимой анти-TNF-терапии. Большинство детей в стадии ремиссии ВЗК имеют высокий уровень CD4⁺-лимфоцитов с экспрессией эктонуклеотидаз, что способствует снижению активности воспаления за счет преобразования АТФ в аденозин. Однако случаи высокой экспрессии CD39 встречаются и в стадии обострения заболевания, что может быть связано с различной активностью экспрессируемого фермента. Мы полагаем, что дальнейшие исследования по оценке функциональной активности эктонуклеотидаз СD39 и СD73 в совокупности с количественными показателями могут быть информативны для прогноза и оценки эффективности анти-TNF-терапии при ВЗК.