Проблему влияния фторидов на организм и здоровье человека изучают давно.  В настоящее время отрицательное влияние фтора на организм доказывают ведущие ученые в области медицины, химии, гигиены труда и питания [1]. Известны эффекты фторидов на стоматологическое здоровье, они вызывают эндемические заболевания (флюороз, кариес) при избыточном и недостаточном поступлении [2]. Фторид-ионы могут воздействовать на фосфоенолпируваткиназу и тем самым ингибировать гликолиз, в результате чего снижаются продукция молочной кислоты, развитие и размножение кариесогенной микрофлоры в полости рта. Действие фтора на другие органы и ткани организма исследовано недостаточно [3]. Фториды ингибируют активность ферментов, кофакторами которых являются ионы марганца, кальция, железа и магния. Основными источниками фтора, попадающего в организм человека, служат питьевая вода, продукты питания, пыль, газообразные соединения фтора, поступающие через легкие при дыхании. Установлена среднесуточная потребность во фторидах (для взрослого человека 2–3 мг) [4]. До 70% фтора человек получает с питьевой водой и около 30% с пищей. Одно из важных значений фторидов — в профилактике развития кариеса зубов. Выявлена зависимость между содержанием фтора в организме и пораженностью людей флюорозом, в том числе с учетом тяжести течения эндемического процесса. Доказана взаимная зависимость кариеса и флюороза временных и постоянных зубов при различном содержании фтора в питьевой воде. Изучена интенсивность кариеса зубов, особенно у детей в зависимости от содержания фтора в питьевой воде [5].

Ключевые исследования в отечественной и зарубежной литературе затрагивают влияние фтора на течение и исход заболеваний твердых тканей зубов (кариес, флюороз). Мы не обнаружили публикаций об изменении интервальных значений фторид-ионов при затрудненном прорезывании зубов «мудрости». Изменение концентрации фторид-ионов при данных заболеваниях имеют важное практическое значение в силу прорезывания таких зубов в гипоминерализованном состоянии [6, 7]. Наличие воспалительного процесса при затрудненном прорезывании зубов «мудрости» негативно отражается на состоянии гомеостаза органов и тканей полости рта. Следовательно, повышение концентрации фторидионов до критических значений может иметь негативные последствия, особенно при наличии дополнительных очагов инфекции в полости рта.

В терапевтической стоматологии применяют препараты на основе фторидов, что является относительно недорогим и доступным методом лечения очаговой деминерализации эмали. Ионы фтора предотвращают кариес, влияют на метаболизм бактерий в зубном налете за счет ингибирования ферментативных процессов, тем самым уменьшают выработку кислот. Следовательно, уменьшается деминерализация кариозного поражения на ранних стадиях [8]. Однако простые фториды не могут предотвратить возникновение кариеса из-за кратковременности их нахождения на поверхности зуба и низкой концентрации выделяемого фтора. Применение малоэффективных простых фторидов в виде зубных паст, гелей, средств для полоскания, лаков для локального фторирования зубов — еще одна причина сохранения высокого уровня кариеса и некариозных поражений зубов. Зубные пасты и средства для полоскания, содержащие антимикробные компоненты, оказывают некоторое подавляющее воздействие на микробную биопленку, покрывающую поверхность зуба, однако они не обладают реминерализующим свойством [9]. Поэтому необходимо применение методов глубокого фторирования. Назначение препаратов фтора основывается только на стоматологическом статусе и не подкрепляется лабораторными исследованиями содержания фторидионов в организме. Важно учитывать, что фтор относится к микроэлементам, для которых характерен относительно резкий переход от физиологически полезных концентраций до концентраций, вызывающих токсикоз [10], именно поэтому определение фторидов в биологических субстратах имеет важное диагностическое значение [11]. Индикатором содержания фторидов в организме является их наличие в крови, слюне, моче, костях, волосах [12].

Перспективной биологической жидкостью, отражающей общее состояние организма, является ротовая жидкость [13–15]. Благодаря возможности неинвазивного сбора и отсутствию риска инфицирования при получении биоматериала ротовая жидкость обладает очевидными преимуществами по сравнению с венозной или капиллярной кровью [16]. Состав ротовой жидкости адекватно отражает биохимический статус и физиологическое состояние человека [17]. Отсутствие унифицированного метода определения фторидов в биологических образцах затрудняет выбор надежного и воспроизводимого способа. Метод капиллярного электрофореза (КЭ) является одним из современных методов определения ионного состава различных объектов [18, 19]. Его совершенствование позволяет все более широко применять этот метод в различных областях аналитической химии [20]. Простота и доступность, а также неоспоримые преимущества, которые он дает при выполнении измерений, позволяют использовать его в повседневной лабораторной практике, а полученные результаты применять в различных областях медицины, в частности стоматологии для оценки тяжести и характера течения одонтогенных заболеваний.

На основании изученной литературы мы сочли целесообразным исследовать влияние стоматологических заболеваний на изменение концентрации фторид-ионов в ротовой жидкости. Повышение указанных ионов может нести негативные последствия для созревания и минерализации твердых тканей зубов человека или утяжелять течение заболеваний органов и тканей полости рта.

Цель исследования — разработка и апробация методики количественного определения фторидов в ротовой жидкости методом капиллярного электрофореза при множественном кариесе и остром перикороните.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Клиническое исследование

В контрольную группу были выбраны 200 людей с удовлетворительным уровнем гигиены полости рта и значением КПУ от 0 до 4,4 (среднее значение — 3,3 ± 0,4). Для апробации методики определения фторид-ионов в ротовой жидкости отобрали две исследованные группы: первая включала пациентов с острым перикоронитом на фоне множественного кариеса и значениями КПУ более 6,6 (среднее значение — 11,9 ± 0,6) (20 человек) в возрасте 20–25 лет. Во вторую группу отобрали пациентов с острым перикоронитом, удовлетворительным уровнем гигиены полости рта и значениями КПУ от 0 до 4,4 (среднее значение — 3,6 ± 0,5) (20 человек) в возрасте 20–25 лет. По результатам проведенного анкетирования установлены критерии включения: в контрольной группе — удовлетворительный уровень гигиены, КПУ — от 0 до 4,4, возраст — 20–25 лет; женский пол; в исследованной группе 1 — наличие острого перикоронита и множественного кариеса (КПУ более 6,6), возраст — 20–25 лет, женский пол; в исследованной группе 2 — наличие острого перикоронита, удовлетворительный уровень гигиены, КПУ от 0 до 4,4, возраст — 20–25 лет, женский пол. Критерии исключения: возраст менее 20 лет и более 25 лет, неудовлетворительный уровень гигиены, мужской пол, наличие хронических соматических, воспалительных и инфекционных заболеваний, оказывающих негативное влияние на твердые ткани зубов и пародонт, наркотическая и алкогольная зависимость, прием ульцерогенных лекарственных препаратов. Обследование всех пациентов проводили на базе отделения стоматологии общей практики БУЗ Омской области «Городская клиническая стоматологическая поликлиника №1» в 2021–2022 гг. Пациенты исследованных групп были набраны во время приема врача-стоматолога после подтверждения диагноза.

У пациентов контрольной группы забор ротовой жидкости осуществляли натощак в стерильные пробирки для определения нормальных интервальных значений. В первой и второй исследованных группах забор ротовой жидкости проводили по аналогичной методике до проведения хирургического вмешательства (удаление зубов 38, 48, которые по результатам рентгенологического исследования находились на стадии полуретенции под слизистой оболочкой и капюшоном), на первые и третьи сутки по поводу острого перикоронита. Полученные образцы центрифугировали при 7000 об./мин. Определение концентрации фторид-ионов образцов ротовой жидкости проводили двумя методами: методом капиллярного электрофореза и фотометрическим методом.

Методика проведения капиллярного электрофореза

Разработку методики капиллярного электрофореза ротовой жидкости проводили с использованием системы капиллярного электрофореза КАПЕЛЬ-105М (Люмэкс; Россия) [21, 22]. Аппаратурное оформление и подготовка капилляра к работе описаны ранее [22]. Объем ротовой жидкости составил 100 мкл, проведено разбавление в 20 раз в дистиллированной воде. В отличие от приведенной ранее методики показано, что отсутствует необходимость предварительного осаждения белка [22]. Для определения анионов (хлориды, нитриты, нитраты, фосфаты, фториды, сульфаты) использовали ведущий электролит, содержащий CrO₃ (10 мМ), диэтаноламин (30 мМ) и цетилтриметиламмония гидроксид (2 мМ).

Методика фотометрического определения фторидов

В основе метода лежит определение изменения цвета циркон-ализаринового комплексного соединения в результате образования бесцветного более прочного комплексного соединения фторид-ионов с хлористым цирконилом (IV) [23]. При реакции с фторидом цирконализариновый комплекс освобождает ализарин, который окрашивает раствор в желтый цвет. В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносили 5 мкл ротовой жидкости, доводили объем пробы дистиллированной водой до метки, приливали 5 см³ раствора ализаринового красного С и 5 см³ кислого раствора хлористого цирконила, приготовленных по ГОСТ 23268.18-78. Раствор тщательно перемешивали, выдерживали в течение часа при комнатной температуре и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм против холостой пробы.

Статистическая обработка данных

При статистической обработке экспериментальных данных проводили проверку характера распределения, подтвердили нормальное распределение, поэтому рассчитывали доверительные интервалы по критерию Стьюдента. Значения р-value приведены для уровня значимости 0,95.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработка методики определения фторидов методом капиллярного электрофореза

На первом этапе была проведена градуировка прибора. В табл. 1 представлены основные характеристики пика фторид-иона, рассчитанные исходя из полученных электрофореграмм градуировочных смесей. Для построения градуировочного графика использовали значение площади пика фторид-иона (рис. 1).

Поскольку в дальнейшем предполагалось определять фторид-ионы в ротовой жидкости, для построения градуировочного графика был использован раствор. В его состав входили все анионы, которые гипотетически могли быть обнаружены в слюне (рис. 2А). На рисунке на врезке показано изменение площади пика фторид-иона при изменении его концентрации в пробе.

При анализе проб ротовой жидкости не было обнаружено пиков нитрит- и нитрат- ионов (пики 2 и 4 соответственно). Типичная электрофореграмма для определения анионов слюны представлена на рис. 2Б. Для оценки сходимости результатов необходимо производить запись электрофореграммы одного образца в трех–четырех параллелях. Для того чтобы убедиться в правильной идентификации пика фторид-иона, проведено исследование методом «введено–найдено», согласно которому в образец с заранее определенным содержанием компонента вводят добавку с точно известной концентрацией (использовали государственный стандартный образец (ГСО) с концентрацией определяемых компонентов 1 мг/мл). Отмечено, что при введении добавок увеличиваются высота и площадь пика, идентифицируемого как фторид-ион (рис. 2Б). Установлено, что при введении добавки погрешность определения содержания фторидионов не превышает 10%.

Параллельно проведено определение в образцах фторидионов фотометрическим методом. Расчет концентрации фторид-ионов производили по предварительно построенному градуировочному графику (рис. 3). Следует отметить, что определение концентраций фторид-ионов возможно только в узком диапазоне при невысоких значениях. Это связано с тем, что при больших концентрациях зависимость оптической плотности от концентрации не является линейной. Поэтому аликвоты образца необходимо многократно разбавлять (табл. 2), что негативно сказывается на точности результатов измерения.

Показано, что значения концентраций фторид-ионов, определяемых методом капиллярного электрофореза и спектрофотометрическим методом, совпадают (табл. 2). Полученный результат позволяет говорить о равноценной возможности использования описанных методов. Однако, в связи с ограниченным диапазоном определяемых концентраций и сложностью разбавления, применение спектрофотометрического способа определения становится спорным. Так, при одинаковой аликвоте исследуемого образца методом капиллярного электрофореза концентрация фторид-ионов определяется во всех случаях, тогда как для применения спектрофотометрического метода необходимо подбирать условия разбавления, чтобы попасть в нужный диапазон концентраций (табл. 2). Содержание фторид-ионов у 200 добровольцев контрольной группы в среднем составило 2,27 ± 1,07 мг/л, но диапазон варьирования — от 0,16 до 8,7 мг/л, поэтому удобнее и целесообразнее использовать метод, при котором не требуется подбирать концентрацию фторид-ионов в пробе путем предварительного разбавления. В частности, метод капиллярного электрофореза удовлетворяет заявленным требованиям.

Апробация методики определения фторидов в ротовой жидкости при множественном кариесе и остром перикороните

Содержание фторидов в контрольной группе составляет 2,16 ± 0,48 мг/л. Полученные интервальные значения фторидов в ротовой жидкости, установленные методом капиллярного электрофореза, позволили нам использовать при оценке их изменчивости в исследованных группах, в которых наблюдается неблагоприятная клиническая ситуация в полости рта (зубы, пораженные кариозным процессом, острый перикоронит).

У пациентов исследованной группы 1 до хирургического вмешательства по поводу острого перикоронита отмечены максимально высокие значения содержания фторидов в ротовой жидкости (18,9 ± 4,2 мг/л), в исследованной группе 2 показатели тоже высокие (15,2 ± 2,7 мг/л).

На первые сутки после проведенного лечения отмечено достоверное снижение концентрации фторидов в исследованной группе 1 (9,4 ± 2,1 мг/л) и исследованной группе 2 (11,4 ± 2,8 мг/л).

При сравнении содержания фторидов на третьи сутки после проведенного лечения в исследованной группе 1 происходит снижение показателей до интервальных значений контрольной группы (2,16 ± 0,48 мг/л). В исследованной группе 2 показатели остались высокими (8,7 ± 1,9 мг/л), что указывает на влияние множественного кариозного процесса и острого перикоронита на концентрацию фторидов в ротовой жидкости. Различия между исследуемыми группами статистически достоверны (р < 0,0001) (рис. 4).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Анализ литературных данных по балансу фтора в организме показывает, что основное поступление фтора связано с пищей и водой; помимо этого возможно влияние факторов окружающей среды, а именно профессиональная интоксикация в производственных помещениях с высоким содержанием фтора в воздухе. Множество работ посвящены изучению содержания фтора в объектах окружающей среды [3, 4, 10]. Следует отметить, что в регионах и областях проживания людей содержание фтора в окружающей среде различается [11], соответственно норма содержания фторид-ионов в организме человека тоже будет варьировать в зависимости от региона проживания [24–26]. Многими авторами показана взаимосвязь различных системных заболеваний с содержанием фторид-ионов, но в большинстве случаев ее оценивали косвенно, по содержанию фторид-ионов в объектах окружающей среды [27]. Так, показано, что существует прямая корреляция между содержанием фтора в воде и заболеваемостью сахарным диабетом, ревматизмом, пиелонефритом, эрозией шейки матки, а также между отношением фтор/сульфаты в воде и цереброваскулярной болезнью, болезнями мочеполовой системы, женских половых органов, нервной системы и органов чувств [27]. Практически отсутствуют данные о взаимосвязи заболеваний с содержанием фторид-ионов в биологических жидкостях, в том числе и в ротовой жидкости. Накопление фтора происходит в зубах, особенно большое его количество обнаружено на поверхности эмали, поэтому определение фтора именно в слюне должно быть информативным. В нестимулированной слюне концентрация фторидов отражает сумму фторидов, присутствующих в протоковой слюне и поступающих из пищи и воды [28]. Заболевания полости рта, такие как кариес и флюороз, напрямую связаны с концентрацией фторид-ионов. Поэтому своевременное определение и коррекция поступления фторид-ионов в организм имеют важное значение для оценки стоматологической заболеваемости. Описаны разные методы определения фторидов, что также усложняет сопоставление результатов, полученных разными авторами, при этом в разных методах и даже странах используют различные единицы измерения (мг/л, ммоль/л, ppm и др.) [11, 25, 29]. Для объектов окружающей среды используют капиллярный электрофорез, потенциометрический и фотометрические методы определения фторид-ионов. В целом, все перечисленные методы могут быть применены и для ротовой жидкости, однако в большинстве источников отсутствуют детальное описание, по которому можно воспроизвести методику, и подтверждение валидации метода [25]. Помимо описанных в настоящей работе встречается методика спектрофотометрического определения концентрации ионов фтора при 570 нм с использованием комплекса тринатрий 2-(4-сульфофенилазо)-1,8дигидроксинафталин-3,6-дисульфоната в качестве исходного комплекса и последующего его обесцвечивания за счет иона фтора [29]. Потенциометрические методы характеризуются большой погрешностью определения и необходимостью удаления мешающих примесей. Нами предложены методы, позволяющие определять фторидионы во всем диапазоне варьирования их содержания в слюне как фотометрически, так и с использованием капиллярного электрофореза. Следует отметить, что именно метод капиллярного электрофореза позволяет одновременно с фторид-ионами определять содержание еще пяти анионов, важных с физиологической точки зрения (хлориды, нитраты, нитриты, сульфаты, фосфаты), что расширяет возможности его применения.

Вопросы исследования состава ротовой жидкости при фторировании эмали зубов достаточно широко освещены в литературе [2, 8, 9]. В основной массе исследований определяют соотношение Ca/P и не анализируют содержание фторидов в ротовой жидкости.

В исследованных группах нами выявлено максимально высокое содержание фторид-ионов в ротовой жидкости. В литературных источниках идет дискуссия относительно того, является ли прорезывание зубов локальным или системным процессом [30]. Изменение физико-химических показателей слюны, в том числе и содержания фторидов, позволяет предположить системный характер происходящих процессов. Поскольку зуб «мудрости» в момент сбора слюны уже почти прорезался, увеличение содержания фторидов может свидетельствовать о защитной реакции организма, поскольку зуб «мудрости» прорезывается гипоминерализованным и эмаль необходимо насыщать важными ионами, чтобы укрепить кристаллическую решетку. Другой причиной увеличения содержания фторид-ионов можно считать сопутствующий воспалительный процесс и активное развитие бактериальной флоры, требующее дальнейшего назначения антибактериальных препаратов.

К ограничениям исследования можно отнести тот факт, что определение фторид-ионов проведено у жителей одного региона (Омская область), а также небольшую выборку пациентов в обеих исследованных группах, что обусловливает необходимость продолжения исследований по данной проблеме.

ВЫВОДЫ

У пациентов с множественным кариесом и острым перикоронитом наблюдается неблагоприятная ситуация по концентрации фторид-ионов в ротовой жидкости. Несмотря на устранение острого воспалительного процесса по поводу острого перикоронита, концентрация фторидионов не возвращается к нормальным интервальным значения у пациентов из контрольной группы, в отличие от группы пациентов с удовлетворительным уровнем гигиены полости рта и значениями КПУ от 0 до 4,4. Несмотря на клиническую важность поступления фторид-ионов из ротовой жидкости, в том числе на этапе прорезывания зубов, этот процесс должен быть контролируемым и физиологическим, проходить с удовлетворительным уровнем гигиены и отсутствием очагов инфекции в полости рта. Метод капиллярного электрофореза можно использовать для определения концентрации фторидионов в ротовой жидкости.