Хроническое системное воспаление составляет патогенез многих многофакторных неинфекционных заболеваний, в том числе алиментарно-зависимых, таких как сахарный диабет 2-го типа, ожирение, метаболический синдром (МС). В механизмах развития инсулинорезистентности хроническое низкоинтенсивное воспаление жировой ткани играет ключевую роль [1]. Метаболические условия (гипергликемия, гиперинсулинемия, гиперлипидемия) способствуют формированию провоспалительного функционального фенотипа клеточных элементов жировой ткани. Макрофаги, инфильтрирующие жировую ткань, фенотипически меняются с противовоспалительных типа М2 на активированные провоспалительные макрофаги типа М1. Гипертрофированные адипоциты и поляризованные резидентные М1-макрофаги секретируют большое количество адипокинов (лептин, резистин и др.), провоспалительных цитокинов (IL6, TNFα, IL1β и др.) и хемокинов (MCP-1, MIF, CCL-2 и др.), стимулируя инфильтрацию жировой ткани макрофагами-рекрутами [1, 2]. Это способствует самоподдержанию воспалительного процесса и потенциирует инсулинорезистентность адипоцитов.

Развитие хронического субклинического воспаления у пациентов с МС, ассоциированным с ожирением, уже не вызывает сомнений. При этом отсутствуют четкие клинико-лабораторные критерии основных феноменов хронического системного воспаления, характеризующие варианты его развития, стадийность, выраженность реакций компенсации, повреждения и дезадаптации. Экспериментальные модели на животных — удобный инструмент для анализа ранних и поздних проявлений системной воспалительной реакции, а также механизмов развития хронического системного воспаления при заболеваниях, для которых характерно изменение многих параметров гомеостаза [3].

Одним из наиболее распространенных подходов к созданию животных моделей МС, ассоциированного с ожирением, является использование комбинированной высокожировой диеты с повышенным содержанием углеводов в режиме свободного доступа к корму [4, 5]. Такая диета в большой степени соответствует этиопатогенетическим особенностям алиментарноконституционального ожирения у человека и, как правило, является устойчивой моделью соответствующих метаболических нарушений — инсулинорезистентности, гипергликемии, дислипидемии и др. Вместе с тем было отмечено, что лишь у части животных-моделей (60–80%) формирование индуцированного диетой ожирения сопровождается дальнейшим развитием спектра метаболических нарушений, в полной мере соответствующего критериям МС [6, 7]. В связи с этим при моделировании МС представляются важными выявление и анализ дополнительных параметров, которые могли бы выступить в качестве потенциальных валидных биомаркеров, адекватно характеризующих патогенез МС и ассоциированных с ним состояний, в том числе хроническое системное воспаление.

Целью исследования были оценка и анализ изменений параметров системной воспалительной реакции у крыс в модели диет-индуцированного МС.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальная модель МС была создана на крысахсамцах Wistar (33 крысы, средняя масса 28,5–36,1 г, возраст на начало исследования — 6 недель). Животные для исследования были получены из вивария НИИФиРМ им. Е. Д. Гольдберга Томского НИМЦ (г. Томск, Россия). Крысы были рандомизированы на контрольную и экспериментальную группу (15 и 18 животных соответственно) и содержались в условиях вивария (температура воздуха — 20–26 °С, относительная влажность воздуха — 40–70%, световой режим — 12:12). Животных содержали в клетках из полипропилена по три особи в каждой (площадь пола — 1612 см²). Критерии включения животных в эксперимент: отсутствие клинических признаков нарушения здоровья; отклонение массы тела не более 10% от среднего значения. Крысы контрольной группы находились на стандартной диете с соотношением белков, жиров и углеводов —  24% : 6% : 44% (корм «Дельта Фидс»; Биопро, РФ) со свободным доступом к пище и воде. Крысы экспериментальной группы в течение 12 недель находились на высокожировой и высокоуглеводной диете (ВЖВУД), содержащей стандартный лабораторный корм (66%), смешанный с топленым свиным салом (17%), фруктозой (17%), холестерином (0,25%, Cholesterol; Sigma, США) (соотношение белков, жиров и углеводов — 16%:21%:54%), с заменой питьевой воды на 20%-й раствор фруктозы.

Оценку состоятельности сформированной модели критериям МС проводили методами, описанными нами ранее [5, 8]. У животных экспериментальной группы (в сравнении с контрольными) анализировали следующие параметры: уровень артериального давления (система «Систола»; «Нейроботикс», Россия), массу тела (взвешивание на аналитических весах Pioneer PX224, OHAUS, КНР), удельный вес висцеральной жировой ткани и печени (взвешивание на аналитических весах Pioneer PX224, OHAUS, КНР; вычисление отношения массы ткани на 100 г массы тела крысы), а также результаты биохимических тестов: уровень глюкозы в крови натощак и в пероральном тесте на толерантность к глюкозе спектрофотометрическим методом с использованием ферментативных наборов (Chronolab; Испания), концентрацию триацилглицеролов, общего холестерола (ХС), холестерола в составе липопротеинов низкой (ХСЛПНП), очень низкой (ХС-ЛПОНП) и высокой плотности (ХС-ЛПВП) в сыворотке крови на автоматическом анализаторе Architect с4000 (Abbot; США).

Выведение животных из эксперимента осуществляли методом СО₂-асфиксии. Кровь отбирали из сердца в две пробирки: с активатором свертывания для получения сыворотки и последующего биохимического и иммуноферментного анализа, а также с антикоагулянтом для оценки количественных показателей белой крови.

Для оценки интенсивности воспалительного процесса определяли общее количество и морфологический состав лейкоцитов в крови при помощи автоматического анализатора BC-2800 Vet (Mindray; Китай), концентрацию общего белка методом Брэдфорд, высокочувствительного С-реактивного белка (Rat CRP ELISA Kit, Elabscience Biotechnology; Китай).

Методом иммуноферментного анализа оценивали содержание в сыворотке крови цитокинов IL6, IL10, TNFα (наборы Bender MedSystems GmbH; Австрия), концентрацию инсулина (Insulin Rat ELISA Kit, Thermo Fisher Scientifiс; США) и лептина (Leptin Rat ELISA Kit, Thermo Fisher Scientific; США). Гомеостатическую модель оценки инсулинорезистентности (HOMA-IR) рассчитывали по следующей формуле:

(сывороточный инсулин) × (сывороточная глюкоза) / 22,5.

С целью оценки интенсивности локального воспаления в жировой ткани определяли уровень продукции активных форм кислорода (АФК) c помощью красителя с заблокированной флуоресценцией — 2,3-дигидродихлорфлуоресцеина диацетат (ДГХФ-ДА). Для этого фрагменты висцеральной жировой ткани массой 50 мг инкубировали в течение 60 мин в присутствии 10 мкМ ДГХФ-ДА. Оценивали флуоресценцию при длине волны возбуждения 530 нм и длине волны испускания 485 нм с помощью микропланшетного ридера (Infinite 200 Pro M-plex, Tecan; Швейцария) [9].

Статистическую обработку данных проводили в программе SPSS Statistics 23 (IBM; США). Данные, подчиняющиеся нормальному закону распределения, представлены в виде среднего и стандартного отклонения (M ± SD), не подчиняющиеся — медианы (Me) и межквартильного интервала (Q₂₅; Q₇₅). Анализ различий между выборками выполняли при помощи t-критерия Стьюдента или U-критерия Манна–Уитни. Пороговое значение достигнутого уровня значимости (p) было принято равным 0,05. Для оценки статистической взаимосвязи между количественными показателями вычисляли коэффициент ранговой корреляции Спирмена или коэффициент парной корреляции Пирсона.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В результате ВЖВУД продолжительностью 12 недель у животных экспериментальной группы формировались физиологические и лабораторные признаки метаболических нарушений. При сравнении анализируемых параметров у крыс опытной группы в отличие от интактных животных были зарегистрированы артериальная гипертензия, увеличение массы тела, повышение удельного веса печени и висцеральной жировой ткани. При проведении биохимических тестов было выявлено нарушение толерантности к глюкозе (увеличение площади под кривой «концентрация глюкозы–время» (AUC0–120)), гипергликемия натощак, а также изменения показателей липидного спектра, которые характеризовались повышением уровней ТАГ, общего ХС, ХС-ЛПНП и ХС-ЛПОНП (табл. 1). Выявленные изменения позволили сделать вывод о состоятельности воспроизведенной модели и ее пригодности для анализа дополнительных критериев МС.

В качестве критерия, свидетельствующего о формировании состояния инсулинорезистентности у экспериментальных животных, была определена концентрация инсулина в крови. У крыс с МС концентрация гормона более чем в 2 раза превышала значения показателя в контрольной группе, а индекс HOMA-IR составил 1,3 ± 0,4. У животных опытной группы оказался высоким и уровень гормона жировой ткани лептина, который превышал контрольные значения в среднем в 1,5 раза (табл. 1).

При анализе интенсивности процессов свободнорадикального окисления в висцеральной жировой ткани было установлено статистически значимое повышение продукции АФК у крыс с МС до 2,5 усл. ед., при уровне 1,2 усл. ед. в группе контроля (р = 0,008).

В результате биохимического анализа у животных экспериментальной группы было установлено повышение концентрации общего белка в крови в 1,3 раза, а также концентрации С-реактивного белка в среднем в 2,6 раза соответственно, по сравнению со значениями в группе контроля (табл. 1).

У животных опытной группы было зарегистрировано статистически значимое повышение общего числа лейкоцитов в крови. При анализе морфологического состава белой крови было обнаружено увеличение количественного содержания гранулоцитов — как относительного, так и абсолютного их числа (табл. 2).

Сывороточная концентрация IL10 и TNFα в крови у крыс с метаболическими нарушениями, индуцированными ВЖВУД, оказалась выше, чем у здоровых животных, в среднем в 3,7 и 4,2 раза соответственно (табл. 3). При этом повышение уровня IL6 в крови у животных опытной группы оказалось статистически недостоверным.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

К настоящему времени в экспериментальных медикобиологических исследованиях утверждены два основных методических подхода к моделированию МС на мелких грызунах: 1) использование специализированных линий животных, генетически предрасположенных к развитию сахарного диабета, ожирения и сердечно-сосудистых заболеваний; 2) использование различных диет с несбалансированным рационом белков, жиров и углеводов [4, 10]. Оба подхода основаны на индукции избыточного накопления в организме висцерального жира как одного из ключевых патогенетических факторов, опосредующего выраженные нарушения обмена веществ.

Несмотря на широкое использование диет с повышенным содержанием жиров и углеводов для моделирования МС у животных, некоторые исследователи отмечают определенные методические сложности, затрудняющие верификацию его основных проявлений. Например, трудной представляется оценка степени развивающегося висцерального ожирения, поскольку относительные показатели, применимые для человека, такие как индекс массы тела или относительная окружность талии, не позволяют оценить тип формируемого ожирения у экспериментальных животных. В ряде исследований было обнаружено, что эквиваленты МС, характерные для человека (артериальная гипертензия, дислипопротеинемия, гипергликемия), у животных можно воспроизвести лишь частично [11, 12]. В ряде случаев причинами являются недостаточная продолжительность экспериментального воздействия диетой, возрастные, гендерные, генетические особенности инбредных и аутбредных линий экспериментальных животных, погрешности составления пищевого рациона и режима питания и т. д.

Одними из критериев для верификации МС у лабораторных животных могут служить параметры, характеризующие метаболическую активность жировой ткани. В экспериментах было показано наличие корреляционных взаимосвязей отношения концентрации лептин/грелин с изменениями массы тела, селезенки и жировой ткани у крыс линии Wistar в модели гиперлипидемии, а также уровнями цитокинов, участвующих в регуляции воспаления (MCP-1, M-CSF, IL18 и RANTES), что указывает на информативность данных критериев как биомаркеров направленности и тяжести обменных нарушений при МС и ожирении [13].

Один из патогенетических факторов метаболического синдрома — хроническое воспаление жировой ткани, развивающееся на фоне инсулинорезистентности, сопряженной с гипергликемией и дислипопротеинемией [1, 2]. Высокоактивные вещества, вырабатываемые адипоцитами и клетками стромы (адипокины, провоспалительные цитокины), способствуют усилению макрофагальной инфильтрации жировой ткани и, таким образом, поддерживают локальное воспаление [14].

При анализе метаболической активности клеточных элементов висцерального жира крыс, находившихся на 12-недельной ВЖВУД, мы зарегистрировали усиление активности свободнорадикальных реакций — уровень спонтанной продукции АФК превышал соответствующие значения в группе контроля в 2 раза.

О высокой секреторной активности адипоцитов у крыс опытной группы можно судить и по уровню лептина в крови. В нашем исследовании концентрация гормона у животных экспериментальной группы превышала контрольные значения в среднем в 1,5 раза (табл. 1). При этом между сывороточными концентрациями лептина и инсулина была выявлена средняя прямая корреляционная зависимость (r = 0,701; р = 0,001).

Лептин преимущественно секретируют адипоциты белой жировой ткани, а его концентрация в крови коррелирует с объемом висцерального жира. В физиологических условиях лептин ингибирует секрецию инсулина поджелудочной железой [15]. Наиболее вероятно, что обнаруженная нами гиперлептинемия при МС носит компенсаторный характер на фоне инсулинорезистентности и повышении концентрации инсулина в крови. Известно также, что на фоне метаболических нарушений (гипергликемии и дислипопротеинемии) происходит снижение экспрессии лептиновых рецепторов на клетках и развивается их резистентность [16, 17].

Структурные особенности лептина позволяют отнести его к семейству провоспалительных адипокинов. Лептин принимает участие в регуляции хемотаксиса и активации нейтрофилов, в процессах дифференцировки Т-лимфоцитов и поддержании пула NK-клеток. На гуморальном уровне лептин стимулирует продукцию TNFα и IL6. Повышенная секреция лептина адипоцитами способствует накоплению макрофагов и облегчает их проникновение в жировую ткань посредством стимуляции ангиогенеза [18].

Известно, что метаболические условия активации клеточных элементов жировой ткани, такие как концентрация глюкозы, инсулина, жирных кислот, определяют ее цитокиновый профиль. Например, свободные жирные кислоты в высокой концентрации могут активировать рецепторы макрофагов TLR4 и опосредованно включать экспрессию генов, ответственных за наработку медиаторов воспаления [2, 14]. При этом в патогенезе воспаления жировой ткани формируется «порочный круг», так как системные эффекты некоторых провоспалительных цитокинов выражаются в активации синтеза жирных кислот и повышении их концентрации в крови за счет угнетения секреции адипонектина и регуляции продукции других цитокинов.

В нашем исследовании мы зарегистрировали статистически значимое повышение концентрации TNFα и IL10 в сыворотке крови у крыс опытной группы по сравнению с контрольной (табл. 3).

На ранних этапах воспаления баланс между защитноприспособительными и патологическими воспалительными реакциями обеспечивают противовоспалительные цитокины (IL10, IL13, TGFβ), которые ограничивают повреждение ткани, снижая экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости II класса, костимуляторных и других молекул на иммунокомпетентных клетках [19]. Вероятно, этим можно объяснить выявленное нами повышение уровня противовоспалительного IL10 в сыворотке крови у животных опытной группы на фоне метаболических нарушений. Косвенно подтверждает это выявленная средняя положительная корреляционная взаимосвязь между уровнем IL10 и концентрацией лептина (r = 0,523; р = 0,012).

Следует отметить, что при прогрессировании МС и ожирения наработка противовоспалительных цитокинов, а также гормонов, обладающих противовоспалительным эффектом (грелина, адипонектина) в жировой ткани может снижаться, что приводит к повышению инфильтрации жировой ткани мононуклеарами и усугубляет воспаление [20, 21]. Как правило, это воспаление низкой интенсивности, ввиду того, что факторы противовоспалительной резистентности способны длительное время сдерживать развитие генерализованного процесса и препятствовать развитию феномена вторичного повреждения при хронической системной альтерации. Поэтому, в отличие от острого, для хронического воспаления характерна меньшая выраженность изменений системных показателей.

В процессе исследования мы оценивали изменения параметров, характеризующих общие проявления воспаления, ассоциированного с висцеральной жировой тканью. Наряду с изменением концентрации цитокинов у животных с МС были выявлены повышение общего числа лейкоцитов, увеличение в гемограмме содержания гранулоцитов, повышение концентрации общего и С-реактивного белка в сыворотке крови по сравнению с соответствующими параметрами у интактных животных.

Многие воспалительные состояния сопровождает повышенная продукция белков острой фазы, в основном высвобождаемых гепатоцитами. Исследования показали, что при патологических состояниях адипоциты белой жировой ткани способны также генерировать высокий уровень С-реактивного белка, что усугубляет нарушение метаболизма глюкозы и резистентность к инсулину [22, 23].

Отдельные компоненты МС могут быть причиной реактивного лейкоцитоза. В экспериментах на животных показано, что диеты с высоким содержанием жиров приводят к миелоидной гиперплазии, особенно нейтрофильного клеточного паттерна [24]. В ряде исследований у людей с нарушением толерантности к глюкозе и ожирением была установлена положительная корреляционная взаимосвязь между антропометрическими и биохимическими показателями (индекс массы тела, артериальная гипертензия, гиперинсулинемия, дислипопротеинемия) и повышенным числом лейкоцитов в крови [25–27]. В механизмах развития лейкоцитоза обсуждается возможная роль лептина. Установлено, что лептин и его рецепторы являются частью сигнального пути, стимулирующего гемопоэз в красном костном мозге [25].

Схожими эффектами в отношении гемопоэтических клеток и зрелых лейкоцитов обладают конечные продукты гликирования, АФК и провоспалительные цитокины. Последние являются важными индукторами лейкоцитоза, особенно нейтрофилии, посредством множества механизмов, включая демаргинацию внутрисосудистых нейтрофилов, ускорение высвобождения нейтрофилов из костного мозга и усиление гранулоцитопоэза в костном мозге [28, 29].

ВЫВОДЫ

В результате проведенного эксперимента у крыс с МС наряду с висцеральным ожирением и нарушениями углеводного и липидного обменов (гиперинсулинемией, гипергликемией, дислипопротеинемией) зарегистрированы общие признаки воспаления: реактивный лейкоцитоз, гиперпротеинемия, повышение концентрации в крови С-реактивного белка и цитокинов (TNFα, IL10). Выявленные изменения происходили на фоне повышения метаболической активности висцеральной жировой ткани, о чем свидетельствовали гиперлептинемия и повышение интенсивности процессов свободнорадикального окисления. Была обнаружена положительная корреляционная взаимосвязь между уровнями лептина и инсулина в крови, а также между сывороточной концентрацией лептина и IL10. Таким образом, экспериментальное воздействие на крыс ВЖВУД продолжительностью 12 недель наряду с метаболическими нарушениями позволяет воспроизвести ранние признаки системного воспаления, характерные для МС и ожирения. Мы считаем, что диет-индуцированные модели МС могут быть удобным инструментом для исследования механизмов развития ранних и поздних осложнений МС, опосредованных влиянием патогенетических факторов хронического системного воспаления.