Распространение туберкулеза с лекарственной устойчивостью возбудителя является серьезной проблемой общественного здравоохранения. Особую озабоченность вызывает широкое распространение туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя (МЛУ-ТБ), т. е. устойчивого одновременно к двум наиболее эффективным противотуберкулезным препаратам рифампицину и изониазиду. Эффективность терапии МЛУ-ТБ, по данным ВОЗ, составляет лишь 59% [1]. Россия входит в число стран с высоким бременем МЛУ-ТБ и, несмотря на то, что распространенность МЛУ-ТБ в стране в последние годы начала снижаться (с 20,6 на 100 000 населения в 2020 г. до 18,1 на 100 000 населения в 2021 г.), этот показатель по-прежнему остается высоким [1, 2].

В схему терапии МЛУ-ТБ обязательно включают препараты фторхинолонового ряда (препараты группы А по классификации ВОЗ, отражающей приоритетность включения препаратов в схему терапии) [3]. Мишенью фторхинолонов служит фермент ДНК-гираза, который необходим для осуществления процессов репликации и транскрипции в клетке M. tuberculosis (МБТ) [4, 5]. Устойчивость к фторхинолонам в 60–90% случаев связана с мутациями в области QRDR (quinolone resistance-determining region) гена gyrA, кодирующего α-субъединицу ДНК-гиразы [6, 7]. В базе данных TBDreamDB (http://www.tbdreamdb.com) описано 17 вариантов мутаций в QRDR, ассоциированных с устойчивостью к фторхинолонам, из которых 10 вариантов высокодостоверны для формирования устойчивости к этой группе препаратов [8].

Развитие дополнительной устойчивости к фторхинолонам у МБТ с МЛУ приводит к развитию туберкулеза с предширокой лекарственной устойчивостью возбудителя (преШЛУ-ТБ), для лечения которого требуется длительный и дорогостоящий курс химиотерапии. По оценкам ВОЗ, в 105 странах до 20% случаев туберкулеза относится к этой категории. Для повышения эффективности лечения преШЛУ-ТБ необходима как можно более ранняя коррекция курса химиотерапии, основанная на определении чувствительности к фторхинолонам молекулярно-генетическими методами. Однако, по данным ВОЗ, глобальный охват тестированием на чувствительность к фторхинолонам остается низким и составляет около 50% от числа выявленных случаев туберкулеза в мире [1]. В России для ускоренного определения чувствительности МБТ к фторхинолонам используют две отечественные тест-системы. Одна из них — ТБ-БИОЧИП-2 (ИМББиочип; Россия) представляет собой биочипы, которые выявляют 10 вариантов точечных мутаций в QRDR, вторая — «Амплитуб-FQ-РВ» (Синтол; Россия), основана на аллель-специфичной ПЦР и выявляет шесть мутаций в QRDR gyrA.

Целью исследования было оценить разнообразие мутаций в гене gyrA, а также установить ассоциацию мутаций в gyrA с фенотипической устойчивостью к левофлоксацину и с общим профилем лекарственной устойчивости возбудителя.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования

Исследовали диагностический материал от пациентов всех возрастных групп, поступивших в диагностическое и клиническое отделения ФГБНУ «ЦНИИТ» с 2011 по 2019 гг.

Дизайн исследования

Проведен ретроспективный анализ данных по изучению мутаций в QRDR gyrA и фенотипической лекарственной устойчивости МБТ, выделенных за 9-летний период (2011–2019 гг.) от больных туберкулезом легких, проходивших лечение в ФГБНУ «ЦНИИТ». Диагностический материал исследовали по стандартному алгоритму, принятому в отделе микробиологии ФГБНУ «ЦНИИТ»: каждый образец диагностического материала параллельно исследовали культуральными и молекулярно-генетическими методами. Диагностический материал подвергали стандартной деконтаминирующей обработке и проводили посев в пробирки MGIT для культивирования в системе BACTEC MGIT 960 [9]. Из оставшейся после посева порции диагностического материала выделяли ДНК и проводили ПЦР-исследование на наличие ДНК МБТ. При получении положительного результата ПЦР определяли мутации в генах, ассоциированных с устойчивостью к рифампицину, изониазиду и фторхинолонам, на биочипах или аллельспецифической ПЦР. При получении культуры МБТ определяли лекарственную чувствительность к восьми противотуберкулезным препаратам.

Выделение ДНК

ДНК выделяли из диагностического материала набором реагентов «Амплитуб-РВ» для выделения, обнаружения и количественного определения ДНК микобактерий туберкулезного комплекса методом ПЦР в реальном времени, комплект № 1 («Синтол»; Россия), согласно инструкции к набору.

Выявление ДНК МБТ

ПЦР на выявление ДНК МБТ проводили с использованием набора реагентов «Амплитуб-РВ» для выделения, обнаружения и количественного определения ДНК микобактерий туберкулезного комплекса методом ПЦР в реальном времени, комплект № 2 («Синтол»; Россия), согласно инструкции к набору. Амплификацию проводили в термоциклере с оптическим модулем CFX96 (Bio-Rad; США).

Генотипическая устойчивость к рифампицину и изониазиду

Определение проводили или с использованием микрочиповой технологии с набором «ТБ-БИОЧИП-1» («БИОЧИП-ИМБ»; Россия), или с использованием набора «Амплитуб-МЛУ-РВ» («Синтол»; Россия). Обе процедуры осуществляли согласно инструкциям производителей.

Генотипическая устойчивость к фторхинолонам

Определение проводили с использованием микрочиповой технологии с набором «ТБ-БИОЧИП-2» («БИОЧИП-ИМ»; Россия) — для образцов, полученных в период 2011–2015 гг., или с использованием набора «Амплитуб-FQ-РВ» («Синтол»; Россия) — для образцов, полученных в период 2015–2019 гг. Обе процедуры осуществляли согласно инструкциям производителей. Если от одного и того же пациента были получены анализы на разные сроки терапии или были исследованы разные виды диагностического материала от одного больного (например, мокрота и хирургический материал), результат определения мутаций в gyrA, полученный для каждого из таких образцов, сравнивали между собой.

Культуральная диагностика

Выявление МБТ проводили на жидкой среде Middlebrook 7H9 в системе BACTEC MGIT 960 (BD; США) согласно стандартному протоколу производителя [9].

Фенотипическая лекарственная чувствительность

Определение проводили модифицированным методом пропорций в системе BACTEC MGIT 960 (BD; США) к восьми противотуберкулезным препаратам (рифампицину, изониазиду, этамбутолу, пиразинамиду, этионамиду, амикацину, капреомицину и левофлоксацину) согласно рекомендациям производителя [9, 10].

Методы статистического анализа

При оценке результатов исследования использовали описательную статистику: учитывали число наблюдений, частоту, долю (в процентах), 95%-й доверительный интервал (95%ДИ). Для сравнения различий между группами использовали χ²-критерий. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05. Весь анализ проводили с помощью программы Microsoft Excel (Microsoft; США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Всего за период 2011–2019 гг. была проведена микробиологическая диагностика туберкулеза для 4451 больного. В исследование был включен материал от 2836 пациентов с положительными результатами ПЦР на наличие ДНК МБТ. Из них в 2082 случаях (73,41%, 95% ДИ: 71,76–75,01%) мутации в gyrA применяемыми молекулярно-генетическими методами выявлены не были (далее gyrA дикого типа).

От 699 пациентов (24,65%, 95% ДИ: 23,10–26,27%) были выделены МБТ с единичными мутациями в gyrA. У МБТ, выделенных от 55 (2,31%, 95% ДИ: 1,78–3,00%) больных, результаты определения генотипической устойчивости к фторхинолонам различались в динамике или в зависимости от вида диагностического материала. Эти случаи были обозначены нами как «гетерорезистентность» и подробно будут описаны ниже.

Частота встречаемости единичных мутаций в QRDR gyrA

Выявленные в QRDR gyrA единичные мутации локализовались в кодонах 88, 90, 91 или 94 (табл. 1). Наиболее часто мутации обнаруживали в 94-ом кодоне гена (496/699, 70,96%; 95% ДИ: 67,49–74,20%) и были представлены пятью вариантами однонуклеотидных полиморфизмов, среди которых наиболее часто встречалась замена D94G (291/496, 58,67%; 95% ДИ: 54,29–62,92% среди мутаций в кодоне 94 и 291/699, 41,63%; 95% ДИ: 38,03–45,32% среди МБТ с единичными мутациями в гене gyrA). Второй по частоте встречаемости была замена A90V (149/699, 21,32%; 95% ДИ: 18,44–24,50%). Суммарно МБТ с мутациями D94G и A90V составляли более половины случаев от числа всех МБТ с единичными мутациями в gyrA — 440/699 (62,95%; 95% ДИ: 59,31–66,45%).

Фенотипическая чувствительность к левофлоксацину

Фенотипическая чувствительность к левофлоксацину была определена для МБТ, выделенных культуральным методом из диагностического материала 1326 пациентов. Определение мутаций в gyrA этих изолятов МБТ показало, что в 846 случаях были выявлены МБТ с gyrA дикого типа, в 480 случаях — с единичными мутациями в gyrA. МБТ с gyrA дикого типа преимущественно были чувствительны к левофлоксацину (814/846, 96,22%, 95% ДИ: 94,71–97,31%), а МБТ с мутациями, как правило, были устойчивы к левофлоксацину (448/480, 93,33%, 95% ДИ: 90,74–95,24%) (табл. 2).

Полиморфизм мутантных по gyrA вариантов МБТ, выделенных от впервые выявленных и ранее леченых больных туберкулезом

Из 2836 больных туберкулезом легких, диагностический материал от которых был включен в исследование, 1253 пациента относились к категории впервые выявленных больных, 767 — к категории ранее леченых, а для 816 пациентов информации о статусе не было.

МБТ с диким типом gyrA чаще были выделены от впервые выявленных больных, чем от ранее леченых: из 1475 изолятов МБТ с gyrA дикого типа, выделенных от больных с известным статусом, 1012 (68,61%) были от впервые выявленных больных туберкулезом, а 463 (31,39%) — от ранее леченых пациентов (p-value ≤ 0,001). Мутантный вариант gyrA A90V достоверно чаще встречался в группе МБТ, выделенных от впервые выявленных больных; для остальных мутантных вариантов значимых различий выявлено не было (табл. 3).

Мутации в гене gyrA у МБТ с разным характером резистентности 

По характеру резистентности изоляты МБТ с известной генотипической чувствительностью к фторхинолонам (в анализ не вошли случаи гетерорезистентности) были разделены на пять категорий: первая — МБТ с МЛУ, вторая — полирезистентные МБТ (устойчивые к любым сочетаниям противотуберкулезных препаратов, кроме одновременной к изониазиду и рифампицину), третья — монорезистентные к фторхинолонам, четвертая — монорезистентные к другим противотуберкулезным препаратам, кроме фторхинолонов, и пятая — чувствительные ко всем противотуберкулезным препаратам (табл. 4). МБТ с мутациями в gyrA, как правило, были с МЛУ или полирезистентными (суммарно 689/694, 99,28%, 95% ДИ: 98,32–99,69%). Моноустойчивость к фторхинолонам встречалась очень редко (5/694, 0,72%, 95% ДИ: 0,31–1,68); в четырех случаях такие МБТ имели мутацию в gyrA D94A и в одном случае — D94G. МБТ с gyrA дикого типа приблизительно в равных долях входили в категорию МБТ с МЛУ и в категорию МБТ, чувствительных ко всем противотуберкулезным препаратам.

Гетерорезистентность и множественные мутации

Описанные выше изоляты МБТ имели одинаковую структуру QRDR gyrA (дикий тип или единичная мутация) во всех образцах, полученных от одного и того же пациента в динамике. Однако у 55 пациентов данные по структуре QRDR gyrA при проведении динамического наблюдения различались (табл. 5).

Так, от 35 больных при исследовании диагностического материала в процессе химиотерапии выделены МБТ с различной структурой QRDR gyrA. Из них в 22 случаях в разных образцах, выделенных от больного, были выявлены МБТ как с gyrA дикого типа, так и с мутациями. У МБТ, выделенных от 15 пациентов, был обнаружен gyrA дикого типа и с единичными мутациями, преимущественно D94G (табл. 5, п.1.1.1). От семи больных были выделены МБТ с gyrA дикого типа и с множественными мутациями (табл. 5, п.1.1.2). В трех из этих семи случаев было доказано сосуществование двух разных пулов МБТ с единичными мутациями, а не одного пула со сдвоенной мутацией в gyrA, так как в динамике выделялись образцы и с единичной мутацией. В четырех из семи случаев наличие двух пулов с единичными мутациями или одного со сдвоенной мутацией в gyrA доказано не было.

От 13 больных на разные сроки были получены образцы, из которых выделялись МБТ с разными единичными мутациями (восемь из 13) или чередовались образцы со сдвоенными мутациями и с единичной мутацией (пять из 13), что могло свидетельствовать о нахождении в организме нескольких пулов МБТ, мутантных по gyrA (табл. 5, п. 1.2).

В пяти случаях гетерорезистентность была выявлена при проверке случаев несовпадения результатов фенотипической и генотипической устойчивости: в диагностическом образце выявляли ДНК МБТ с мутациями в gyrA, а полученная из образца культура МБТ была фенотипически чувствительной к левофлоксацину, и наоборот. В этом случае повторно многократно (до восьми раз) определяли мутации в gyrA в имеющихся образцах ДНК, а также заново выделяли ДНК из диагностического образца и проводили анализ на наличие мутаций в gyrA. Для каждого из этих пяти случаев в серии определения мутаций в gyrA были получены результаты, как совпадающие с полученным изначально, так и отличающиеся от него, что могло служить доказательством наличия в одном диагностическом образце смешанной популяции МБТ (табл. 5, п. 2).

Еще в 15 случаях в одном образце (для исследования был доступен единственный образец от каждого больного) нами были зафиксированы двойные мутации (табл. 5, п. 3). Как правило, это была одна из двух наиболее часто встречающихся мутаций (D94G или A90V) в комбинации с одной из редких мутаций (девять из 15 случаев), или, в пяти из 15 случаев, одновременно обнаруживали две редкие мутации, причем только сочетание S91P + D94A. МБТ с двумя наиболее распространенными мутациями (D94G или A90V) были выделены только от одного больного. Во всех 15 случаях при повторных постановках ПЦР с ДНК, выделенной из диагностического образца, наличие двух мутаций повторялось. Это свидетельствовало о том, что от одного больного или выделялся один пул МБТ, в геноме которых была сдвоенная мутация в gyrA, или в равном соотношении выделялось два пула МБТ, каждый со своей единичной мутацией в gyrA. Так как диагностический материал от пациентов в этих случаях был получен однократно, динамические наблюдения, позволяющие уточнить полученные данные, проведены не были.

Таким образом, нами было показано, что в организме одного пациента могло быть от двух до четырех пулов МБТ с разной структурой QRDR gyrA. Чаще всего смешанные популяции были представлены двумя пулами МБТ (46/55, 83,64%, если включать в анализ 15 случаев со сдвоенными мутациями с недоказанной принадлежностью к двум разным пулам). Из них в 19 случаях популяция состояла из пула МБТ с gyrA дикого типа и пула МБТ с единичными мутациями в gyrA. В остальных случаях (27, если включать 15 случаев со сдвоенными мутациями, для которых не получены данные в динамике) популяция МБТ была представлена двумя пулами МБТ с разными мутациями в gyrA.

В семи случаях популяция МБТ в одном пациенте была представлена тремя пулами с разной структурой gyrA. В шести случаях один из пулов МБТ был с gyrA дикого типа и два — с различающимися мутациями в gyrA, а в одном случае — все три пула МБТ имели различающиеся мутации в gyrA. Сосуществование в пациенте трех пулов МБТ с разной структурой gyrA в пяти из семи случаев было доказано наблюдениями в динамике.  

У двух пациентов можно было предположить наличие четырех пулов МБТ с разной структурой QRDR gyrA, когда из двух образцов диагностического материала были выделены в одном случае чувствительные МБТ, в другом случае выявлены три мутации в gyrА. Так как сложно предположить, что в результате независимых последовательных процессов спонтанного мутагенеза возникнет сразу три мутации в одном участке гена, логично предположить существование трех независимых пулов МБТ с разными мутациями.

Как правило, смешанные популяции МБТ выделяли от ранее леченых больных (40/55, 72,73%, 95% ДИ: 59,77– 82,72), в основном это были МБТ с МЛУ (45/55, 81,82%, 95% ДИ: 69,67–89,81). Но в 2/55 случаях смешанные популяции МБТ были выделены от впервые выявленных больных и характеризовались монорезистентностью к левофлоксацину.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Для изучения разнообразия мутаций в QRDR гена gyrA МБТ было проведено ретроспективное исследование, охватывающее значительное число случаев туберкулеза за период 2011–2019 гг.

Из восьми выявленных мутантных вариантов семь относились к высоко достоверным для формирования устойчивости к фторхинолонам [8]. Преобладающими были мутации D94G и A90V, что характерно для мировой популяции в целом [6, 7]. Установленная нами частота встречаемости этих мутаций (40,42% для D94G и 21,26% для A90V) была несколько выше, чем в общемировой популяции (21–32% и 13–20% соответственно) [6].

В представленном исследовании показано, что наличие мутаций в QRDR gyrА в большинстве случаев было ассоциировано с фенотипической устойчивостью к фторхинолонам, однако в единичных случаях при выявлении мутаций в gyrА МБТ устойчивость к фторхинолонам культуральным методом не установлена, что при проведении дополнительных исследований было объяснено гетерорезистентностью популяции МБТ. Известно, что, если при определении фенотипической и генотипической чувствительности к фторхинолонам доля одного из штаммов в смеси составляет менее 5%, его генотип и фенотип не определяется и результат исследования отражает характеристику доминирующего в смеси штамма [11]. Это важно учитывать при интерпретации несовпадения результатов определения чувствительности к фторхинолонам культуральным и молекулярно-генетическими методами, так как нельзя исключить или изначально низкое содержание в смеси клеток МБТ одного из генотипов, или вероятность неравномерного распределения клеток МБТ с разным генотипом между пробами, взятыми для молекулярногенетических и культуральных исследований.

При выявлении мутации в gyrA D94A в 24-х из 73-х случаев (32,88%) МБТ были фенотипически чувствительны к левофлоксацину. Такой высокий процент сложно объяснить невыявленной гетерорезистентностью и ошибками культурального или генотипического тестирования. Кроме того, в других исследованиях тоже были описаны случаи, когда генотип gyrA_D94A соответствовал чувствительному фенотипу: в зависимости от исследованной популяции, фенотипическая чувствительность к фторхинолонам была отмечена у одного из семи и у четырех из 12 штаммов МБТ с этой мутацией [12, 13]. Следовательно, можно заключить, что мутация D94A, несмотря на то, что относится к высокодостоверным для формирования резистентности, не строго ассоциирована с устойчивостью к фторхинолонам.

Существует мнение, что широкое применение препаратов фторхинолонового ряда для терапии инфекций нетуберкулезной этиологии может приводить к возникновению устойчивости к фторхинолонам у больных с невыявленным туберкулезом [14]. В этом аспекте важно было оценить характер резистентности МБТ, устойчивых к фторхинолонам: ассоциация этого параметра с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя может служить индикатором того, что устойчивость к фторхинолонам развивается при терапии МЛУ-ТБ, а выявление случаев моноустойчивости к фторхинолонам, особенно у впервые выявленных больных, — индикатором формирования устойчивости МБТ к фторхинолонам при терапии других инфекционных заболеваний. Нами было показано, что генотипическая устойчивость МБТ к фторхинолонам в подавляющем большинстве случаев была ассоциирована с МЛУ: 649 из 694 (93,52%) изолятов с единичными мутациями в gyrA и 45 из 55 (81,00%) случаев смешанных популяций относились к категории МЛУ.

Полученные результаты доказывают, что формирование устойчивости к фторхинолонам у МБТ происходит в рамках терапии МЛУ-ТБ. Однако мы не можем исключить развитие устойчивости к фторхинолонам на фоне лечения нетуберкулезных заболеваний, так как МБТ с монорезистентностью к фторхинолонам тоже были выявлены. К сожалению, у нас отсутствуют данные, подтверждающие, что эти больные ранее получали терапию препаратами фторхинолонового ряда.

Изучение структуры геномов МБТ, циркулирующих в Самарской области, проведенное с использованием полногеномного секвенирования, позволило авторам заключить, что устойчивость к фторхинолонам МБТ скорее приобретают в процессе терапии, а случаи заражения человека устойчивыми к фторхинолонам клонами МБТ — редки. На основании этого наблюдения было сделано предположение, что развитие устойчивости к фторхинолонам приводит к снижению фитнеса МБТ [13]. В популяционном исследовании распространения первичной устойчивости МБТ к фторхинолонам на территории Новосибирской области также было показано, что формирование устойчивости к фторхинолонам происходит в большей степени в результате использования препаратов этой группы в химиотерапии МЛУ-ТБ [15].

Представленные здесь данные подтверждают также, что резистентность к фторхинолонам чаще возникает в процессе терапии: МБТ с мутациями в gyrA чаще выделяли от ранее леченых больных туберкулезом, чем от впервые выявленных. Однако нами было установлено, что и от впервые выявленных больных туберкулезом могут быть выделены устойчивые к фторхинолонам МБТ. В этом случае преобладающими мутациями в gyrA были D94G и A90V, причем частота встречаемости мутации A90V у МБТ, выделенных от впервые выявленных больных, была достоверно выше, чем среди ранее леченых, из чего можно заключить, что МБТ с этой мутацией достаточно активно передаются от человека к человеку.

Показанная нами возможность существования в одном пациенте нескольких популяций МБТ, различающихся мутациям в gyrA, указывает на процесс формирования в популяции устойчивости к фторхинолонам. В ряде исследований также было показано, что в одном диагностическом образце может присутствовать несколько клонов МБТ, различающихся структурой gyrA; частота встречаемости таких образцов составляла 1—3% от общего числа, что согласуется с полученными нами результатами [16–18].

Таким образом, нами было показано, что в популяции МБТ, циркулирующих в РФ, в настоящий момент формируется устойчивость к фторхинолонам, как правило, на фоне уже существующей МЛУ. Развитие устойчивости МБТ к фторхинолонам имеет хорошие эволюционные перспективы, так как формируется на благоприятном генетическом фоне в рамках терапии туберкулеза с МЛУ возбудителя, которая обусловлена комбинацией мутаций, не снижающих фитнес МБТ [19]. Тот факт, что МБТ с мутациями в gyrA D94G и A90V с достаточно высокой частотой встречались и у впервые выявленных больных туберкулезом, позволяет заключить, что именно эти мутанты будут играть основную роль в распространении преШЛУ-туберкулеза на территории РФ.

ВЫВОДЫ

Ретроспективный анализ спектра мутаций в QRDR gyrA МБТ, выделенных в 2011–2019 гг. годах показал, что генотипическая устойчивость к фторхинолонам была выявлена у 26,96% клинических изолятов МБТ, включая случаи гетерорезистентности. Преобладали мутации D94G и A90V, частота встречаемости которых суммарно составила 62,95% от числа МБТ с единичной мутацией в гене gyrA. Было также показано, что эти две мутации с достаточно высокой частотой встречались у МБТ, выделенных от впервые выявленных больных (D94G — у 46,03% и A90V — у 25,10% МБТ этой группы), что подтверждает успешное распространение этих мутантных вариантов МБТ в современной популяции. Наличие мутаций в gyrA, как правило, было ассоциировано с фенотипической устойчивостью к левофлоксацину, кроме мутации D94A, которая сопровождалась фенотипической устойчивостью к левофлоксацину только в 67% случаев. Мутации в gyrA встречались в основном у МБТ с МЛУ — 93,52% штаммов с мутацией в gyrA также были устойчивы к рифампицину и изониазиду. Полученный результат доказывает, что устойчивость к фторхинолонам возникает в процессе лечения МЛУ-ТБ. Кроме того, в 2,31% случаев были выявлены гетерорезистентные популяции МБТ, в состав которых входило два–четыре пула МБТ с разной структурой QRDR gyrA. Наличие гетерорезистентности к фторхинолонам свидетельствует об активном формировании устойчивости к этой группе препаратов в современных условиях.