Рак молочной железы является наиболее часто диагностируемым злокачественным заболеванием и ведущей причиной смерти от рака среди женщин во всем мире [1]. При раке молочной железы микроокружение опухоли играет решающую роль в ее прогрессировании и влияет на рост новообразования, васкуляризацию, метастазирование и реакцию на терапию [2–4]. Опухолеассоциированные макрофаги (ОАМ) представляют собой основной компонент иммунной системы в ткани при раке молочной железы, и их роль в его прогрессировании была продемонстрирована на животных моделях [5]. У пациентов с раком молочной железы как количество, так и выявление М2-фенотипа  макрофагов являются индикатором плохого прогноза в большинстве исследований, которые не учитывают внутриопухолевую гетерогенность [2, 5, 6]. Наши предыдущие исследования показали, что в определенных внутриопухолевых компартментах макрофаги могут сохранять противоопухолевые свойства, так как была обнаружена отрицательная корреляция ОАМ в ткани молочной железы с локальными метастазами [6]. Макрофаги контролируют рост и метастазирование опухоли за счет секреции цитокинов, компонентов внеклеточного матрикса и факторов роста, а профиль секретируемых компонентов обусловлен программированием не только на транскрипционном уровне, но и на уровне эпигенетики и метаболизма [2, 9–11].

Первичную опухоль достаточно просто удалить хирургическим путем, не подвергая ее никаким дополнительным воздействиям, поскольку они не уничтожат микрометастазы. Опухолеассоциированные макрофаги метаболизируют химиотерапевтические агенты и в ответ на химиотерапию значительно усиливают секрецию ростовых и проангиогенных факторов, стимулирующих процессы роста опухоли и дальнейшего метастазирования [12]. Эпигенетическая программа макрофагов является связующим звеном между генетическим кодом и взаимодействием со стрессовыми, эндогенными патологическими факторами и инфекционными агентами. При патологическом программировании макрофагов микрометастазы, состоящие даже из единичных клеток, способны развиться в убийственную и не поддающуюся ни химиотерапии, ни иммунотерапии вторичную опухоль. Новые подходы к лечению рака молочной железы направлены на редактирование эпигенома опухолеассоциированных макрофагов и основаны на передовой технологии CRISPR/dCas для адресной доставки редакторов эпигенома к промоторам таргетных генов. Авторами данной статьи была разработана модельная система макрофагов человека ex vivo, продемонстрировано долгосрочное программирование макрофагов человека с использованием новой системы высвобождения цитокинов на основе биоматериалов [13].

Для исследования изменений в клетках иммунной системы при репрограммировании необходимы точные методы анализа метаболома, в частности липидов — основной энергетической составляющей и строительного материала мембран, а также мономерных единиц белков — аминокислот. Создание методики анализа метаболома в модельных ОАМ и в моноцитах пациентов с опухолями различной локализации позволит исследовать особенности молекулярного состава моноцитов пациентов с опухолями различной локализации и будет способствовать разработке технологии для их клинического применения. Эти данные представляют интерес для решения как фундаментальных, так и для прикладных вопросов биологии и медицины, в частности, в исследованиях, посвященных уточнению механизмов патогенеза злокачественных новообразований. Наиболее эффективным подходом к определению молекулярного состава биологических образцов в настоящее время является комбинация жидкостной хроматографии с массспектрометрической детекцией (ВЭЖХ-МС/МС) [14]. Ключевой проблемой существующих подходов является отсутствие консенсуса о минимальном количестве клеток для анализа, что особенно актуально для моноцитов и ОАМ пациентов с онкологическими заболеваниями. Получение моноцитов и ОАМ сложная процедура, требующая большого количества цельной крови, длительной последующей обработки и культивирования при низком пролиферативном потенциале данных иммунных клеток.

Целью работы было определить минимальное число иммунных клеток человека (ОАМ и моноцитов) методом ВЭЖХ-МС/МС, необходимое для анализа метаболомного профиля данных клеток при онкологических заболеваниях.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Для определения оптимального числа клеток, позволяющего получить результаты при исследовании метаболомного спектра, использовали образцы, полученные от здоровых добровольцев. Критериями включения здоровых добровольцев были: отсутствие онкологических заболеваний в анамнезе; отсутствие хронических заболеваний в фазе обострения. При исследовании группы больных были получены образцы четырех пациентов с раком молочной железы (РМЖ) T1-4N0-3M0 (IIA–IIIB стадии), люминального В-подтипа, проходивших лечение в клинике НИИ онкологии Томского НИМЦ в 2021 г. Критериями отбора пациенток были следующие параметры: возраст от 45 до 55 лет; отсутствие онкологического поражения другой локализации в анамнезе; отсутствие наследственной предрасположенности к РМЖ (на основании данных семейного анамнеза и результатов генетического тестирования на наличие мутаций 5382insC, 4153delA, 185delAG  в гене BRCA1); состояние менструальной функции — перименопауза либо менопауза; морфологическая верификация диагноза — неспецифическая инвазивная карцинома (согласно классификации ВОЗ 2019 г.); экспрессия рецепторов к эстрогену (ER) — не менее 5 баллов; уровень Ki-67 — не менее 40%; отсутствие гематогенных метастазов. Критерии исключения: возраст моложе 45 либо старше 55 лет; наличие онкологического заболевания в анамнезе; наследственная предрасположенность; состояние менструальной функции — пременопауза; все гистологические подтипы, за исключением неспецифической инвазивной карциномы; экспрессия ER — менее 5 баллов; уровень Ki-67 — меньше 40%; наличие гематогенных метастазов. Перед лечением было проведено иммуногистохимическое исследование для определения молекулярного подтипа опухоли в соответствии с рекомендациями Американского общества клинической онкологии/Колледжа американских патологов. Для стадирования РМЖ использовали TNM-классификацию AJCC (8-е издание, 2017 г.).

В качестве исследуемого материала использовали модельную систему ОАМ [13], моноциты крови здоровых добровольцев и пациентов с РМЖ, взятые до лечения.

Моноциты были изолированы из цельной крови пациентов либо из лейкоцитарной пленки доноров. Фракцию CD14⁺-клеток получали с помощью позитивной магнитной сепарации с применением протокола Miltenyi Biotec. Для получения модельных дифференцированных M2-макрофагов моноциты здоровых добровольцев культивировали при концентрации 10⁶ клеток на 1 мл макрофагальной среды X-VIVO (Lonza; Германия) с добавлением 1 нг/мл M-CSF (Peprotech; Германия) и 10^–8 M дексаметазона (Sigma-Aldrich; Германия). Для индукции дифференцировки макрофагов в проопухолевые М2-макрофаги использовали 10 нг/мл IL4 (Peprotech; Германия). Для получения модельных ОАМ к полученным макрофагам добавляли кондиционированные среды, полученные от клеток линии карциномы молочной железы MCF7 в объеме 10% от общего количества среды. Макрофаги дифференцировались в течение 6 дней при 7,5% CO₂. По истечении 6 суток макрофаги снимали с культуральных планшетов с помощью резинового скребка на холоде. 

Полученные моноциты и макрофаги отмывали трижды в растворе холодного 0,3%-ного ацетата аммония и 0,3%-ного формиата аммония при помощи центрифугирования в режиме 311g в течение 5 мин. После центрифугирования надосадок полностью удаляли, а осадок высушивали в жидком азоте при температуре –197 °С. Образцы хранили при –80 °С до последующего анализа.

Приготовление образцов для ВЭЖХ-МС/МС анализа

Определение метаболома (липидома и аминокислотного состава) ОАМ и моноцитов пациентов с раком молочной железы проводили посредством ВЭЖХ-МС/ МС-анализа экстрактов клеток. Экстракцию липидов проводили модифицированным методом Фолча [15–17] с двойной экстракцией: к образцу клеток добавляли 480 мкл хлороформ-метанольной смеси (2 : 1, о/о) c 20 мкл IS (внутренний стандарт) при 4 °C и подвергали ультразвуковому воздействию в течение 10 мин; добавляли 150 мкл воды и центрифугировали при 13 000 g в течение 5 мин при комнатной температуре; нижний органический слой, содержащий липиды, отбирали и повторяли процедуру экстракции (добавив 250 мкл хлороформ-метанольной смеси (2 : 1, о/о, 10 мин на вортексе; центрифугирование при 13 000 g в течение 5 мин); в отдельные пробирки отбирали воднометанольный слой и органический слой соединяли с образцом, полученным на первом этапе, высушивали в потоке азота. Высушенные экстракты липидов (органический слой) перерастворяли в 100 мкл раствора изопропанола с ацетонитрилом (1 : 1, о/о), а экстракты водорастворимых соединений (водно-метанольная фаза) были использованы для анализа профиля аминокислот: их перерастворяли в 100 мкл раствора воды с ацетонитрилом (1 : 1, о/о) и с 1% муравьиной кислоты.

ВЭЖХ-МС/МС анализ

Липидные экстракты анализировали на жидкостном хроматографе Dionex UltiMate 3000 (Thermo Scientific; Германия), соединенном с масс-анализатором Maxis Impact qTOF с ЭРИ источником ионов (Bruker Daltonics; Германия). Разделение липидов по методу HILIC выполняли в соответствии с модифицированной процедурой, описанной ранее [18, 19]: 3 мкл образца инжектировали в систему. Разделение проводили на колонке Spherisorb Si (150 × 2,1 мм, 5 мкм; Waters, США) при скорости потока 50 мкл/мин с использованием ацетонитрила в качестве растворителя А и водного раствора ацетата аммония (5 ммоль/л) в качестве растворителя В линейным градиентом от 6 до 23% (о/о) растворителя В в течение 25 мин. Температура колонки составляла 40 °C. Разделение липидов методом обращенно-фазовой хроматографии осуществляли на колонке Zorbax C18 (150 × 2,1 мм, 5 мкм; Agilent, США) с линейным градиентом от 30 до 90% элюента В (раствор ацетонитрил/изопропанол/ вода, 90/8/2 об., с добавлением 0,1% муравьиной кислоты и 10 ммоль/л формиата аммония) за 20 мин. В качестве элюента А использовали раствор ацетонитрил/вода (60/40 об.) с добавлением 0,1% муравьиной кислоты и 10 ммоль/л формиата аммония. Скорость потока элюирования составила 40 мкл/мин, объем инжектируемого образца — 3 мкл. Масс-спектры получали в режиме положительных и отрицательных ионов в диапазоне 100–1700 m/z со следующими установками: напряжение на капилляре — 4,1 кВ, давление распыляющего газа — 0,7 бар, скорость потока осушающего газа — 6 л/мин, температура осушающего газа — 200 °C. Для идентификации липидов выполняли тандемную масс-спектрометрию в режиме зависимого сканирования с шириной окна 5 Да.

Для количественного анализа 38 аминокислот в клетках использовали набор Amino Acids LC-MS/MS Analysis Kit (Jasem; Турция) (1-метил-L-гистидин, 3-аминоизобутановая кислота, 3-метил-L-гистидин, β-аланин, DL-5-гидроксилизин, DL-гомоцистин, этаноламин, γ-аминобутановая кислота, L-2-аминоадипиновая кислота, L-2-аминобутановая кислота, L-аланин, L-ансерин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота, L-карнозин, L-цитруллин, L-цистатионин, L-цистин, L-глутаминовая кислота, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, L-гомоцитруллин, L-лизин, L-норвалин, L-орнитин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин, L-валин, саркозин, таурин, транс-4-гидрокси-L-пролин). К 40 мкл водного экстракта клеток добавляли 50 мкл раствора внутреннего стандарта и 300 мкл Reagent № 1 (Jasem; Турция). Полученную смесь тщательно встряхивали в течение 2 мин, затем центрифугировали при скорости вращения 13 000 g в течение 10 мин; 200 мкл супернатанта отбирали в виалу со вставкой, 15 мкл вводили в хроматографическую систему ВЭЖХ-МС/МС, состоящую из тройного квадрупольного масс-спектрометрического детектора Agilent 6460 (Agilent; США), и жидкостного хроматографа Agilent 1260 II (Agilent; США) с колонкой Amino acids-HPLC Column (Jasem; Турция). Условия хроматографического разделения: температура — 30 °С, элюент А: 0,1 об.% муравьиной кислоты в воде; элюент В: ацетонитрил 100%, градиентный режим элюирования с 78% В до 20% В за 4,5 мин; возвращение к 78% В и изократический режим. Для анализа аминокислот использовался Amino Acids LC-MS/MS Analysis Kit (Jasem; Турция). Параметры ионного источника ESI, положительная мода, температура осушающего газа — 150 °C, напряжение на капилляре — 2 кВ. Масс-спектрометрическое детектирование проводили в режиме мониторинга множественных реакций (MRM).

Идентификация липидов и анализ хромато-массспектрометрических данных

Для предобработки хромато-масс-спектрометрических данных использовали программы msConvert из пакета Proteowizard 3.0.9987 для преобразования файлов в формат MzXml, содержащий информацию о масс-спектре в любой момент времени, и формат ms2, содержащий информацию о тандемных масс-спектрах. Кроме того, использовали программу MzMine для выделения пиков и создания таблицы, содержащей информацию о зарегистрированных ионах: массе иона, площади его хроматографического пика и времени выхода. Для идентификации липидов использовали программу LipidMatch [20], в которой учитывали точную массу (0,01 Да) соответствующего иона, массу ионов-фрагментов из тандемных масс-спектров идентифицируемого иона, попадающих в заданное окно массы (3 Да) и заданную окрестность времени удерживания (0,5 мин). Для полуколичественного анализа липидов использовали ранее разработанные скрипты на языке R [11–23].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для разработки оптимальной методики анализа липидома иммунных клеток человека посредством ЖХ/МСанализа экстрактов липидов было проведено сравнение нескольких методов экстракции, хроматографического разделения (обращенно-фазовая хроматография и HILIC), а также определено минимальное необходимое количество клеток. Предварительно сравнивали эффективность трех методов экстракции. Первый метод был адаптирован из более ранней работы [19], в которой использовали модифицированный метод Фолча [2] с двойной экстракцией (см. раздел «Пациенты и методы»). Второй метод был аналогичен подходу, описанному ранее [15] и тоже основанному на методе Фолча [16] с однократной экстракцией: к образцу клеток добавляли 200 мкл водного раствора ацетата аммония (155 ммоль/л) и 990 мкл холодного раствора хлороформ/метанол (10 : 1, о/о), ультразвуковое воздействие в течение 10 мин, добавляли 150 мкл воды, центрифугировали при 13 000 g в течение 5 мин при комнатной температуре; нижний органический слой, содержащий липиды, отбирали, высушивали в потоке азота и перерастворяли в 200 мкл раствора изопропанола с ацетонитрилом (1 : 1, о/о). В основу третьего метода легла экстракция Блайя–Дайера [24]: к образцу клеток добавляли 300 мкл смеси хлороформ/метанол (1/2), затем 100 мкл хлороформа и гомогенизировали 1 мин, добавляли 100 мкл воды и дополнительно гомогенизировали 1 мин; затем центрифугировали 10 мин при 1000 g при 4 °C, отбирали органическую фазу, к полярной фазе добавляли 2 мл холодного хлороформа, отбирали образовавшуюся органическую фазу и добавляли к экстракту, полученному на предыдущем шаге. Полученный состав высушивали в потоке азота и перерастворяли в 4 мл холодного раствора хлороформ/метанол (1/1) c добавлением 1,8 мл водного раствора NaCl (20 ммоль/л). Раствор дважды фильтровали через PFTE шприц-фильтр (0,2 мкм).

Второй метод с однократной экстракцией по Фолчу показал низкую эффективность для экстракции слабополярных липидов (триглицеридов, диглицеридов и церамидов). К достоинствам третьего метода относится возможность успешной экстракции кардиолипинов наравне с остальными классами липидов, однако он самый трудоемкий и содержит наибольшее число стадий, что приводит к падению воспроизводимости результатов и производительности экстракции. Наиболее универсальным и оптимальным с точки зрения трудозатрат, воспроизводимости и времени оказался первый метод, использованный далее в работе. Кроме того, анализ водно-метанольной фазы, получаемой в первом методе, позволяет получать информацию о полярных метаболитах, в частности аминокислотном составе образца.

Для определения липидома были также опробованы два варианта хроматографического разделения исследуемых смесей: обращенно-фазовая хроматография и гидрофильная хроматография (HILIC). Характерные хроматограммы и масс-спектры исследованных экстрактов липидов представлены на рис. 1 и рис. 2. В режиме положительных ионов было идентифицировано около 200 липидов с использованием характерных тандемных масс-спектров и около 1000 липидов с идентификацией только по точной массе. В основном идентифицированные липиды относятся к классам моно-, ди- и триглицеридов, церамидов, различным формам фосфатидилхолинов и фосфатидилэтаноламинов, и в том числе к продуктам окисления данных фосфолипидов. К достоинствам метода HILIC следует отнести разделение по классам липидов, однако интенсивность масс-спектрометрических пиков липидов в среднем на 30% ниже, чем при обращеннофазовой хроматографии. Кроме того, метод HILIC плохо разделяет неполярные липиды (в частности, триглицериды), которые плохо связываются с колонкой и элюируются за время, близкое к мертвому времени колонки. В результате количество идентификаций липидов оказалось на 25% меньше в случае HILIC. Дальнейшие эксперименты были проведены с использованием обращенно-фазовой хроматографии.

В табл. 1 суммирована информация о количестве идентифицированных липидов в проанализированных образцах. В экстрактах из 2 млн моноцитов удалось идентифицировать на 15% больше липидов, чем в экстрактах из 1 млн. В 5 млн клеток идентифицировано на 21% больше липидов, чем в 2 млн, а в 10 млн на 65% больше, чем в 5 млн. Для ОАМ при аналогичном сравнении получены следующие результаты: в 2 млн на 28% больше, чем в 1 млн, в 5 млн на 10% больше, чем в 2 млн, и в 10 млн на 6% больше, чем в 5 млн. Таким образом, при ограниченном количестве клеточного материала (макрофагов) необходимо анализировать не менее 2 млн клеток, поскольку именно при переходе от 1 млн клеток к 2 млн достигается наибольший прирост идентификаций. В случае с моноцитами принципиальной разницы между образцами с 1, 2 или 5 млн клеток нет.

Результаты анализа профиля аминокислот в образцах моноцитов и ОАМ представлены в табл. 2. Площади хроматографических пиков коррелируют с числом клеток в образцах, за исключением образцов моноцитов, содержащих 1 млн клеток. В данном случае, по всей видимости, накладывается ограничение чувствительности хромато-масс-спектрометрического анализа. Рекомендуется исследовать образцы, содержащие не менее 2 млн клеток.

ВЫВОДЫ

Разработан метод анализа метаболома клеточных культур моноцитов и ОАМ с помощью ВЭЖХ-МС/МС. В качестве оптимального метода пробоподготовки выбран модифицированный метод Фолча с двойной экстракцией, позволяющий одновременно выделить экстракт липидов (органическая фаза) и экстракт водорастворимых веществ, в частности аминокислот (водно-метанольная фаза). Наиболее интенсивные пики в масс-спектрах соответствуют липидам и другим метаболитам, что делает данный подход эффективным для получения метаболомного профиля. В рамках данного исследования были проанализированы возможности ВЭЖХ-МС/МС липидных экстрактов клеток с различным хроматографическим разделением: HILIC и обращенно-фазовая хроматография. Наиболее информативные данные получены с помощью обращенно-фазовой хроматографии. Проведен сравнительный анализ липидома и аминокислотного состава образцов моноцитов и макрофагов, содержащих 1, 2, 5 и 10 млн клеток. Липиды и аминокислоты обнаружены во всех исследованных образцах, но наиболее эффективная идентификация может быть выполнена для образцов, содержащих не менее 2 млн клеток. Разработанный подход для анализа метаболома клеточных культур методом ВЭЖХ-МС будет использован для определения метаболомного состава макрофагов и моноцитов, а также для поиска характерных различий в метаболомном профиле опухолеассоциированных макрофагов и моноцитов при онкологических заболеваниях.