Успехи в разработке мРНК-вакцин (ЛНЧ) позволили менее чем за год получить две одобренные FDA вакцины (Pfizer/ BioNTech и Moderna) против вируса SARS-CoV-2 [1, 2]. Препараты на основе мРНК-ЛНЧ могут быть использованы как для терапии ряда социально значимых заболеваний, так и в качестве профилактических вакцин против многих инфекционных возбудителей. Гибкость платформы мРНК- ЛНЧ обусловлена возможностью специфического выбора последовательности антигена в составе молекулы мРНК, а также за счет различных вариантов состава липидов и их соотношения в ЛНЧ, которые могут модулировать эффективность и иммуногенность мРНК вакцин [3]. Липидные частицы Pfizer/BioNTech и Moderna включают в себя заряженные ионизированные липиды, нейтральные ионизируемые липиды, полиэтиленгликоль-содержащие липиды, холестерин и дистеароилфосфатидилхолин (DSPC) [4]. ЛНЧ обеспечивают интернализацию мРНК- ЛНЧ в клетку и играют адъювантную роль, стимулируя умеренное усиление воспаления в месте введения [3]. Показано, что центральную роль в индукции воспаления, вызванного ЛНЧ, могут играть различные варианты ионизируемых липидов, которые распознаются toll-like-рецепторами 4-го типа (TLR-4) [5]. Кроме того, молекула мРНК в составе вакцины может обладать провоспалительными свойствами через TLR-3,7,8, RIG-I, MDA5 [6, 7]. Умеренная провоспалительная активность способствует эффективной презентации антигенов на поверхности антигенпрезентирующих клеток и формированию гуморального и Т-клеточного иммунитета. Однако в некоторых случаях воспаление может приводить к нежелательным эффектам. В частности, недавние исследования показали, что ЛНЧ приводят к сильному воспалительному ответу в месте введения, имеют широкий профиль распределения в организме и обнаруживаются во многих тканях, в том числе в головном мозге [4, 8]. Беспрепятственное прохождение гематоэнцефалического барьера в совокупности с провоспалительными свойствами могут вызывать нежелательные явления в виде иммунной активации в центральной нервной системе. Целью исследования была динамическая оценка маркеров нейровоспаления в префронтальной коре и гипоталамусе у лабораторных мышей линии Balb/c после введения различных доз мРНК-ЛНЧ вакцин.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальный дизайн

В эксперименте на конвенциональных условиях использовали 75 взрослых самцов (в возрасте 9–10 недель, весом 19–22 г) Balb/c, полученных из питомника лабораторных животных «Рапполово» РАМН (Санкт-Петербург, Россия) и содержащихся в Центре экспериментальной фармакологии Санкт-Петербургского химико-фармацевтического университета при фиксированном световом режиме 12.00 : 12.00 ч. Стандартный корм (гранулы) и воду животные получали без ограничения. Перед исследованием животных распределили в исследовательские группы путем рандомизации. Инъекция различных доз мРНК-ЛНЧ (три концентрации — 5, 10 и 20 мкг РНК) или контрольных (пустых) ЛНЧ в фосфатном буфере производили внутримышечно в объеме 30 мкл. Спустя 4, 8 и 30 ч после введения взвеси частиц животные получали ингаляцию 2,0% изофлюрана (Laboratories Karizoo, S.A.; Испания) в смеси с кислородом в течение 5 мин, а затем подвергали декапитации (рис. 1). Образцы гипоталамуса и префронтальной коры (ПФК) выделяли, как описано ранее [9]. Контрольным животным был введен аналогичный объем (30 мкл) фосфатного буфера. В каждой группе на каждую экспериментальную точку использовали по пять животных.

Клонирование

Амплификацию целевого гена, содержащего последовательность 5'-UTR Moderna (gggaaataagagagaaaa gaagagtaagaagaaatataagaccccggcgccgccacc), кодирующую последовательность люциферазы светлячка (Photinus pyralis) и 3'-UTR Moderna (gctggagcctcggtggcctagcttcttg ccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtgtctttgaataaagtctgagtgggcggca), осуществляли путем сшивки трех фрагментов методом ПЦР с перекрывающимися праймерами. Затем полученный фрагмент инкубировали с эндонуклеазами рестрикции EcoRI и BglII, очищали на агарозном геле и осуществляли лигирование с аналогично подготовленным коммерческим вектором pSmart (Lucigen; США). Вектор содержал polyA-хвост длиной 110. Для трансформации использовали штамм E. coli NEB-stable (New England Biolabs; UK). Клоны отбирали методом ПЦР с колоний и подтверждали последовательность вставки секвенированием. Культивирование E. coli для наработки верифицированной плазмиды проводили на шейкере- инкубаторе при 30 °C и 180 оборотах в минуту. Затем с помощью набора QIAGEN Plasmid Maxi Kit (Qiagen; США) выделяли плазмидную ДНК из бактериальных клеток. Полученный препарат плазмиды линеаризовали по уникальному сайту рестрикции SpeI с последующей визуализацией в агарозном геле.

In vitro транскрипция мРНК

In vitro транскрипцию проводили в буфере, содержавшем 20 мМ DTT, 2 мМ спермидина, 80 мМ HEPES-KOH (pH 7,4), 24 мМ MgCl₂. Реакционная смесь содержала также по 3 мМ каждого из рибонуклеозидтрифосфатов («Биосан»; Россия), 12 мМ аналога кэпа ARCA («Биолабмикс»; Россия). Остальные компоненты из расчета на 100 мкл реакции: 40 единиц ингибитора рибонуклеаз RiboCare («Евроген»; Россия), 500 единиц T7 РНК-полимеразы («Биолабмикс»; Россия), 5 мкг линеаризованной плазмиды и 1 мкл смеси ферментов из набора RiboMAX Large Scale RNA Production System (Promega; США) в качестве источника неорганической пирофосфатазы. Реакцию проводили 2 ч при температуре 37 °С, после чего в реакцию добавляли еще по 3 мМ каждого из рибонуклеозидтрифосфатов и инкубировали в течение еще 2 ч. ДНК гидролизовали при помощи нуклеазы RQ1 (Promega; США), РНК преципитировали добавлением LiCl до концентрации 0,32M и EDTA pH 8,0 до концентрации 20 мМ с последующей инкубацией на льду в течение часа. Далее раствор центрифугировали 15 мин (25 000 g, 4 °С). Осадок РНК промывали 70%-м этанолом, растворяли в ультрачистой воде и еще раз преципитировали спиртом по стандартной методике. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически по поглощению на длине волны 260 нм.

Формуляция мРНК в ЛНЧ

Формулирование мРНК в липидные наночастицы проводили путем смешивания водного раствора (10 мМ цитратный буфер, pH 3,0) 0,2 мг/мл мРНК со спиртовым раствором смеси липидов в микрофлюидном картридже на приборе The NanoAssemblr™ Benchtop (Precision Nanosystems; США). Липидная смесь содержала следующие компоненты: ионизируемый липидоид ALC- 0315 (BroadPharm; США), дистеароилфосфатидилхолин (DSPC) (Avanti Polar Lipids; США), холестерин (Sigma-Aldrich; США), DMG-PEG-2000 (BroadPharm; США) в молярном соотношении (%) 46,3 : 9,4 : 42,7 : 1,6. Количество липидов на единицу мРНК рассчитывали из соотношения N/P = 6 (ионизируемый липидоид ALC-0315 к основанию мРНК). Для формирования частиц требуемого размера водную и спиртовую фазы смешивали в соотношении 3 : 1 по объему с общей скоростью смешивания 10 мл/мин. После смешения фаз полученную водно-спиртовую суспензию частиц диализировали в 300 объемах фосфатно- солевого буфера (pH 7,4, 18 ч, +15 °С). После диализа суспензию частиц концентрировали, используя фильтры Amicon Ultra-4 с отсечением MW10 000. Затем частицы фильтровали в стерильных условиях через фильтр с мембраной из PES 0,22 мкм (Merck; США) и хранили при 4 °С. Пустые ЛНЧ получали путем смешивания 10 мМ цитратного буферного раствора (pH 3,0) со спиртовым раствором смеси липидов в микрофлюидном картридже аналогично получению мРНК-ЛНЧ.

После фильтрации качество полученных частиц анализировали по двум параметрам: загрузка мРНК и размер частиц. Концентрацию загруженной в липидные наночастицы мРНК определяли по разнице значений уровня флуоресцентного сигнала при окрашивании реагентом RiboGreen (Thermo Fischer Scientific; США) суспензии частиц до их разрушения и после. Для разрушения частиц использовали детергент Triton X-100 (Sigma-Aldrich; США). Размер ЛНЧ определяли методом динамического рассеяния света на приборе Zetasizer Nano ZSP (Malvern Panalitycal; США).

Оценка уровня экспрессии генов в мозге

Выделение суммарной РНК проводили из ПФК и гипоталамуса с использованием набора для выделения РНК на колонках («Биолабмикс»; Россия) согласно протоколу производителя. Для определения концентрации РНК и степени ее очистки от белков был использован спектрофотометр NanoDrop OneC (Thermo Scientific; США).

Для реакции обратной транскрипции брали 500 нг РНК и использовали набор для обратной транскрипции ОТ-M-MuLV-RH («Биолабмикс»; Россия) с рандомными гексануклеотидными праймерами. Полученную кДНК использовали для оценки уровня экспрессии генов. В качестве маркеров нейровоспаления оценивали экспрессию генов провоспалительных цитокинов и интерлейкинов (Il1β, Tnfα), генов-маркеров активации микроглии (Aif1) и астроглии (Gfap). В работе использовали метод количественного ПЦР-анализа с флуоресцентными зондами Taq-man. Последовательности праймеров и зондов представлены в (см. таблица.).

Экспрессию оценивали относительно мРНК гена домашнего хозяйства (Gapdh). Для постановки ПЦР использовали набор «БиоМастер HS-qPCR 2×)» («Биолабмикс»; Россия) на амплификаторе Real-Time CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories; США) по протоколу: 95 °С в течение 15 с, 60 °С — 20 с. Для каждого образца кДНК все определения проводили в трех технических повторах. Для анализа количественной экспрессии был применен метод ΔΔСt.

Статистический анализ

Статистическую обработку данных проводили с помощью дисперсионного анализа ANOVA (в качестве факторов были использованы «группа» и «время после введения») и Fisher’s LSD в качестве post hoc анализа. Различия между экспериментальными группами считали статистически значимыми при p < 0,05, на уровне тенденции — при p < 0,1. Анализ данных производили с помощью пакета программ Statistica 8.0 (Statsoft Inc.; США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Полученные результаты демонстрируют, что различные дозы мРНК-ЛНЧ вакцин индуцируют активацию экспрессии Aif1 в гипоталамусе (рис. 2), но не в префронтальной коре (рис. 3). Двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA позволил выявить достоверное влияние факторов «группа» и «время после введения» на экспрессию Aif1 в гипоталамусе (F(4,70) = 2,866 при p = 0,032; F(2,72) = 4,246 при p = 0,019). У групп мышей с введением 10 мкг мРНК и 20 мкг РНК в составе мРНК-ЛНЧ-вакцины экспрессия мРНК Aif1 была выше примерно на 80% через 8 ч после введения вакцины, чем у контрольной группы с введениемфосфатного буфера (p > 0,05). Интересно, что в группах с введением 5 мкг РНК в составе мРНК-ЛНЧ-вакцин и с пустыми ЛНЧ (без мРНК) также выявлено повышение экспрессии Aif1 (на 40–55%) через 8 ч, однако эти различия были статистически недостоверны. Через 30 ч после введения вакцин различий в экспрессии Aif1 гипоталамусе между животными разных групп не наблюдалось. Достоверного влияния фактора «группа» или взаимодействия факторов «группа» и «время после введения» не обнаружено ни на экспрессию других оцененных генов в гипоталамусе (Tnfα, Il1β, Gfap), ни на экспрессию генов в префронтальной коре. Таким образом, мы наблюдали умеренное влияние мРНК-ЛНЧ на нейровоспаление, связанное с повышенной экспрессией маркеров активной микроглии в гипоталамусе, но не во фронтальной коре, и это влияние было дозозависимым.

Сравнение экспрессии генов в различных временных точках у животных разных групп после введения мРНК- ЛНЧ вакцины показало, что экспрессия Il1β была сильно повышена через 4 ч после вакцинации как в гипоталамусе, так и в префронтальной коре у некоторых животных из групп с введением 10 мкг мРНК и 20 мкг РНК в составе мРНК-ЛНЧ вакцины, но в более поздних точках измерений эти эффекты не наблюдались. Несмотря на выраженные эффекты на Il1β, эти различия не были статистически достоверными, поскольку лишь некоторые животные из групп имели выраженный ответ. Такие результаты свидетельствуют о гетерогенности ответа на мРНК-ЛНЧ- вакцину в зависимости от индивидуальных особенностей животных.

Мы нашли влияние фактора «время после введения» на экспрессию Gfap и Tnfα в гипоталамусе (F(2,72) = 10,179 при p < 0,0001; F(2,72) = 5,181 при p = 0,008). Экспрессия Gfap снижалась через 8 ч во всех экспериментальных группах, в то же время усиливалась через 30 ч. Интересно, что у большинства экспериментальных групп экспрессия Tnfα тоже усиливалась через 30 ч после вакцинации, по сравнению с уровнем, который наблюдали через 4 ч. Эти результаты позволяют предположить, что у мышей из экспериментальных групп развивается вторая волна провоспалительной активации, в которую вовлечены клетки астроглии и интерлейкин TNFα.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные результаты показали, что мРНК-ЛНЧ вакцины в дозе 10–20 мкг мРНК способны усиливать уровень экспрессии Aif1 через 8 ч после вакцинации в гипоталамусе, но не в префронтальной коре. Мы обнаружили, что экспрессия Gfap, Il1β, Tnfα в экспериментальных группах демонстрировала различия в уровне экспрессии в различных временных точках в гипоталамусе, что также является косвенным свидетельством того, что уровень экспрессии этих генов может коррелировать с фактом введения мРНК-ЛНЧ вакцин.

мРНК-ЛНЧ-вакцины способна вызвать как местное, так и системное воспаление [4, 8]. Воспаление может быть вызвано различными компонентами вакцины: молекулами мРНК, липидами, входящими в состав ЛНЧ, или белковым продуктом, кодируемым мРНК. мРНК-ЛНЧ в основном трансфецируют клетки вблизи места инъекции, после чего ЛНЧ быстро транспортируются в проксимальные лимфатические узлы путем пассивного дренирования, а также активно переносятся профессиональными антигенпрезентирующими клетками и нейтрофилами [10 11]. Затем мРНК-ЛНЧ через системный кровоток могут достичь любой клетки организма и в низких количествах обнаруживаются в головном мозге, что свидетельствует о ее способности преодолевать гематоэнцефалический барьер [12, 13].

Известно, что периферические воспалительные стимулы также могут вызывать иммунологический ответ в головном мозге, который приводит к активации клеток микроглии, являющихся основными иммунокомпетентными клетками головного мозга [14]. Благодаря своей цитокинсинтезирующей и фагоцитирующей активности они влияют на развитие и созревание структур ЦНС [15], участвуют в нормальном становлении и созревании нейронных цепей во время развития [16], поддерживают пул нейрональных клеток, опосредуют созревание и редукцию синапсов, регулируя количество синапсов и экспрессию рецепторов [17].

Таким образом, найденные нами признаки активации микроглии в некоторых экспериментальных группах могут быть как свидетельством прямого прохождения мРНК-ЛНЧ через гематоэнцефалический барьер и запуска процессов нейровоспаления, так и следствием усиления периферического воспаления. Поскольку в нашем исследовании мы не оценивали параметры периферической иммунной активации, мы не можем однозначно ответить на этот вопрос.

Получение достоверных различий по экспрессии Aif1 через 8 ч после иммунизации согласуется с данными, которые демонстрируют, что пик активации микроглии приходится на период 6–24 ч после индукции воспаления [:lit_14, 18–20]. В то же время пик активации цитокинов после индукции воспалительными агентами, такими как бактериальный липополисахарид или синтетический аналог двухцепочечной РНК (Poly I:C), приходится на 1,5–3,0 после введения воспалительных миметиков [20]. Поэтому отсутствие значимых эффектов на экспрессию Il1β и Tnfα между группами может быть связано с тем, что пик активации экспрессии этих генов уже пройден. В то же время ряд исследований демонстрирует, что повышенный уровень цитокинов на периферии и в головном мозге может сохраняться до 24 ч после индукции воспаления миметиками [18, 21].

В нашей работе мы оценивали экспрессию провоспалительных генов в двух структурах головного мозга. В гипоталамусе отмечены значительно более выраженные эффекты, в то время как в префронтальной коре никаких значимых изменений найдено не было. Гипоталамус является важной структурой мозга, которая функционирует как метаболический центр, регулирующий многие фундаментальные физиологические процессы, участвующие в метаболизме всего тела, включая восприятие питательных веществ, контроль аппетита, расход энергии; таким образом, гипоталамус играет решающую роль в системной гомеостатической регуляции [22]. Клинические данные показали, что различные стимулы, такие как периферическое воспаление или увеличение количества потребления насыщенных жирных кислот, могут привести к нейровоспалению в этой структуре мозга [23–25]. Кроме того, в гипоталамусе присутствуют различные популяции микроглиальных и астроглиальных клеточных популяций [26]. В совокупности эти данные свидетельствуют, что гипоталамус может являться своеобразным сенсором периферического воспаления и реагировать на провоспалительные сигналы более реактивно, чем префронтальная кора.

ВЫВОДЫ

мРНК-ЛНЧ-вакцина способна активировать экспрессию Aif1 в гипоталамусе через 8 ч после вакцинации дозозависимым образом. В то же время в префронтальной коре значимого влияния мРНК-ЛНЧ-вакцин на экспрессию генов найдено не было. Несмотря на то что через 30 ч после вакцинации изменения в экспрессии Aif1 были не значимы, эти результаты показывают, что мРНК-ЛНЧ-вакцина может индуцировать нейровоспаление. Для понимания механизмов, за счет которых мРНК-ЛНЧ-вакцина стимулирует воспаление, необходимы дополнительные эксперименты на расширенных группах животных с оценкой параметров периферического воспаления и более широким спектром анализа нейровоспаления с привлечением иммуноферментных и иммуногистохимических методов для оценки провоспалительных агентов и морфологии микроглиальных клеток в гипоталамусе и других мозговых структурах.