Постковидный синдром (постковид, лонг-ковид, Post COVID-19 condition) — это новое малоизученное патологическое состояние. Несмотря на то что точное определение постковидного синдрома отсутствует, наиболее распространенными симптомами, согласно результатам многих исследований, являются слабость и одышка, длящиеся в течение нескольких месяцев после острого COVID-19 [1]. К другим хроническим проявлениям постковида относят когнитивные и психические нарушения, боли в груди и суставах, сердцебиение, миалгию, нарушения обоняния и вкуса, кашель, головную боль, а также желудочно-кишечные расстройства и нарушения сердечно-сосудистой системы [2]. Патогенез постковидного синдрома связан с повреждением большого количества различных клеток и органов, что проявляется целым набором симптомов. Долгосрочные симптомы возникают у пациентов, перенесших COVID-19 и в легкой, и в тяжелой форме. Симптомы перенесенного COVID-19 разнообразны, но их систематизации нет.

Чаще всего постковидный синдром постепенно регрессирует в течение полугода, но у некоторых больных длительное время сохраняются полиорганные нарушения и развиваются осложнения. Диагностика постковидного синдрома субъективна и основана на жалобах больных.

Наиболее часто у большинства больных с самой разнообразной симптоматикой можно наблюдать нарушения в системе гемокоагуляции. Лабораторным подтверждением патологии гемостаза при постковиде служит тест определения D-димера — продукта распада фибрина-полимера, который образуется при ферментативном гидролизе белкового каркаса тромба [3, 4]. Однако D-димер в высоких концентрациях обнаруживают не у всех больных, поэтому он не может служить полноценным и единственным маркером постковидного синдрома. В настоящее время оптимального метода диагностики, позволяющего выявить информативные патогенетически значимые диагностические критерии постковидного синдрома, не предложено.

В связи с тем, что патогенез постковидного синдрома связан с повреждением клеток, приводящим к развитию воспалительного процесса, было высказано предположение об изменении функциональной активности ведущих клеток воспаления — нейтрофилов и моноцитов. Одним из проявлений участия этих клеток в воспалительном процессе служит образование экстраклеточных ловушек.

Цель исследования состояла в сравнении информативности показателей, полученных при традиционном клинико-лабораторном обследовании больных с постковидным синдромом, с результатами определения в крови нейтрофильных и моноцитарных экстраклеточных ловушек.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В исследование был включен 21 амбулаторный пациент в возрасте 18–59 лет (36 [27÷50]). Критерий включения: диагноз постковидный синдром. Группу сравнения (контроль) составили 20 здоровых доноров в возрасте 18–59 лет (38,5 [29÷51,5]) без перенесенной коронавирусной инфекции.

Биохимические показатели крови больных и здоровых доноров определяли на автоматическом биохимическом анализаторе Olympus 5800 (JP, Olympus Corporation; США) на базе клинико-диагностической лаборатории ГБУЗ Москвы «ДКЦ № 1 ДЗМ». Исследование проводили в лаборатории кафедры патофизиологии и клинической патофизиологии лечебного факультета ФГАОУ ВО РНИМУ имени Н. И. Пирогова Минздрава России. Все процедуры выполняли в соответствии с принятыми этическими нормами. Помимо традиционных клинико-лабораторных исследований в работе были использованы новые лабораторные методы: определение нейтрофильных и моноцитарных экстраклеточных ловушек.

Определение содержания нейтрофильных и моноцитарных экстраклеточных ловушек. Получение клеточных фракций

Выделение нейтрофилов и моноцитов

Венозную кровь пациентов помещали в силиконизированную пробирку с ЭДТА для предотвращения свертывания. Для выделения нейтрофилов и моноцитов из венозной крови, обработанной ЭДТА, кровь разводили в 2 раза натрийфосфатным буферным раствором, рН 7,4, и наслаивали на двойной градиент плотности фиколла-верографина. Плотность верхнего слоя градиента составляет 1,077 г/см³, а нижнего — 1,190 г/см³. После центрифугирования (1600 об./мин, 30 мин) на границе между градиентами возникает скопление нейтрофилов с чистотой 98–100%, а на поверхности верхнего слоя градиента (1,077) появляется кольцо моноцитов.

Нейтрофилы и моноциты дважды отмывали от примесей фиколла натрий-фосфатным буферным раствором (50 мМ, рН 7,4). Осаждение клеток крови проводили при центрифугировании (1200 об./мин, 15 мин). Выделенные нейтрофилы и моноциты в среде RPMI-1640 использовали в экспериментах по культивированию. Жизнеспособность выделенных нейтрофилов и моноцитов составляла 95 и 99% соответственно.

Иммунофлюоресцентное определение нейтрофильных и моноцитарных экстраклеточных ловушек

Для обнаружения и подсчета нейтрофильных и моноцитарных экстраклеточных ловушек использовали флюоресцентную микроскопию. Методика подробно представлена в заявке на Патент РФ № 2021104936/ 14(010852).

Результаты выражали в процентах, в виде отношения количества экстраклеточных ловушек к общему числу клеток в поле зрения.

Выявление нейтрофильных и моноцитарных экстраклеточных ловушек осуществляли с использованием флюоресцентного красителя SYBR Green (Evrogen; Россия), специфично взаимодействующего с двухцепочечной ДНК. Подсчет и фоторегистрацию клеток и экстраклеточных структур проводили при увеличении ×700.

Статистическая обработка

Для статистической обработки данных использовали пакет программ STATISTICA 12.0 (StatSoft Ink.; США). Результаты представляли с помощью среднего значения (М) и стандартной ошибки (m), при распределении, отличающемся от нормального, — в виде медианы (Me) и 25-го и 75-го перцентилей распределения значений показателя (межквартильный размах). Количественные признаки сравнивали с использованием рангового U-критерия Манна–Уитни и дисперсионного анализа Краскела–Уоллиса. Различие считали статистически значимым при значении p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Первичный осмотр пациентов основной группы проводили в период с 60 до 119 дня от начала болезни, т. е. спустя 95 [89–109] дней, или 13,6 недель. Возраст больных с постковидным синдромом составил 36,0 [27,0–50,0] лет, а в группе здоровых доноров — 38,5 [29,0–51,5] лет (р = 0,818). Индекс массы тела у больных и здоровых доноров был практически идентичен — 25,0 [22,0–28,7] кг/м² и 24,6 [23,3–29,5] кг/м² (p = 0,783) соответственно.

Легкое течение заболевания в анамнезе имели 11 (52,4%) пациентов, среднетяжелое — 7 (33,3%), тяжелое — 3 (14,3%) пациента. Встречаемость симптомов COVID-19 к 95-му [89–109] дню болезни представлена на рис. 1. В среднем один пациент имел 1–6 симптомов (2,4 ± 1,1).     

У обследованных нами больных с постковидным синдромом чаще всего возникали слабость, головная боль, боль в эпигастрии и головокружение (рис. 1). Реже больные жаловались на выпадение волос и одышку. В других работах по исследованию симптоматики больных с постковидным синдромом наиболее часто были зарегистрированы слабость, миалгии, головные боли и симптомы вегетативных нарушений. Можно предположить, что такая клиническая картина наиболее характерна для постковидного синдрома. Симптомокомплекс не требует специфического лечения и, возможно, обусловлен микроангиопатиями и повреждением эндотелия сосудов.

Лабораторные показатели больных с постковидным синдромом в сравнении с показателями здоровых доноров представлены в таблица.

Таким образом, у больных с постковидным синдромом, по сравнению с группой контроля, обнаружены некоторое относительное увеличение количества эритроцитов, лимфоцитов и эозинофилов в периферической крови, повышение активности печеночных ферментов, увеличение концентрации глюкозы в плазме крови. Несмотря на то что изменения показателей больных не выходили за пределы референсных значений, они явно не случайны. На наш взгляд, относительное увеличение количества эритроцитов в крови больных, перенесших COVID-19, связано с гипоксией, сопутствовавшей заболеванию.

Увеличение активности трансаминаз и повышение уровня глюкозы в крови может быть связано с умеренным поражением гепатоцитов.

Подтверждением этого предположения является и факт повышения активности ферментов гаммаглутамилтранспептидазы и щелочной фосфатазы.

Наблюдаемое умеренное повышение содержания в крови эозинофилов и лимфоцитов, на наш взгляд, отражает истощение гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы в процессе перенесения COVID-19, что приводит к некоторому снижению концентрации кортизола в крови обследованных пациентов. Уровень D-димера у них практически не изменен, что объясняется отсутствием или слабо выраженным процессом тромбообразования.   

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Клинико-лабораторные показатели, представленные в таблица, в целом не позволяют выявить характерные для постковидного синдрома специфичные изменения. Вместе с тем известно, что для постковидного синдрома характерен выраженный воспалительный процесс в сосудистом эндотелии [5]. Лабораторным признаком такого асептического воспаления служит выявление в крови нейтрофильных экстраклеточных ловушек (НЭЛ) в нитевидной форме [6]. Примечательно, что эти нитевидные структуры выявляются только у тех больных, которые перенесли заболевание в легкой и среднетяжелой форме (рис. 2). У переболевших в легкой форме количество НЭЛ составило 6,55 ± 0,94% (p < 0,05), в среднетяжелой форме — 0,86 ± 0,51% (p < 0,05). МЭЛ у больных этих групп не обнаружены.

У больных, перенесших COVID-19 в тяжелой форме, НЭЛ не были выявлены. Тем не менее, продукты деградации ДНК — внеклеточные пуриновые азотистые основания найдены и у больных, переболевших в тяжелой форме [7]. Мы предположили наличие, а затем и обнаружили у таких больных МЭЛ в нитевидной форме (рис. 3). Содержание МЭЛ у этих больных было невысоким и составило 1,01 ± 0,71% (p < 0,05).

Ферментативная деградация волокон ДНК вызывает появление факторов вторичной альтерации — внеклеточных пуриновых азотистых оснований, способных повреждать клетки центральной нервной системы (ЦНС) и внутренних органов и поддерживать, таким образом, асептическое воспаление. Причем у больных с постковидным синдромом экстраклеточные ловушки в нитевидной форме и увеличенное количество внеклеточных пуриновых азотистых оснований регистрировали на протяжении продолжительного времени (три месяца и более). Мы полагаем, что повышенное количество внеклеточных пуриновых азотистых оснований — это наиболее существенный фактор патогенеза постковидного синдрома, который необходимо ограничивать, чтобы избежать повреждения эндотелия, клеток ЦНС и внутренних органов. Источником этих повреждающих молекул (факторов вторичной альтерации) служат нитевидные структуры, происходящие из нейтрофилов и моноцитов. Следовательно, эффективная терапия должна быть направлена на ограничение формирования нейтрофильных и моноцитарных экстраклеточных ловушек у больных с постковидным синдромом.

В настоящее время продуцируемые нейтрофилами экстраклеточные структуры (НЭЛ) большинство исследователей определяют как сетевидные и считают, что нейтрофилы формируют только эти сетевидные образования. Однако это не так. Мы впервые выявили зависимость морфологии нейтрофильных экстраклеточных ловушек от вида воспаления и нашли, что НЭЛ в нитевидной форме характерны только для асептического воспаления [6]. А сетевидные НЭЛ возникают только при благоприятном течении инфекционного воспалительного процесса [6]. Сетевидная структура НЭЛ имеет особое физиологическое значение, поскольку она функционально активна. Волокна такой сети захватывают патогены и гибнущие инфицированные клетки организма, а затем осуществляют ретракцию [8]. Моноциты/макрофаги поглощают и гидролизуют сеть вместе с патогенами и остатками погибших клеток организма. НЭЛ в нитевидной форме не способны к такой реакции и служат источником факторов вторичной альтерации — внеклеточных пуриновых азотистых оснований. Более того, действие аденина, высвобождающегося в больших количествах при ферментативном гидролизе волокон ДНК, ингибирует активность Т-лимфоцитов и может вызвать формирование вторичного иммунодефицита. По результатам настоящего исследования можно сделать заключение, что наиболее характерным информативным диагностическим признаком постковидного синдрома является обнаружение в крови нейтрофильных и моноцитарных ловушек в нитевидной форме.

ВЫВОДЫ

1. Диагностическим признаком постковидного синдрома являются нейтрофильные и моноцитарные экстраклеточные ловушки в нитевидной форме. 2. Нейтрофильные экстраклеточные ловушки в нитевидной форме обнаружены у больных с постковидным синдромом, перенесших COVID-19 в легкой и среднетяжелой формах. У больных с постковидным синдромом, переболевших в тяжелой форме, нейтрофильные экстраклеточные ловушки не были обнаружены, но в крови присутствуют моноцитарные экстраклеточные ловушки в нитевидной форме.