На сегодняшний день трансплантация фекальной микробиоты (ТФМ) становится все более востребованым подходом к коррекции дисбиоза микробиоты, обусловленного различными патологическими состояниями. ТФМ представляет собой процедуру введения взвеси фекалий здорового донора в кишечный тракт реципиента с целью терапии или профилактики ряда заболеваний посредством изменения микробиома реципиента [1–3]. На основании большого числа рандомизированных исследований доказана высокая эффективность применения метода при рефрактерных и рецидивирующих формах кишечных инфекций, вызванных Clostridium difficile [1, 4, 5]. С 2013 г. процедура ТФМ официально одобрена Управлением по контролю пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (Food & Drug Administration, FDA) [6].

Выбор и скрининг доноров является одним из наиболее важных аспектов ТФМ, так как обеспечивает ее безопасность для пациента. Отбор доноров самый трудоемкий и ресурсозатратный и состоит из нескольких этапов: анкетирования (для сбора анамнеза заболеваний донора) и лабораторного обследования (предотвращает возможную передачу патогенов реципиенту). Лабораторное обследование донора включает в себя: базовые гематологические и биохимические исследования крови, анализ на гепатиты В и С, вирус иммунодефицита человека, сифилис, общий анализ мочи, копрограмму, анализ кала на скрытую кровь, простейшие и яйца гельминтов, бактериальный посев кала, анализ кала методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на патогенную кишечную флору и выявление генетических маркеров лекарственной устойчивости (наличие генов резистентности) [7, 8].

В последнее время наблюдается активное распространение микроорганизмов, несущих гены устойчивости к антибиотикам различных групп [9]. Обусловлено это, в частности, повсеместным повышением частоты применения антимикробных препаратов широкого спектра действия. Давление, оказываемое антибиотиками на микробную популяцию, приводит к мутации или трансформации генетического материала, обеспечивающего выработку новых механизмов адаптации к изменяющимся условиям [10]. Помимо этого, существует механизм передачи генов устойчивости от одной бактерии к другой, происходящий с помощью мобильных элементов (плазмиды, транспозоны и интегроны). Распространение генов устойчивости к антибиотикам происходит в результате техногенного развития разных секторов промышленности не только среди микроорганизмов, непосредственно взаимодействующих с человеком, но и в природе. Устойчивые бактерии были выделены из глубоких подземных траншей, в сточных водах, поверхностных и грунтовых водах, отложениях и почвах [11]. Они присутствуют также в организмах, живущих в местах, относительно не затронутых человеческой цивилизацией, таких как Антарктида и Арктика [12]. Распространение генов резистентности к антибиотикам возрастает с каждым годом. Так, в одном из исследований, длившемся с 2011 по 2015 г. были изучены частота и механизмы устойчивости к макролидам штаммов Streptococcus pyogenes, выделенных из микрофлоры человека. Результаты показали возросшую резистентность патогена к макролидам на 6,8–12,6% от общего числа исследуемых штаммов [13].

При подборе доноров для трансплантации микробиоты особый интерес вызывают гены, обусловливающие устойчивость бактерий родов Streptococcus и Staphylococcus к макролидам, линкозамидам и стрептограминам. К данной группе относятся ген mef (macrolide efflux), продуктами которого являются эффлюксные белки, и ген ermB (erytromimycin ribosome methylation), кодирующий 23S рРНК-метилазу, которая модифицирует молекулы мишени антибактериальных препаратов (АБП) [14, 15]. В другом исследовании отмечено широкое распространение генетических детерминант mefА и ermB, где оба гена резистентности были детектированы во всех образцах кишечной микробиоты больных хронической обструктивной болезнью легких (не применявших антибиотики минимум три месяца) как метагеномным методом, так и методом ПЦР в реальном времени [16, 17]. Гены резистентности в больших количествах были также обнаружены в образцах фекалий и даже меконии новорожденных детей [18].

Частое распространение данных генов среди потенциальных доноров для ТФМ вызывает проблему отбора подходящих индивидумов для предоставления здоровой микробиоты.

Целью данной работы было провести анализ встречаемости генетических маркеров лекарственной устойчивости mef и ermB среди различных возрастных групп населения, а также определить микробиологический состав дистальной части кишечника у потенциальных доноров микробиоты.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сбор образцов

Первичный отбор доноров проводили на основании анкетирования и согласно разработанному алгоритму [7]. Критерии включения: любой пол; возраст 18–55 лет, не принимавших антибактериальные препараты с лечебной целью от года и более. Образцы кала в данной группе исследуемых отбирали для определения состава микрофлоры, обнаружения патогенных микроорганизмов и анализа наличия генов резистентности. Критерии исключения: наличие в анамнезе заболеваний, связанных с нарушением состава кишечной микробиоты, хронических заболеваний и/или прием АБП. Согласно полученным данным из 57 обследованных добровольцев в исследование включены 23 здоровых добровольца, потенциальных донора фекальной микробиоты. Остальные добровольцы исключены из дальнейшего анализа ввиду отклонений от нормы показателей анализа крови.

Дополнительно в исследование включена группа «мать–дитя». Методом случайной выборки на основании информированного согласия биологический материал был получен от следующих категорий участников исследования: а) младенцы до 1 года, находящиеся на грудном вскармливании и никогда не принимавшие АБП; б) младенцы до 1 года на искусственном вскармливании, никогда не принимавшие АБП; в) дети 1–3 лет, никогда не принимавшие АБП; г) дети 3–7 лет, не принимавшие АБП больше года. В группу «мать–дитя» вошли шесть пар (кормящая мать/ребенок на грудном вскармливании), у которых были отобраны образцы кала (матери и младенца) и грудного молока.

Всего в исследование включено 52 образца биологического материала, из них 46 образцов кала и шесть образцов грудного молока. Среди образцов кала (n = 46) 29 получено от взрослого населения, девять — от младенцев (2–11 месяцев), шесть детей находилось на грудном вскармливании и трое — на искусственном; четыре образца — дети 1–3 лет; четыре образца — дети 3–7 лет.

Забор кала и грудного молока осуществляли в индивидуальный стерильный пластиковый контейнер. Образец весом 10–20 г (кал) и 10–20 мл (молоко) не подвергали заморозке, а как можно скорее отправляли в термоконтейнере для исследования либо хранили не более 8 ч при температуре 4 °С до момента его передачи. Бактериологический посев кала

Посев проводили согласно нормативным документам [19]. Образец нативного образца кала массой 1 г гомогенизировали в 9 мл физиологического раствора (10^–1), оставляли при комнатной температуре на 10–15 мин. Полученную суспензию высевали на плотные питательные среды для выявления патогенных энтеробактерий (SS- и XLD-агар (HiMedia Laboratories; Индия)) и селенитовый бульон (Биокомпас-С; Россия) для выделения патогенных кишечных палочек. Из исходного разведения (10^–1) готовили ряд последующих до 10^–8.

Из приготовленных разведений делали посевы на питательные среды для культивирования различных групп микроорганизмов (на полужидкие питательные среды суспензию вносили в количестве 1 мл, на плотные — 0,1 мл, растирали стерильным шпателем по поверхности среды):

• разведение 10^–8 — бифидобактерии на полужидкую питательную среду Блаурокк (ФБУН ГНЦ ПМБ Оболенск, Россия);
• разведение 10^–7 — лактобактерии на полужидкую питательную среду МРС-2 (ФБУН ГНЦ ПМБ Оболенск, Россия) и бифидобактерии на среду Блаурокк (ФБУН ГНЦ ПМБ Оболенск, Россия);
• разведение 10^–5 — клостридии, посев производили глубинным методом на железосульфитный агар («Биокомпас-С»; Россия), в количестве 1 мл; грамотрицательные энтеробактерии — среда Эндо (HiMedia Laboratories; Индия); гемолитические виды бактерий — кровяной агар (HiMedia Laboratories; Индия).
• разведение 10^–3 высевали на среду Эндо («Биокомпас-С»; Россия); для выявления патогенных грибов — среду Сабуро («Биотехновация»; Россия); стафилококков — желточносолевой агар (HiMedia Laboratories; Индия); энтерококков — молочно-ингибиторную среду («Биокомпас-С»; Россия) (табл. 1).

Оценку бактериологического анализа проводили:

• через 20–22 ч на средах Эндо, кровяной агар, SS- и XLD-агар;
• через 48 ч на средах Сабуро, желточно-солевой агар и молочно-ингибиторной;
• через 72 ч на средах Блаурокк, МРС-2, железосульфитный агар.

На средах Эндо подсчитывали число и процент лактозонегативных (бесцветных) колоний по отношению ко всему числу выросших колоний. Колонии со слабовыраженными ферментативными свойствами (слабое разложение лактозы — розовые колонии) подсчитывали по отношению к общему числу колоний кишечной палочки. Согласно имеющимся рекомендациям, родовой состав лактозонегативных энтеробактерий, не относящихся к патогенным бактериям семейства кишечных, можно не детализировать, а ограничиться определением на среде Эндо общей суммы лактозонегативных колоний.

Экстракция ДНК из биологического материала

Экстракцию ДНК из биологического материала (кал, грудное молоко) выполняли с использованием набора «ДНК-СОРБЕНТ» («Литех»; Россия) согласно протоколу производителя. Выделение ДНК из грудного молока выполняли по схеме выделения ДНК из слюны, ликвора, синовиальной жидкости. До проведения ПЦР выделенную ДНК хранили при температуре –20 °С.

Анализ генетических маркеров лекарственной устойчивости

Анализ проводили с использованием моноплексного набора «РЕЗИСТОМ.Mef» (выявление mef-генов резистентности Streptococcus spp. к макролидам) и «РЕЗИСТОМ. ErmB» (выявление erm-генов резистентности Streptococcus spp. и Staphylococcus spp. к макролидам, линкозамидам и стрептомицину В) формата ФЛУОРОПОЛРВ («Литех»; Россия) методом ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories; США). Всего было протестировано 52 образца ДНК, выделенной из биологического материала (кала и молока). Для контроля качества выделения ДНК, а также предотвращения возникновения ложноотрицательных результатов в наборе использовали внутренний экзогенный контроль (детектируемый по каналу HEX), который вносится в исследуемые образцы на этапе экстракции ДНК. ПЦР проводили в следующем режиме: 80 °С — 2 мин, 95 °С — 1 мин 30 с, затем 40 циклов: 95 °С — 15 с, 60 °С — 30 с, 72 °С — 40 с. 

Статистический анализ

Статстическую обработку выполняли с использованием программы Statistica 10.0 (StatSoft Inc.; США). Значимость различий наблюдаемых частот генов АБР в группах оценивали по критерию χ² Пирсона с поправкой Йейтса. Значимость различий частот для бактериологических показателей оценивали по критерию Мак-Немара. Различие считали статистически значимым при значениях p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Согласно данным анкетирования и результатам клинических исследований (общий и биохимический анализ крови) из 57 обследованных добровольцев для дальнейшего исследования включены 23 человека — потенциальных донора фекальной микробиоты.

Для установления вероятного минимального возраста формирования носительства и путей передачи генов резистентности к макролидам (mef и ermB) сформирована группа «мать–дитя» (6 человек). Из данной группы в исследование включено 12 образцов кала и 6 образцов грудного молока.

Бактериологический анализ

В ходе работы была проведена предварительная оценка качественного и количественного бактериологического состава образцов кала потенциально здоровых добровольцев (n = 23). Результаты бактериологического посева соответствовали нормативным документам [20] и представлены в табл. 2.   

Содержание видов облигатной микрофлоры, таких как Bifidobacterium, Lactobacillus, Escherichia, находится в норме у 52,2% исследуемых; Enterococcus — у 8,7%. Условнопатогенные бактерии факультативной микрофлоры не превышают нормы у 34,8% добровольцев и представлены видами Enterobacter cloacae, Staphilococcus aureus, Citrobacter freundii, Citrobacter amalonaticus, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Enterobacter gergoviae, лактозонегативная Escherichia coli.

Таким образом, анализ бактериологического посева показал, что соответствие нормам по всем показателям только 8,7% добровольцев, что составляет лишь четыре человека из 23 обследованных.

Молекулярно-генетический анализ

Проведенный анализ генетических маркеров лекарственной устойчивости к макролидам показал, что все 23 добровольца донора имеют положительный результат на оба гена (mef и ermB).

Поэтому для установления возможного возрастного периода появления данных генов, связи их наличия непосредственно с приемом АБП и путей передачи была сформирована выборка добровольцев «мать–дитя» и детей разных возрастных групп. Анализ генов резистентности mef и ermB проводили не только на образцах кала, но и дополнительно в образцах грудного молока. В табл. 3 представлены данные по наличию генов устойчивости в кале у всех добровольцев (n = 46) разных возрастных групп.    

Согласно полученным данным при анализе образцов кала mef-ген устойчивости к макролидам был выявлен в 45/46 (97,8%) образцах (табл. 3 и табл. 4). Данный ген отсутствовал только в одном исследуемом образце, кале ребенка 7 лет. Наличие ermB-гена устойчивости к макролидам, линкозамидам, стрептограмину было подтверждено в 43/46 (93,5%) образцах (табл. 3 и табл. 4). Ген ermB не детектирован в образцах кала трех младенцев, находящихся на грудном и искусственном вскармливании.

Наличие одновременно генов устойчивости mef и ermB выявлено в 44/52 образцах (84,6%).

Статистический анализ частот обнаружения генов mef и ermB не показал значимых различий между возрастными группами (p = 0,258).

В группе «мать–дитя», где ребенок находится на грудном вскармливании (табл. 4), генетические детерминанты (ген mef) обнаружены во всех образцах грудного молока матери и кала младенцев. Наличие гена ermB подтверждено для трех из шести образцов грудного молока и четырех из шести образцов кала младенцев. Стоит отметить, что из трех младенцев, получающих грудное молоко, не содержащее ген ermB, в образцах кала одного данный ген тем не менее выявлен. При изучении совместного распределения генов устойчивости mef и ermB в группе «кормящая мать–ребенок на грудном вскармливании» выявлено отсутствие значимых различий между подгруппами (p = 0,423).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Отбор доноров для проведения трансплантации фекальной микробиоты является одним из самых сложных и важных этапов терапии, что обусловлено необходимостью исключить или свести к минимуму нежелательные последствия трансплантации для реципиента. Отдельное внимание стоит уделять резистентным бактериям, которые при трансплантации могут спровоцировать появление устойчивых клонов среди микрофлоры реципиента [21]. В то же время отрицательный результат бактериологического анализа не может гарантировать отсутствие самих генов резистентности.

Определение бактериологического состава кала позволяет выявить фекальную микрофлору, отражающую микробный состав дистальных отделов кишечника, и определить качественное и количественное содержание микробиоты. Изменение соотношения отдельных видов микроорганизмов позволяет диагностировать дисбиотические нарушения пищеварительного тракта.

Толстая часть кишечника здорового человека представлена в основном тремя группами бактерий: 1) облигатная микрофлора (более 90%) включает в себя непатогенные виды бактерий (бифидобактерии, бактероиды, лактобактерии, кишечную палочку, энтерококки) и выполняет основные физиологические функции организма (пищеварение, всасывание); 2) факультативная микрофлора (менее 10%) включает в себя условно-патогенные микроорганизмы (клостридии, стафилококки, протеи, кампилобактерии, дрожжеподобные грибы и др.) и участвует в защитной и пищеварительной функциях; 3) транзиторная (случайная) микрофлора (не более 1%), представлена синегнойной палочкой, грибами рода кандида, патогенными энтеробактериями и др. По результатам бактериологического анализа кала в нашей выборке здоровые доноры (четыре человека из 23) характеризовались достаточным количеством бифидобактерий, лактобактерий, эшерихий и энтерококков, а также содержали в пределах нормы условно-патогенные бактерий, что соответствует нормативным документам [22]. Большая часть обследованных (17 из 23) имели дисбиотические нарушения: недостаточное количество представителей облигатной микрофлоры, либо повышенное содержание факультативной и транзиторной микрофлоры, что может быть вызвано несбалансированным питанием и частыми стрессами.

Очевидно, что бактериологическое исследование кала не может дать полную картину разнообразия микрофлоры кишечника, поскольку в микробиоте могут присутствовать некультивируемые бактерии, а также бактерии в незначительном количестве, вследствие чего тоже не поддающиеся культивированию на искусственных питательных средах. На сегодняшний день для более точного изучения кишечной микробиоты применяют полногеномное секвенирование и метагеномный анализ. В то же время необходимо понимать, что в рамках медицинского обследования пациентам проводят только бактериологический анализ в сочетании с биохимическими маркерами, и на основании их результатов делают заключение о состоянии здоровья. Так называемые методы омиксного анализа не являются на сегодняшний день рутинными в практике врача-клинициста. Безусловно для понимания точного механизма действия ТФМ и, возможно, вычленения наиболее активных компонентов необходимы мультидисциплинарные комплексные исследования. В то же время все больше лечебных учреждений внедряют в свою практику ТФМ и могут использовать для подбора доноров лишь рутинные исследования. Таким образом, важно понимание значимости анализа наличия генов резистентности в биоматериале, применяемом для ТФМ.

В данной работе сфокусировано внимание на анализе встречаемости генов mef и ermB, обуславливающих резистентность к макролидам, линкозамидам и стрептомицину В. Согласно полученным данным в образцах кала всех 23 здоровых добровольцев обнаружены оба гена резистентности, mef и ermB.

В дополнительно сформированной группе мать–дитя были выявлены следующие результаты. Ген mef обнаружили во всех образцах грудного молока и в образцах кала следующих категорий участников, которые никогда не принимали АБП: младенцев до 1 года, находящихся на грудном вскармливании; младенцев на искусственном вскармливании; детей 1–3 лет. Данный ген был выявлен также у всех взрослых и троих детей, возрастом 3–7 лет, которые больше года не принимали АБП. Результаты нашего исследования совпадают с данными другой работы, где частота встречаемости гена mef в кале новорожденных составляет 100% [22].

Ген ermB не был детектирован в образцах кала трех младенцев. При этом двое из них находились на грудном вскармливании и молоко матери не содержало данный ген, одного младенца вскармливали искусственно. Стоит также отметить, что у одного из младенцев, молоко матери которого не содержит ген ermB, данный ген присутствует в кале. У двух детей до года, находящихся на искусственном вскармливании, в кале присутствует ген ermB. Вопрос приобретения генетических детерминант в кале новорожденных в пренатальный период, во время родов или после не изучен окончательно. В предыдущих исследованиях было подтверждено, что гены резистентности в фекалиях новорожденных были приобретены после рождения (например, через грудное молоко и/или воздух или питьевую воду, поскольку в амниотической жидкости и меконии новорожденных гены резистентности не были обнаружены) [23–25].

ВЫВОДЫ

Анализ микробиологического состава кала 23 потенциально здоровых добровольцев показал, что только 8,7% участников исследования имеют соответствующую нормам микробиоту дистальной части кишечника и могут быть рассмотрены в качестве потенциальных доноров для ТФМ. Это может свидетельствовать о проблеме с составом микробиоты населения в целом. Дополнительно в ходе исследования проанализирована встречаемость генетических маркеров лекарственной устойчивости mef и ermB среди разных возрастных групп населения, включая младенцев. Показана высокая частота выявления гена устойчивости к макролидам (mef) — 97,8%, гена устойчивости к макролидам, линкозамидам, стрептограмину (ermB) — 93,5%. В группе «мать–дитя» ген mef обнаружен во всех образцах кала и грудного молока. Таким образом ввиду того, что гены mef и ermB можно обнаружить не только у взрослого населения, но и в столь раннем возрасте нами было выдвинуто предположение, что использование трансплантата (кала), содержащего данные гены, допустимо для ТФМ. Представленные данные могут помочь клиницистам, внедряющим методику ТФМ в практику, при самостоятельном поиске доноров и подготовке биоматериала.