Преэклампсия (ПЭ) является мультисистемным осложнением 3–8% всех беременностей [1], обусловливает 16–18% случаев материнской смертности и 40% случаев смерти плода и новорожденных [2]. В соответствии с Международным обществом по изучению гипертензии при беременности (ISSHP) ПЭ определяют как наличие вновь возникшей гипертензии (более 140/90 мм рт. ст.) после 20 недель беременности, сопровождающейся протеинурией (не менее 0,3 г/л в суточной моче) или признаками острой почечной недостаточности, дисфункцией печени, неврологическими расстройствами, гемолизом или тромбоцитопенией, или внутриутробной задержкой развития плода. В зависимости от времени возникновения клинических симптомов различают раннюю и позднюю ПЭ (дебют заболевания до или после 34-й недели беременности соответственно) [3] [https://cr.minzdrav.gov.ru/schema/637_1], причем ранняя ПЭ характеризуется наиболее тяжелым течением и составляет 5–20% в структуре всех видов ПЭ. Неблагоприятные исходы для плода связаны с формированием хронической гипоксии и высокой частотой задержки развития, а также вызывают у плода осложнения, обусловленные недоношенностью, включая респираторный дистресссиндром, инфекционно-воспалительные заболевания, внутрижелудочковые кровоизлияния, церебральный паралич, задержку когнитивных функций, аутизм, психомоторные, поведенческие расстройства и/или неспособность к обучению [4, 5].

Основополагающую роль в патогенезе ПЭ играют материнские и/или плацентарные факторы, что предопределяет время возникновения клинических проявлений ПЭ и их тяжесть. К плацентарным факторам относят нарушения пролиферации и дифференцировки клеток трофобласта на доимплантационном этапе при возникновении ошибок реализации эмбриональной программы и на последующих этапах имплантации вследствие воспалительных изменений в децидуальном слое, влияющих на взаимодействие клеток трофобласта и эндометрия [6–8]. Нарушение дифференцировки клеток вневорсинчатого трофобласта приводит к недостаточному ремоделированию спиральных маточных артерий: сначала в децидуальном сегменте на сроке до 10-й недели беременности, что проявляется в виде сниженной обструкции артерий эндоваскулярными клетками трофобласта и, как следствие, повреждению ворсин плаценты реактивными формами кислорода и азота [9], а затем в сегментах миометрия с 16-й по 18-ю неделю беременности [10]. Результатом аномальной реструктуризации маточных артерий является увеличение резистентности маточных артерий, механическое повреждение ворсин плаценты из-за повышенного давления крови, поступающей в межворсинчатое пространство [11–14], и в итоге гипоксически/ишемические изменения плацентарной ткани ввиду нарушений маточноплацентарного кровотока [1, 15]. Из ишемизированной плаценты происходит выброс различных биологических факторов, вызывающих системное повреждение эндотелия сосудов и возникновение острой полиорганной недостаточности у матери. При ПЭ доказаны такие изменения уровня циркулирующих в крови плацентарных факторов, как снижение концентрации ассоциированного с беременностью белка А плазмы (РАРР-А) и плацентарного ростового фактора (PlGF) наряду с повышенным образованием растворимой fms-подобной тирозинкиназы-1, уровнем фактора роста эндотелия сосудов А (VEGF-A),  ингибина А, активина А, прокоагулянта Р-селектина, провоспалительного интерлейкина 2 и фактора некроза опухолей альфа и др. [1, 16–18]. К материнским патогенетическим факторам относят генетическую предрасположенность, иммунологические факторы, хронические заболевания у матери (метаболический синдром, сахарный диабет, хроническую артериальную гипертензию), которые могут вносить вклад в регуляцию процесса плацентации, равно как и усугублять восприимчивость материнского организма к факторам, выделяемым ишемизированной тканью плаценты, что ускоряет появление клинических симптомов у матери [19].

В поисках причин временных различий проявления клинических симптомов ПЭ были сопоставлены данные профилирования метилома ДНК клеток трофобласта, плацентарного транскриптома и материнского протеома при ранней и поздней ПЭ [20]. Выявлено влияние секретома сыворотки крови женщин с ПЭ на возникновение стресса эндоплазматического ретикулума (функциональной перегрузки аппарата секреции белка из-за нарушения процессов укладки белковых молекул) в клетках трофобласта [21], причем степень активации системы утилизации неправильно уложенных белков оказалась различной при ранней и поздней ПЭ [22, 23].

Таким образом, тщательный анализ изменений секретома плаценты позволит понять различия патогенеза ранней и поздней ПЭ. В нашем предыдущем исследовании [24] мы обнаружили снижение уровня секреторной формы кластерина в плазме крови женщин при врастании плаценты — осложнении беременности, характеризующемся чрезмерной инвазией клеток трофобласта и повышенным уровнем ангиогенных факторов, т. е. кардинально противоположными процессами, наблюдаемыми при ПЭ. Кластерин является внутри- и внеклеточным шапероном. Он играет важную роль в индуцированном стрессом белковом гомеостазе (протеостазе), и его активность зависит от степени гликозилирования в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) [25, 26]. Кластерин экспрессируется во многих тканях человека, в том числе в клетках цитотрофобласта, синцитиотрофобласта и вневорсинчатого трофобласта [27]. Известно его свойство ингибировать эпителиальномезенхимальный переход при фенотипической трансформации клеток трофобласта, что снижает их миграцию и инвазию путем подавления уровня экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 и виментина и увеличения экспрессии Е-кадгерина [27]. При физиологических условиях кластерин в основном секретируется во внеклеточное пространство после посттрансляционной модификации в ЭПР и аппарате Гольджи, образует комплексы с неправильно свернутыми белками, которые интернализуются рецептор-опосредованным эндоцитозом и затем направляются в аутофагосомы для деградации. Во время стресса ЭПР, например, как следствие окислительного стресса, кластерин высвобождается из ЭПР в цитозоль для формирования комплексов с белками неправильной укладки и направленного транспорта в протеасомы для деградации [28]. Выраженная экспрессия маркеров стресса ЭПР приводит к активации сигнальных путей, участвующих в воспалении и апоптозе — процессах, поддерживающих накопление неправильно свернутых белковых молекул и усугубляющих патологический процесс.

Участие кластерина в процессах, индуцированных стрессом ЭПР, чрезмерные проявления которого характерны для ПЭ, специфичность его экспрессии в клетках трофобласта и наличие секреторной формы данного белка послужили отправной точкой для проведения научного исследования, целью которого было оценить значение в прогнозировании развития ранней и поздней ПЭ уровня секреторного кластерина в разных фракциях сыворотки крови женщин (везикулярной и вневезикулярной) в первом триместре беременности.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Все пациентки, включенные в настоящее исследование, обратились в Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени В. И. Кулакова (ФГБУ «НМИЦ АГП им. В. И. Кулакова») для ведения беременности и родов.

В первую когорту пациенток вошли 40 беременных в возрасте 27–40 лет, проходивших комплекс исследований в рамках скрининга первого триместра беременности и сформировавших четыре группы (табл. 1):  1) 10 женщин с низким риском развития ПЭ по данным скрининга первого триместра (по данным программы Astraia) с физиологическим течением беременности и родивших доношенных детей; 2) девять женщин с высоким риском развития ПЭ с физиологическим течением беременности и родивших доношенных детей; 3) 10 женщин с высоким риском развития ПЭ и манифестацией ПЭ на сроке 34–37 недель; 4) 11 женщин с высоким риском развития ПЭ и манифестацией ПЭ на сроке 25–33 недели.  

Во вторую когорту пациенток вошли 27 беременных в возрасте 25–38 лет, родоразрешенных путем кесарева сечения и сформировавших четыре группы (табл. 2): 1) шесть женщин с доношенной физиологической беременностью (37–39 недель); 2) семь женщин с предлежанием плаценты и преждевременным излитием околоплодных вод на сроке 25–31 неделя гестации без клинических проявлений преэклампсии; 3) семь женщин с ранней преэклампсией (25–30 недель); 4) семь женщин с поздней преэклампсией (36–38 недель). 

Критерии невключения в исследование обеих когорт пациенток: наступление беременности с помощью вспомогательных репродуктивных технологий, многоплодная беременность, отягощенный соматический анамнез беременной женщины, анеуплодии плода. Методы исследования включали: клинический и биохимический анализы крови, УЗИ органов малого таза и плода, доплерометрию фето-плацентарного кровотока, кардиотокографию, измерение артериального давления, определение уровня белка в моче, определение концентрации PLGF, sFlt-1, PAPP, β-ХГЧ в сыворотке крови с помощью диагностических тест-систем.

Сыворотку крови (800 мкл) каждой пациентки из первой когорты центрифугировали 10 мин при 300 g при 4 °C и надосадочную жидкость повторно центрифугировали 10 мин при 3000 g при 4 — для очистки от примесей форменных элементов крови. Очищенную сыворотку (200 из 700 мкл) использовали для выделения РНК набором miRNeasy Serum/Plasma kit (Qiagen; Германия) с предварительным добавлением 5,6 × 10⁸ копий синтетической РНК cel-miR-39 (Qiagen; Германия) после инкубации сыворотки с фенольной смесью Qiazol для контроля эффективности выделения РНК и синтеза кДНК в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Элюат РНК в объеме 7 мкл использовали в обратной транскрипции набором miScript II RT Kit (Qiagen; Германия) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Синтезированная кДНК (2 мкл) служила в качестве матрицы для ПЦР-анализа в реальном времени с использованием смыслового праймера, специфичного для исследуемой мкРНК (miR-320a-3p, MIMAT0000510, 5'-aaaagctgggttgagagggcga, температура отжига с матрицей — 59,5 °C; miR-17-5p, MIMAT0000070, 5'-caaagtgcttacagtgcaggtag, 55 °C; miR-25-3p, MIMAT0000081, 5'-cattgcacttgtctcggtctga, 56 °C; miR-92a-3p, MIMAT0000092, tattgcacttgtcccggcctgt, 60 °C), cel-miR-39 (miScript Primer Assay, Ce_miR-39_1, 55 °C; Qiagen; Германия), и набора miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen; Германия), содержащего универсальный праймер miScript Universal Primer (антисмысловой) и ПЦР-смесь SYBR Green PCR MasterMix. Условия реакции ПЦР: 15 мин при 95 °C с последующим проведением 40 циклов (15 с — при 94 °C, 30 с — при температуре отжига праймера и 30 с — при 70 °C) в амплификаторе StepOnePlusTM (Applied Biosystems; США). Относительный уровень экспрессии кДНК оценивали методом ΔCt, где ΔСt = (Ct)si – (Ct)ri, где (Ct)si — значение порогового цикла амплификации кДНК анализируемой мкРНК в образце; (Ct)ri — значение порогового цикла амплификации кДНК референсной РНК cel-miR-39 в образце.

Оставшиеся 500 мкл очищенной сыворотки крови пациенток первой когорты были использованы для выделения микровезикул набором miRCURY Exosome Kits (Qiagen; Германия) c добавлением 200 мкл преципитирующего раствора и 14-часовой инкубацией при 4 — с последующим центрифугированием при 1500 g в течение 30 мин при 20 °C. Супернатант отбирали в чистую пробирку, и в конечном его разведении в 100 раз при добавлении Laemmli буфера (#1610737, BioRad; США) с 5% (v/v) 2-меркаптоэтанолом (Am-O482-0.1, VWR Life Science AMRESCO; США) использовали для анализа Вестерн-блоттингом. К осадку, содержащему везикулы, добавляли 270 мкл ресуспендирующего буфера, и в конечном разведении везикул в 1000 раз при добавлении Laemmly буфера (#1610737, BioRad; США) с 5% (v/v) 2-меркаптоэтанолом (Am-O482-0.1, VWR Life Science AMRESCO; США) образец использовали для анализа Вестерн-блоттингом.

Образцы ткани плаценты, взятые для исследования не позднее 10 мин после родоразрешения пациенток второй когорты, представляли собой тканевой срез толщиной 5 мм, проходящий через всю толщу плаценты и охватывающий плодную и материнскую части плаценты целиком от хориальной пластинки до децидуальной оболочки. Взятый образец ткани плаценты промывали в 0,9%-м NaCl и мгновенно замораживали в жидком азоте для последующего хранения при –80 °С. Ткань измельчали до порошковой консистенции в парах жидкого азота и 10 мг ткани лизировали в буфере RIPA Lysis Buffer System (sc-24948, Santa Cruz; США). После инкубации во льду в течение 30 мин и центрифугирования лизата при 10 000 g измеряли концентрацию растворимой фракции белка биуретовым методом в спектрофотометре NanoDrop One (ThermoScientific; США). Для последующего анализа методом Вестерн-блоттинга брали 40 мкг белка из каждого образца.

Для количественной оценки уровня альфасубъединицы секреторной формы кластерина в сыворотке периферической крови (первая когорта пациенток) и плаценте (вторая когорта пациенток) применяли метод Вестерн-блоттинга. Перед фракционированием в разделяющем 10%-м полиакриламидном геле в гидроксиметиламинометантрициновом буфере (100 мМ гидроксиметиламинометан, 100 мМ трицин, 0,1%-й додецилсульфат натрия) образцы были денатурированы при 70 °С в течение 10 мин в буфере Laemmli sample buffer (#1610737, BioRad; США), содержащем 5% (v/v) 2-меркаптоэтанол (Am-O482-0.1, VWR Life Science AMRESCO; США). С целью определения молекулярной массы анализируемого белка в лунку каждого ПААГ вносили маркер молекулярных весов белков PageRuler, 10–250 кДа (#26619, Thermo Fisher Scientific; США). По окончании электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (0,45 µm, BioRad; США) методом полусухого переноса с использованием 10 мМ 3-циклогексиламино1-пропансульфоновой кислоты (SW18805, Sigma-Aldrich; США), рН 10,5, 10% этанола. После блокировки мембраны в 5%-м обезжиренном молоке (Blotting-Grade Blocker, #1706404, BioRad; США), 0,1% Tween20 (#1706531, BioRad; США), 50 мМ Tris (T4661, Sigma; США), pH 7,5, 150 мМ NaCl (A1371, AppliChem Panreac ITW Companies;

Германия) в течение 2 ч, проводили инкубацию в течение 1 ч с первичными антителами к альфа-субъединице кластерина в разведении 1 : 400 (B-5, sc-5289, Santa Cruz Biotechnology; США) или к актину в разведении 1 : 400 (H-6, sc-376421, Santa Cruz Biotechnology; США) в 5%-м обезжиренном молоке, 0,1% Tween20, 50 мМ Tris, pH 7,5, 150 мМ NaCl, трехкратной промывкой мембраны в течение 5 мин в  0,05% Tween20, 50 мМ Tris, pH 7,5, 150 мМ NaCl с последующей инкубацией в течение часа со вторичными поликлональными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена в разведении 1 : 2000 (HAF007, R&D Systems; США) в 1%-м обезжиренном молоке, 0,1% Tween20, 50 мМ Tris, pH 7,5, 150 мМ NaCl. После трехкратной промывки мембраны в течение 5 мин в 0,05% Tween20, 50 мМ Tris, pH 7,5, 150 мМ NaCl активность пероксидазы измеряли путем добавления хемилюминисцентного субстрата Clarity MaxTM Western ECL Substrate (#1705062, BioRad; США) и детекции хемилюминисценции в cистеме гель-документирования ChemiDoc MP (#12003154, BioRad; США).

Статистический анализ данных

Статистическую обработку данных выполняли с помощью таблиц Microsoft Excel и программы RStudio (Posit; США). Статистический анализ проводили с помощью теста Манна–Уитни при парном сравнении в случае, когда распределение не соответствовало закону нормального распределения. При распределении признаков, отличающемся от нормального, их описывали в виде медианы (Me) и квартилей Q₁ и Q₃ в формате Me (Q₁; Q₃). Величину порогового уровня значимости р принимали равной 0,05. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05. Для оценки возможности классификации пациентов по группам на основании полученных данных разрабатывали модели логистической регрессии, качество которых оценивали с помощью ROC-анализа, а также расчета чувствительности и специфичности.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ содержания секреторной формы кластерина в сыворотке крови пациенток первой когорты

На первом этапе исследования ретроспективно была проведена количественная оценка секреторной формы кластерина в сыворотке крови пациенток в среднем на 12-й неделе беременности методом Вестерн-блоттинга с использованием первичных антител к альфа-субъединице белка. В зависимости от исхода беременности пациентки первой когорты (табл. 1) были разделены на четыре группы (см. «Пациенты и методы»). Используемый набор MIRCURY exosome kit (Qiagen; Германия), основанный на преципитации в присутствии полиэтиленгликоля, позволил получить две фракции сыворотки крови беременных: везикулярную фракцию, в состав которой вошли микровезикулы, экзосомы, апоптотические тельца, и свободную от везикул фракцию (супернатант). Результаты анализа везикулярной фракции сыворотки крови представлены на рис. 1. В верхней части изображения показаны блоты с хемилюминисцентными полосами, соответствующими альфа-субъединице кластерина массой 40 кДа, в образцах норм (N) с низким риском развития ПЭ по данным программы Astraia, в образцах норм (Nhr) с высоким риском развития ПЭ, а также в образцах беременных, у которых впоследствии проявились симптомы рПЭ или пПЭ. С целью учета эффективности переноса белков из геля на мембрану и различий в экспозиции при формировании изображения в гель-документирующей системе в одну из лунок каждого геля наносили один и тот же референсный образец (P) из группы норм (N), с которым сопоставляли значения хемилюминисценции в каждом образце. Выявлено статистически значимое двукратное повышение уровня секреторного кластерина в везикулярной фракции сыворотки крови пациенток первого триместра беременности, у которых в дальнейшем развились клинические проявления ранней ПЭ, в сравнении с образцами N (р = 0,03), как указано на боксдиаграмме (рис. 1). Статистически значимых отличий группы пПЭ от группы N по уровню секреторного кластерина в везикулярной фракции выявлено не было.

Методом ранговой корреляции Спирмена была обнаружена обратная корреляция уровня секреторного кластерина в везикулярной фракции сыворотки крови женщин и КТР (r = –0,31; p = 0,052), а также прямая корреляция уровня данной фракции кластерина и значения β-ХГЧ сыворотки крови женщин (r = 0,28; p = 0,082) на 12-й неделе беременности.

Результаты анализа уровня альфа-субъединицы секреторного кластерина в свободной от везикул фракции сыворотки крови методом Вестерн-блоттинга представлены на рис. 2. Выявлено статистически значимое повышение уровня секреторного кластерина (40 кДа) во вневезикулярной фракции сыворотки крови пациенток первого триместра беременности, у которых в дальнейшем развились клинические проявления рПЭ (увеличение в 2,2 раза) или пПЭ (увеличение в 3 раза), в сравнении с образцами N (р = 0,004 и р = 0,002 соответственно), как указано на бокс-диаграмме (рис. 2). При этом в случае пПЭ уровень кластерина во вневезикулярной фракции оказался в 1,5 раза выше такового при рПЭ (р < 0,001).

Статистически значимых различий группы Nhr и группы N по уровню секреторного кластерина в везикулярной и вневезикулярной фракции сыворотки крови выявлено не было (рис. 1 и рис. 2).

Методом ранговой корреляции Спирмена была обнаружена обратная корреляция уровня секреторного кластерина во вневезикулярной фракции сыворотки крови женщин и β-ХГЧ МоМ (r = –0,3; p = 0,0627).

Количественная оценка miR-25-3p, miR-92a-3p, miR-320a и miR-17-5p в сыворотке крови пациенток первой когорты

Согласно четырем электронным базам данных miRWalk, miRanda, RNA22 и Targetscan, потенциальными регуляторами уровня экспрессии кластерина являются мкРНК miR-320a, miR-30a-5p, miR-17-5p, miR-21-5p, miR-30c-5p, miR-1323, miR-25-3p, miR-138-5p, miR-34a-5p, miR-92a-3p. В исследовании по анализу взаимосвязей между уровнями кластерина и регулирующими его мкРНК при врастании плаценты [24] нами выявлены статистически значимые обратные корреляции содержания секреторного кластерина в плазме периферической крови беременных со значениями «–ΔCt» miR-25-3p, miR-92a-3p, miR-320a, miR-17-5p на момент родоразрешения. В связи с тем что трофобластные клетки при врастании плаценты и преэклампсии имеют прямо противоположные инвазивные свойства, нам представлялось интересным проследить за возможными взаимосвязями данных мкРНК и кластерина в сыворотке крови пациенток первой когорты на 11–14-й неделе беременности. Методом количественной ОТ-ПЦР в реальном времени были получены значения относительного содержания miR-25-3p, miR-92a-3p, miR-320a, miR-17-5p в сыворотке беременных в виде значений «–ΔCt» (см. «Пациенты и методы»). Методом ранговой корреляции Спирмена была обнаружена статистически значимая положительная корреляция содержания секреторной формы кластерина во вневезикулярной фракции сыворотки крови беременных и значением «–ΔCt» miR-17-5p (r = 0,34; p = 0,0356) сыворотки крови. Надо отметить, что, согласно базе данных miRTargetLink 2.0 (https:// ccb-compute.cs.uni-saarland.de/mirtargetlink2/network/ a7aa6e41-7676-4e3b-875c-43c926dedae5), кластерин является экспериментально доказанной мишенью miR-17-5p.

Методом ранговой корреляции Спирмена выявлены статистически значимые положительные корреляции «–ΔCt» miR-16-5p сыворотки крови и индексом пульсации маточных артерий (МА (ПИ): r = 0,37, p = 0,021; МА (ПИ) МоМ: r = 0,32, p = 0,046). В свою очередь выявлены обратные взаимосвязи между индексом пульсации маточных артерий и ассоциированного с беременностью белка А плазмы (МА (ПИ) и РАРР-А: r = –0,41; p = 0,01; МА (ПИ) МоМ и РАРР-А МоМ: r = –0,35, p = 0,0296).

Оценка вероятности развития ранней и поздней ПЭ по уровню секреторного кластерина в двух фракциях (везикулярной и вневезикулярной) сыворотки крови женщин в первом триместре беременности

На основании полученных в работе значений содержания секреторного кластерина в сыворотке крови женщин первой когорты (табл. 1), проходящих скрининговое исследование в первом триместре беременности, были построены модели логистической регрессии расчета вероятности развития ранней и поздней ПЭ (рис. 3). 

Выявлено, что наилучшей прогностической точностью с высокой специфичностью и чувствительностью обладают модели оценки вероятности возникновения клинических проявлений рПЭ и пПЭ после 20-й недели берменности по уровню секреторного кластерина в свободной от везикул фракции сыворотки крови пациенток, а не в везикулярной фракции, на 11–14-й неделях беременности. Формулы расчета вероятности развития ранней ПЭ (формула 1) и поздней ПЭ (формула 2) представлены ниже:

формула

Анализ содержания секреторной формы кластерина в ткани плаценты пациенток второй когорты на момент родоразрешения

С целью идентификации секреторного кластерина в ткани плаценты от женщин с рПЭ и пПЭ в сравнении с группами соответствующего срока гестации (N < 34 недель, N > 34 недель) без признаков ПЭ была проанализирована вторая когорта пациенток (табл. 2). Полученные для кластерина данные хемилюминисценции были соотнесены с хемилюминисцентным сигналом от актина в одном и том же образце. Выявлено статистически значимое снижение уровня секреторного кластерина молекулярной массой 40 кДа в плаценте при ПЭ относительно нормы: в 2,3 раза в случае рПЭ (р = 0,001) и в 2,6 раза в случае пПЭ (р = 0,013), как указано на бокс-диаграмме (рис. 4).   

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящем исследовании мы решили сфокусировать свое внимание на количественной оценке секреторного кластерина в сыворотке крови женщин на 11–14-й неделе беременности с целью выявления возможных различий патогенеза рПЭ и пПЭ, что могло бы лечь в основу построения математических моделей прогнозирования данных осложнений беременности в первом триместре до начала клинических проявлений ПЭ.

Мы обнаружили статистически значимое повышение уровня секреторного кластерина (40 кДа) во вневезикулярной фракции сыворотки крови пациенток в первом триместре беременности при дальнейшем возникновении как рПЭ, так и пПЭ относительно группы женщин с физиологической беременностью (двукратное и трехкратное увеличение соответственно). Несмотря на более выраженное увеличение уровня секреции кластерина в случае пПЭ в сравнении с рПЭ, общее количество секреторного кластерина, циркулирующего в сыворотке крови при рПЭ, намного больше такового при пПЭ за счет везикулярной фракции, где уровень кластерина в 2,7 раза выше при рПЭ в сравнении с пПЭ. Более того, поскольку в анализ методом Вестерн-блоттинга было взято везикулярной фракции сыворотки крови в 10 раз больше, чем вневезикулярной фракции, то можно сделать вывод о большей функциональной значимости кластерина в составе циркулирующих в крови внеклеточных везикул при рПЭ в сравнении с пПЭ.

Полученные в настоящей работе данные о повышении уровня кластерина в периферической крови беременных с ПЭ согласуются с результатами работы, где методом полуколичественной нано-ЖХ-МС выявлено статистически значимое повышение уровня кластерина в сыворотке крови женщин на 10–20-й неделе беременности с последующим развитием гипертензивных расстройств после 20-й недели беременности [29]. Но в указанной работе не были проанализированы беременные с рПЭ, а были взяты в исследование беременные с пПЭ и гипертензивными расстройствами без протеинурии. В других работах при анализе плазмы крови беременных на момент родоразрешения было выявлено статистически значимое повышение уровня кластерина в группе женщин с ПЭ относительно группы женщин с физиологической беременностью [30, 31], причем беременные с ПЭ в сочетании с задержкой роста плода имели более значимое повышение уровня кластерина нежели беременные с ПЭ с нормальными фетометрическими показателями [31]. Индукция синтеза кластерина при ПЭ может быть обусловлена наличием в промоторной области кодирующего его гена участков связывания таких факторов, как SP1, NF1, AP-1, HSF1, YB-1, р53, B-MYB, уровень которых в условиях окислительного стресса, гипоксии и апоптоза резко повышается [32–35]. В свою очередь, кластерин регулирует активность фактора транскрипции NF-κB, который играет важную роль в жизнеспособности клеток, их подвижности, пролиферации, фенотипической трансформации и воспалении [36]. Кроме того, уровень экспрессии кластерина, как и любого другого белка, может регулироваться на посттранскрипционном уровне активностью микроРНК. В данной работе при количественной оценке потенциальных регуляторов экспрессии кластерина (miR-25-3p, miR-92a-3p, miR-320a-3p и miR-17-5p) в сыворотке крови женщин в первом триместре беременности выявлена статистически значимая корреляция содержания секреторной формы кластерина во вневезикулярной фракции сыворотки крови беременных и значением «–ΔCt» miR-17-5p. В одной из статей подробно описано участие miR-25-3p, miR-92a-3p, miR-320a-3p и miR-17-5p в индукции эпителиальномезенхимального перехода [37]. Возможно, участие данных микроРНК в фенотипической трансформации клеток вневорсинчатого трофобласта и последующего ремоделирования стенки маточных артерий отражается в обнаруженной нами положительной корреляции «–ΔCt» miR-16-5p сыворотки крови беременных и индексом пульсации маточных артерий (МА (ПИ): r = 0,37, p = 0,021; МА (ПИ) МоМ: r = 0,32, p = 0,046), значения которого обратно коррелировали с уровнем ассоциированного с беременностью белка А плазмы (МА (ПИ) и РАРР-А: r = –0,41, p = 0,01; МА (ПИ) МоМ и РАРР-А МоМ: r = –0,35, p = 0,0296).

Поскольку в клетках эукариот существует три формы кластерина (ядерная, секреторная и цитозольная) [25], нам представлялось интересным проанализировать возможные различия рПЭ и пПЭ по уровню секреторной формы кластерина (40 кДа) в ткани плаценты на момент родоразрешения в сравнении с образцами плацент от пациенток без признаков ПЭ соответствующего срока гестации. Мы выявили статистически значимое двукратное снижение уровня экспрессии кластерина в ткани плаценты беременных с рПЭ и пПЭ. Возможно, сниженный уровень экспрессии секреторной формы кластерина в плаценте при ПЭ обусловлен чрезмерным уровнем его секреции, что мы наблюдали в настоящей работе уже в первом триместре беременности у женщин с развившейся впоследствии ПЭ. Другой причиной может быть повышенное поступление секреторного кластерина из плаценты в материнскую кровь при ПЭ в связи с характерным для данного осложнения беременности окислительным стрессом и гипоксическими/ишемическими процессами в ткани плаценты, что сопровождается поступлением кластерина сначала из ЭПР в цитозоль [38–40], а затем в материнский кровоток в составе микровезикул и экзосом,  или в составе апоптотических телец при выраженном стрессе ЭПР в синцитиотрофобласте и цитотрофобласте [1]. Выявлено, что окислительный стресс и активация маркеров стресса ЭПР, равно как и выброс в кровоток плацентарных микровезикул, более выражены при рПЭ, чем при пПЭ [22, 41]. При этом концентрация экзосом в сыворотке крови беременных увеличивается только при рПЭ, но не при пПЭ [42]. В настоящем исследовании мы обнаружили, что именно при рПЭ статистически значимо увеличен уровень кластерина в составе везикул при отстутствии значимых изменений кластерина в везикулярной фракции сыворотки при пПЭ. При этом доказано, что секреторный кластерин в сыворотке крови беременных может оказывать негативное влияние на пролиферацию, инвазию и выживаемость самих клеток трофобласта [27, 29], формируя положительную обратную связь: «стресс ЭПР клеток синцитиотрофобласта — увеличение внетрофобластного кластерина — усугубление стресса ЭПР клеток синцитиотрофобласта и апоптотических/ некротических процессов в них — пополнение фракции внетрофобластного кластерина в материнском кровотоке».

Поскольку для двух видов ПЭ (ранней и поздней) статистически значимые изменения уровня секреторного кластерина были обнаружены во вневезикулярной фракции сыворотки крови женщин в первом триместре беременности в сравнении с физиологической беременностью, именно эту фракцию целесообразно использовать для прогнозирования развития ПЭ на этапе первого скрининга беременности, ориентируясь на разработанные в настоящем исследовании модели логистической регрессии.

ВЫВОДЫ

В рамках настоящего исследования построены модели логистической регрессии по уровню секреторного кластерина, позволяющие прогнозировать раннюю и позднюю ПЭ задолго до начала клинических проявлений данных осложнений беременности. Но для внедрения построенных математических моделей в клиническую практику необходима проверка полученных данных на более широкой выборке. Уточнены новые патогенетические механизмы развития ранней и поздней ПЭ на основании количественного анализа секреторного кластерина в двух фракциях (везикулярной и вневезикулярной) сыворотки крови женщин в первом триместре беременности и в ткани плаценты на момент родоразрешения (рис. 5).