Онколитические вирусы представляют собой новый класс препаратов для лечения злокачественных новообразований, устойчивых к классическим подходам противоопухолевой терапии. Онколитические вирусы избирательно инфицируют опухолевые клетки, вызывая прямой цитопатический эффект и опосредованную активацию цитотоксических клеток, что в итоге приводит к регрессии опухоли [1]. Вирус осповакцины (VV) представляет собой онколитический вектор с превосходными характеристиками, включающими высокую тропность и цитолитическую активность в отношении опухолевых клеток, быструю репликацию без интеграции в геном клетки-хозяина, устойчивость к гипоксическому микроокружению опухоли и хорошо охарактеризованный профиль безопасности [2, 3].

Штамм LIVP продемонстрировал значительную цитотоксическую активность в отношении опухолей различной гистологической принадлежности (колоректальный рак, рак желудка, злокачественные мезотелиомы, рак легких, рак щитовидной и молочной железы) [4, 5]. Было исследовано и биораспределение штамма LIVP — вирус избирательно заражает опухолевые клетки без обнаружения его в яичниках, селезенке или тканях мозга после внутривенной инъекции [6, 7]. Вирус осповакцины экспрессирует несколько иммуномодулирующих белков для маскировки от иммунного ответа организма, например, рецепторыприманки интерферона или ингибиторы регуляторных путей врожденного иммунитета, таких как toll-подобные рецепторы или сигналинг NF-κB[8]. Сообщалось, что штамм Lister кодирует больше генов, участвующих в уклонении от иммунного ответа, таких как A53R, рецептор растворимого фактора некроза опухоли, или T1/35 кДа — ингибитор CC-хемокинов, которые отсутствуют в других штаммах, таких как MVA или WR (Western Reserve) [9, 10]. LIVP является биовариантом английского штамма Lister, полученным путем его адаптации в коже теленка [11]. Этот штамм частично использовали в программе ликвидации оспы после 1971 г., и, как сообщается, он обладает онколитическими свойствами и значительно меньшей вирулентностью по сравнению с другими биовариантами штамма Lister [12, 13], кроме этого, он не был изучен в ряде доклинических и клинических исследований [14–19].

Модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA) является одним из самых широко изученных штаммов VV с многообещающими перспективами в онколитической вирусной терапии. MVA — высокоаттенуированный штамм; он плохо реплицируется в клетках человека, и его способность к репродукции в основном ограничена эмбриональными клетками птиц, что делает его весьма безопасным [20]. Кроме того, MVA является мощным индуктором интерферонов I типа и вызывает сильный гуморальный и клеточный иммунный ответ. Эти свойства MVA делают его важным кандидатом для разработки противоопухолевой терапии [20]. MVA одобрен Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) в качестве безопасной вакцины против оспы [21]. Кроме того, рекомбинантный вариант вакцинного вектора MVA-BN был одобрен Европейским агентством по лекарственным средствам (EMA) в составе вакцины против лихорадки Эбола и его активно используют в клинических испытаниях инфекционных заболеваний и иммунотерапии опухолей [22].

В данном исследовании мы получили рекомбинантные штаммы MVA-RFP и LIVP-RFP с инактивацией вирусного гена тимидинкиназы (ТК) для повышения специфичности к опухолевым клеткам [23] путем вставки репортерного гена tagRFP (красный флуоресцентный белок) в область делетируемого гена. Инактивация гена ТК делает репликацию вируса зависимой от клеточной ТК, которая экспрессируется только во время S-фазы клеточного цикла, в то время как трансформированные клетки постоянно ее экспрессируют. Так, рекомбинантные вирусы с дефектным геном ТК избирательно реплицируются в быстро делящихся опухолевых клетках, постоянно экспрессирующих клеточную тимидинкиназу [24].

Целью работы было сравнить онколитическую эффективность MVA-RFP и LIVP-RFP в солидных опухолях мышиных сингенных моделей аденокарциномы молочной железы 4T1, меланомы B16 и карциномы толстой кишки CT26.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культуры клеток

Клетки почки хомячка BHK-21 (ATCC № CCL-10), карциномы толстой кишки CT26 (ATCC № CRL-2639), аденокарциномы молочной железы 4T1 (ATCC № CRL-3406), меланомы B16 (ATCC № CRL-6475) и линии клеток HEK293Т (ATCC № CRL-3216) приобретены в Американской коллекции культур (ATCC; США). Крысиные фибробласты с дефицитом ТК (Rat2 TK-/-) были взяты из коллекции Лаборатории пролиферации клеток ИМБ РАН (Москва, Россия). Все клетки культивировали в среде DMEM с добавлением глутамина (Gibco; США) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) (Gibco; США), и инкубировали при температуре 37 °С в атмосфере 5% CO₂.

Вирусы

Вирус осповакцины штамма LIVP (ЛИВП) был получен из коллекции Лаборатории пролиферации клеток ИМБ РАН (Москва, Россия). Модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA) (АТСС № VR-1508) приобретен в АТСС.

Для конструирования штаммов MVA-RFP и LIVP-RFP была получена инсерционная плазмида, несущая ген tagRFP. Последовательность гена tagRFP амплифицировали методом ПЦР с плазмидной конструкции pTagRFP-C («Евроген»; Россия) с использованием праймеров 5-AGAGAGCCTGGATGGTGTCTAAGGGCGAAGAG и 5-AGAGAGGGATCCTTAATTAAGTTTGTGCCCCAGTTTG («Евроген»; Россия). tagRFP экспрессировали под контролем 7.5k-промотора. Рамку фланкировали участками гена ТК, исходная плазмидная конструкция для рекомбинации была создана в Лаборатории пролиферации клеток ИМБ РАН (Москва, Россия) [6]. Рекомбинантные штаммы получали путем липофекции клеток НЕК293Т реагентом Lipofectamine 3000 (Thermo Fischer; США) и последующим инфицированием штаммом осповакцины дикого типа. Спустя 48 ч готовили криолизат инфицированных клеток и проводили селекцию вирусных частиц на клетках Rat-2 TK-/-, обработанных бромдезоксиуридином в концентрации 25 мкг/мл [24]. После нескольких раундов селекции вирус клонировали методом бляшек для очистки от дикого штамма. Полученные рекомбинантные штаммы нарабатывали в клетках ВНК-21 и очищали методом центрифугирования в градиенте плотности сахарозы [25]. Правильность вставок в рекомбинантных вариантах была подтверждена секвенированием соответствующего участка генома по Сэнгеру. Секвенирование ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 (Thermo Fischer; США) с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (Thermo Fischer; США) в Центре коллективного пользования «Геном» ИМБ РАН. 

Титрование вируса

Клетки BHK-21 рассевали по 10 000 клеток на лунку в 96-луночный планшет, на следующий день среду удаляли и клетки инфицировали 10-кратными разведениями вирусов и инкубировали в среде DMED с добавлением 2% FBS. Через 48 ч, когда развивалось цитопатическое действие, 50%-ю инфекционную дозу культуры ткани (TCID₅₀) оценивали по методу Рида и Менча [26].

Оценка цитотоксической активности вирусов

Клетки 4T1, B16, CT26 и BHK-21 высевали по 10 000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты, затем инфицировали множественностью 1 и 10 БОЕ/кл. штаммами MVA-RFP или LIVP-RFP. Оценку цитотоксической активности проводили с использованием МТТ-теста через 24, 48 и 72 ч после заражения. Процент жизнеспособных клеток рассчитывали как соотношение жизнеспособности клеток в инфицированных лунках к жизнеспособности клеток в неинфицированных контрольных лунках и умножения на 100 [27].

Оценка скорости репликации вируса методом проточной цитометрии

Уровень экспрессии RFP в зараженных клетках коррелирует с уровнем вирусной репликации. Клетки 4T1, B16, CT26 и BHK-21 высевали по 100 000 клеток на лунку в 24-луночные планшеты, на следующий день инфицировали штаммами MVA-RFP или LIVP-RFP с MOI 1 и 10, затем снимали с подложки с помощью трипсина и ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере с добавлением 2% через 24 и 48 ч после инфицирования и измеряли количество ярко флуоресцирующих в диапазоне RFP клеток с использованием цитофлуориметра BD LSRFortessa Cell Analyser (Beckman Dickinson; США).

Анализ выполняли с помощью Flowing Software 2.0 (Perttu Terho; Финляндия). Результаты основаны на трех независимых экспериментах с тремя повторами, не менее 10 000 событий на образец.

Оценка онколитической активности вирусов in vivo

В экспериментах использовали шестинедельных самок мышей BALB/c и C57BL/6. Мыши имели свободный доступ к пище и воде и находились в стандартных условиях с контролируемой температурой (21–23 °C) и вентиляцией воздуха, а также световым режимом 12/12 ч. Для формирования опухолей 10⁶ клеток карциномы толстой кишки CT26 или рака молочной железы 4T1 имплантировали подкожно в правый бок мышей BALB/c, а 10⁶ клеток меланомы B16 имплантировали в правый бок мышей C57BL/6. До начала виротерапии мышей с верифицированными опухолевыми аллотрансплантатами клеток СТ26 (n = 15), 4Т1 (n = 15) и В16 (n = 15) делили на три подгруппы (n = 5 в каждой). Вирусы вводили на 7-й и 9-й дни после имплантации опухоли посредством внутриопухолевой инъекции в 20 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) («ПанЭко»; Россия). В экспериментальных подгруппах с аллотрансплантантами CT26, 4T1 и B16 делали внутриопухолевые инъекции, доза вируса составила 5 × 10⁷ БОЕ. Контрольные подгруппы получали внутриопухолевые инъекции фосфатно-солевого буфера. Объем опухоли измеряли по модифицированной эллипсоидальной формуле: V = ½ (длина × ширина²) [28] каждые два дня до достижения опухолей объема 2000 мм³. После достижения максимально допустимого объема мышей подвергали эвтаназии и на основе этих данных строили кривые выживаемости.

Статистический анализ

Все данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Статистический анализ проводили с использованием непарных t-тестов и двухфакторного дисперсионного анализа, различия считали значимыми при p < 0,05. Для подготовки всех графиков и проведения статистического анализа использовали программу GraphPad Prism 8.0.2 (GraphPad Software, Inc.; США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Конструирование рекомбинантных вирусов

Штаммы LIVP-RFP и MVA-RFP с инактивацией ТК, содержащие встройку красного флуоресцентного белка (tagRFP), были созданы путем рекомбинации вирусного генома с плазмидной конструкцией. Флуоресцентная микроскопия клеток HEK293T, инфицированных рекомбинантными штаммами LIVP-RFP и MVA-RFP, показала, что вирусы реплицируются и продуцируют функционально активный RFP (рис. 1).

Цитотоксическая активность штаммов LIVP-RFP и MVA-RFP в отношении опухолевых клеток мышей

Цитотоксическую активность рекомбинантных штаммов вируса осповакцины LIVP-RFP и MVA-RFP оценивали в течение 72 ч с помощью МТТ-теста в культурах клеток меланомы мыши B16, карциномы толстой кишки CT26 и аденокарциномы молочной железы 4T1 мыши, а также в чувствительной к VV клеточной линии BHK-21, которую мы использовали в качестве положительного контроля. В культуре BHK-21 штаммы LIVP-RFP и MVA-RFP через 72 ч вызывали более чем 75% гибель клеток при MOI 10 и более 50% гибель при множественности инфекции 1 (MOI 1) (рис. 2). Наиболее чувствительной из исследованных линий метастатических опухолей оказалась меланома B16, в культуре которой наблюдали 50% гибель клеток спустя 72 ч после инфицирования MOI 10 LIVP-RFP или MVA-RFP (рис. 2В; сплошные линии). При инфицировании В16 MOI 1 рекомбинантный штамм LIVP-RFP показал достоверно более высокую цитотоксичность через 72 ч, по сравнению с MVA-RFP (рис. 2; пунктирные линии). Наиболее резистентной к онколитической виротерапии оказалась линия колоректальной карциномы CT26, в культуре которой наблюдалась менее чем 50%-я клеточная гибель при множественности инфекции 10 LIVP-RFP или MVA-RFP (рис. 2). В аденокарциноме молочной железы 4T1 цитопатическое действие выявлено только при инфекции множественностью 10. При этом для штамма LIVP-RFP отмечена значимо более высокая цитотоксичность (>50%) по сравнению с MVA-RFP (рис. 2).

Оценка вирусной репликации методом проточной цитометрии

Эффективность репликации вирусных штаммов в исследуемых клеточных линиях оценивали по количеству флуоресцирующих RFP-положительных клеток, которое определяли с помощью проточной цитометрии. Было обнаружено, что уровень инфицирования контрольной линии BHK-21 уже через 24 ч приближается к 100% и существенно не меняется через 48 ч (рис. 3). В клеточной линии меланомы B16 наблюдалось увеличение количества RFP-положительных клеток, причем достоверно более высокую эффективность репликации показал штамм MVA-RFP, который инфицировал более 60% клеток в течение 48 ч. Линия аденокарциномы молочной железы 4Т1, наоборот, характеризовалась самой низкой эффективностью репликации штаммов вируса осповакцины, при этом наибольший уровень заражения мы наблюдали при инфицировании штаммом LIVP-RFP и он достигал почти 30% через 48 ч. Эффективность вирусной репликации в культуре клеток CT26 (около 40% для MOI 10) не различалась между штаммами LIVP-RFP и MVA-RFP.

Оценка противоопухолевой активности штаммов LIVP-RFP и MVA-RFP в экспериментах in vivo

Онколитическую активность рекомбинантных штаммов LIVP-RFP и MVA-RFP исследовали на мышах BALB/c с аллографтами карцином молочной железы 4T1 или толстой кишки CT26, а также на мышах C57BL/6 с аллографтами меланомы B16. Двухкратное внутриопухолевое введение онколитических вирусов на 7-й и 9-й дни после инокуляции опухоли приводило к замедлению роста опухоли (рис. 4) и повышению выживаемости животных (рис. 5) во всех группах, получавших как LIVP-RFP, так и MVA-RFP, по сравнению с контрольными группами, которым вводили PBS. Наиболее заметное замедление роста опухоли обнаружено в случае терапии аллографтов меланомы В16 с помощью внутриопухолевого введения MVA-RFP, а также аллографтов карциномы 4T1 при введении LIVP-RFP, что полностью соответствовало результатам, полученным in vitro. Выживаемость в подгруппах 4T1 и В16 (после применения виротерапии) была достоверно выше, по сравнению с контролем, при этом животные, получавшие LIVP-RFP, имели большую продолжительность жизни, чем в подгруппах MVA-RFP (рис. 5). Прогрессирование карциномы CT26 никак не изменялось при терапии как LIVP-RFP, так и MVA-RFP (рис. 4), хотя в обеих экспериментальных подгруппах наблюдалось увеличение выживаемости животных, получивших инъекции рекомбинантных вирусов (рис. 5).

ОБСУЖДЕНИЕ

В данном сравнительном исследовании мы оценили цитотоксичность, способность к репликации in vitro, а также терапевтический потенциал в отношении солидных мышиных опухолей in vivo рекомбинантных штаммов LIVP-RFP и MVA-RFP, созданных на основе штаммов вируса осповакцины LIVP и MVA соответственно и содержащих вставку одного и того же гена красного флуоресцентного белка в структурной части гена вирусной тимидинкиназы.

Эффективность терапии онколитическими вирусами складывается из двух основных компонентов: активации иммунной системы в ответ на введение вирусов и прямого цитотоксического действия вирусов на опухолевые клетки[29]. Активация иммунокомпетентных цитотоксических CD8⁺-лимфоцитов, CD56⁺-NK-клеток и тканевых макрофагов имеет критически важное значение в связи с тем, что наиболее резистентные и злокачественные опухоли характеризуются наиболее выраженным иммуносупрессивным действием на опухолевое микроокружение [30]. Поэтому системное или внутриопухолевое введение вирусных частиц, заражающих опухолевые клетки и активирующих антигенпрезентирующие клетки, сопровождается повышенной продукцией воспалительных цитокинов и рекрутингом цитотоксических иммунных клеток, что в итоге может замедлять прогрессию опухоли. К противоопухолевым иммунным реакциям добавляется прямое цитопатическое действие онколитических вирусов на опухолевые клетки вследствие повышенной скорости пролиферации, ингибированием апоптоза и другими онкогенными механизмами [30].

Одним из ключевых затруднений применения онколитических вирусов для терапии является выраженный иммунный ответ хозяина на вирусную инфекцию, вызывающий неблагоприятные побочные эффекты и снижающий эффективность виротерапии. Поксвирусы уникальны по своей способности уклоняться от иммунного ответа хозяина, что делает их в целом безопасными для использования в терапии, в частности, штамм Lister доказал свою высокую безопасность для людей, поскольку его использовали во время программы ликвидации оспы во всем мире [7, 31]. Было показано, что этот штамм индуцирует меньше провоспалительных цитокинов, таких как IL8, IL6 и IFNγ, у хозяина и вызывает более высокий уровень противовоспалительных цитокинов, таких как IL10, по сравнению с другими штаммами, такими как WR [5, 32].

Усиление онкоселективности вируса ограничивает вирусную инфекцию в месте опухоли и предотвращает заражение других органов, что приводит к меньшим воспалительным побочным эффектам. Одной из стратегий повышения избирательности опухоли и снижения вирулентности вируса осповакцины является делеция гена вирусной тимидинкиназы [33].

В нашем исследовании мы показали, что LIVP-RFP более эффективно реплицируется и лизирует клетки 4T1 по сравнению со штаммом MVA-RFP. В последующих экспериментах in vivo нам удалось продемонстрировать взаимосвязь между способностью вируса к репликации в опухолевых клетках in vitro и его способностью замедлять прогрессирование опухоли in vivo. Достоверно меньший объем опухолевых аллографтов аденокарциномы 4Т1 и увеличение выживания животных после терапии LIVP-RFP по сравнению с MVA-RFP свидетельствует о более выраженной онколитической активности LIVP-RFP по отношению к аденокарциноме 4Т1.

Линия клеток рака молочной железы 4T1 представляет собой высокоинвазивную и метастатическую клеточную модель тройного негативного рака молочной железы (ТНРМЖ) [34]. ТНРМЖ считают наиболее агрессивной формой рака молочной железы с самым неблагоприятным прогнозом и отсутствием таргетных вариантов лечения [35]. Наши результаты показывают, что штамм LIVP обладает большим потенциалом для лечения ТНРМЖ по сравнению с MVA.

ВЫВОДЫ

Сравнительное исследование онколитических свойств штаммов LIVP-RFP и MVA-RFP с инактивированным геном тимидинкиназы показало, что штамм LIVP-RFP более эффективен для онколитической виротерапии рака молочной железы 4T1. Применение штамма LIVP в качестве платформы для разработки рекомбинантных онколитических вирусов для терапии трипл-негативного рака молочной железы может быть более перспективным, чем применение штамма MVA.