Пародонтит (П) — крайне актуальная стоматологическая проблема в России и в мире [1–4]. Доказавшие свою эффективность средства для купирования острого инфекционно-воспалительного процесса содержат химический антисептик (чаще всего хлоргексидин в концентрации 0,12–0,2%) практически в 100% форм выпуска [5–8]. Однако химические антисептические средства имеют ограниченный эффективный срок применения ввиду развития резистентности бактериальной флоры. Растительные комплексы, обладающие антисептическими свойствами, сопоставимые по спектру действия и эффективности, в последние годы зарекомендовали себя как способные заместить классическую стандартную антисептическую терапию [9–12]. Очевидно, что разные формы выпуска: водные растворы, водно-спиртовые растворы, масляные растворы, гелевые формы, — имеют разную эффективность за счет различия эффективной экспозиции по времени на тканях пародонта, что определяет частоту применения средства, длительность купирования острого периода и как следствие — время компенсированной стабильной ремиссии пациента [13–14]. Доказано антибактериальное действие фитонцидов хвойных растений, экстрактов коры осины, вытяжек из ламинарии японской и сахаристой. Результат применения известен давно, а различные комбинированные формы имеют космополитный характер применения в стоматологии. При этом доказательная научная база фрагментарна и имеет в основном клиническое подтверждение, а не фундаментальное [15–18]. Применение гелевых форм при лечении пародонтита предпочтительно за счет длительной экспозиции активных компонентов на тканях пародонта. Имеющиеся в настоящее время в практике стоматолога-пародонтолога гели содержат либо антисептик, либо субстраты для репарации тканей. Нет геля с мультинаправленным действием, т. е. элиминирующим токсины и биологический мусор, способствующим метаболизму в тканях пародонта, с неспецифическим иммуномодулирующим действием, нормализующим процессы дыхания и трофики пародонта, и как результат — комбинированной индукцией ауторегенерации [19].

Как известно, полость рта отличается большим видовым разнообразием микроорганизмов. Основная часть из них являются комменсалами. Однако выявлен ряд бактериальных видов, которые непосредственно или опосредованно связаны с развитием П и других воспалительных процессов. Так, Streptococcus sanguinis способствует образованию биопленки на поверхности зубов с включением в ее состав Fusobacterium nucleatum, участвующего в развитии П [20], а также вероятностью развития в дальнейшем эндокардита [21]. Большое число исследователей заняты поиском препаратов из растительных компонентов или полученных синтетическим путем из веществ природного происхождения для борьбы с кариесогенными и пародонтогенными бактериями Streptococcus mitis, Streptococcus oralis, Streptococcus salivarius, Enterococcus faecalis [22–25]. Присутствие таких бактерий, как Staphylococcus aureus, и его метаболитов в полости рта может служить маркером определенной стадии П [26]. А наличие патогенетической оси «полость рта — кишечник» помогает рассматривать ряд бактерий, особенно обладающих маркерами вирулентности, в качестве копатогенов при пародонтите: Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii [27–29]. Поэтому в настоящей работе были рассмотрены именно эти патогены. Целью исследования было оценить антибактериальную, антиадгезивную и антибиопленкообразующую активность различных форм выпуска комбинированных средств с растительными и синтетическими компонентами различных направлений активности на пародонтопатогенную флору.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проведено в отделе новых технологий ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера в период октябрь 2021 г. — апрель  2022 г.

Использовали уже патентованный состав геля с медными производными хлорофилла, корой осины, альгинатом натрия и дигидрокверцетином (ДКВ), обладающий необходимым спектром антибактериального действия и отвечающий требованиям к препарату для комплексной терапии П [30]. Продемонстрирован положительный клинический результат применения геля с медными производными хлорофилла, корой осины, альгинатом натрия и ДКВ при П [31], а также при при гингивите и П [32].

Композиции активных компонентов

Эликсир представляет собой водно-спиртовой концентрат активных компонентов: вода, спирт этиловый 20%, хлорофиллин натрия-меди, экстракт осиновой коры, экстракт ламинарии, кокамидопропилбетаин, ароматизатор пищевой «Мятный» натуральный, поливинилпирролидон.

Ополаскиватель представляет собой водный раствор активных компонентов: вода, хлорофиллин натриямеди, экстракт осиновой коры, экстракт ламинарии, кокамидопропилбетаин, ароматизатор пищевой «Мятный» натуральный, поливинилпирролидон, натрия бензоат.

Масло «Фитолон» представляет собой масляный раствор активных компонентов: масло рафинированное косточки персика или оливы, хлорофиллин натрия-меди.

Масло «Провитам» представляет собой масляный раствор активных компонентов: масло рафинированное косточки персика или оливы, концентрат провитаминный хвойный.

Гель 1 с хлоргексидином представляет собой гелевую композицию активных компонентов: сорбитол, вода, гидрогенизированное касторовое масло, гидроксиэтилцеллюлоза, альгинат натрия, хлоргексидина гидрохлорид, д-пантенол, аллантоин, метилпарабен, метилсалицилат, ароматизатор «Пектраль», ментол, экстракт пихты, хлорофиллин натрия-меди, эвгенол, пектин.

Гель 2 с корой осины и ДКВ представляет собой гелевую композицию активных компонентов: сорбитол, вода, гидрогенизированное касторовое масло, гидроксиэтилцеллюлоза, альгинат натрия, дигидрокверцетин, д-пантенол, аллантоин, экстракт коры осины, метилпарабен, метилсалицилат, хвойный комплекс, ментол, ароматизатор «Пектраль», лимонная кислота, хлорофиллин натрия-меди, эвгенол.

Гель 3 с хлоргексидином представляет собой гелевую композицию активных компонентов: сорбитол, вода, гидрогенизированное касторовое масло, гидроксиэтилцеллюлоза, альгинат натрия, д-пантенол, хлоргексидина гидрохлорид, аллантоин, метилпарабен, метилсалицилат, ароматизатор «Пектраль», ментол, экстракт пихты, хлорофиллин натрия меди, эвгенол, пектин, — выдержанную до истечения срока годности 2 года.

Штаммы бактерий

Референтные штаммы бактерий:

1. Staphylococcus aureus АТСС № 25923
2. Enterococcus faecalis ATCC № 29212
3. Klebsiella pneumoniae ATCC № 13883
4. Pseudomonas aeruginosa ATCC № 27853
5. Acinetobacter baumannii ATCC № 19606

Штаммы бактерий из коллекции микроорганизмов лаборатории:

1. Streptococcus sanguinis № 2111
2. Streptococcus mitis № 2118
3. Streptococcus oralis № 2114
4. Streptococcus salivarius № 2107

Методы исследования

С помощью бактериологического метода исследования изучали влияние растительных комплексов на биологические свойства бактерий: выживаемость, адгезивные и антибиопленкообразующие свойства.

Исследование антибактериальных свойств растительных комплексов

Готовили микробные взвеси 24-часовых культур бактерий в физиологическом растворе, содержащем 1 × 10⁸ КОЕ/мл. Далее путем десятикратных разведений доводили количество бактерий до 1 × 10⁵ КОЕ/мл. При последнем разведении использовали мясопептонный бульон. Микробные взвеси переносили в 24 пробирки по 1 мл. В три пробирки, содержащие по 1 мл микробной взвеси конечной концентрации, вносили по 1 мл каждого растительного комплекса, в оставшиеся три пробирки вносили по 1 мл физиологического раствора. Все пробирки оставляли в термостате при температуре +37 °С на 30 мин. Далее из каждой пробирки производили высев по 10 мкл на чашки Петри с питательным агаром: для стрептококков — кровяной агар, для остальных видов бактерий — мясопептонный агар. Посев осуществляли по методу газона. Чашки Петри инкубировали в термостате 24 ч при температуре +37 °С. Далее производили подсчет колоний на каждой чашке, для каждого образца растительного компонента рассчитывали среднее арифметическое.

Исследование антиадгезивных свойств растительных комплексов

Исследование проводили по методике А. С. Благонравовой [33] на клетках буккального эпителия. Для этого клетки трижды отмывали от индигенной микрофлоры в забуференном физиологическом растворе при рН 7,2–7,4 при скорости 35 g в течение 10 мин. Затем клетки разделяли по 0,5 мл в пробирки. В каждую пробирку добавляли по 0,5 мл бактериальной суспензии, содержащей 3 × 10⁸ КОЕ/мл S. sanguinis и по 0,5 мл каждого растительного комплекса. Одна пробирка содержала только буккальный эпителий — контроль (естественная колонизация). Опыты и контроли производили в трех циклах повторений. Далее пробирки со всеми компонентами интенсивно встряхивали и помещали в термостат при температуре +37 °С на 30 мин. После этого проводили отмывание от не прикрепившихся микроорганизмов, готовили мазки на предметных стеклах, фиксировали и окрашивали по Граму. Индекс адгезии рассчитывали по формуле:

ИА = АКБ50/50Э, (1)

где ИА — индекс адгезии, АКБ50 — количество клеток бактерий, прикрепившихся к 50 эпителиоцитам, 50Э — 50 изученных эпителиоцитов.

Исследование антибиопленочных свойств растительных комплексов

Исследование осуществляли с помощью регистрации формирующихся микроколоний бактерий на плотной питательной среде. Для этого суточную бактериальную культуру исследуемых штаммов стандартизировали измерением мутности 0,5 по МакФарланду. Методом серийных разведений концентрацию клеток доводили до 1 × 10⁶ КОЕ/мл, смешивали с каждым растительным комплексом в соотношении 1 : 10 и по отдельности каждую распределяли по стерильному предметному стеклу. В качестве контроля использовали инокулюм бактерий в питательном бульоне без добавления препарата. Далее образцы помещали в термостат при температуре +37 °С на 3 ч. После этого все стекла просматривали под микроскопом Axio Scope А1 (Zeiss; Германия) при увеличении в 400 раз. Снимки выполняли с использованием профессиональной стационарной цифровой фотокамеры AxioCam HRc Rev3 (Zeiss; Германия). Отмечали количество выросших бактериальных микроколоний в контрольных и экспериментальных пробах, просматривая несколько полей зрения. Снижение в экспериментальных образцах количества микроколоний более чем в два раза по сравнению с контролем свидетельствует о хорошем антибиопленочном свойстве растительной композиции в различных формах.

Статистический анализ данных выполняли в среде пакета MS Excel 2010 (Microsoft; США). Обработку полученных результатов производили по методу Стьюдента. Результаты считали статистически  значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование антибактериальной активности

Результаты антибактериальной активности представлены в табл. 1 и на рис. 1.

Описание результатов:

1. Эликсир, имеющий в составе 20% этилового спирта по массе и максимальную концентрацию активных компонентов: экстракт коры осины, альгинат натрия и хлорофиллин натрия-меди, показал наибольшую эффективность против бактериальной флоры.
2. Гель 1 с химическим антибактериальным агентом (хлоргексидином) в бактерицидной концентрации 0,12% и растительными активными компонентами (альгинат натрия, Д-пантенол, аллантоин, метил салицилат, ментол, экстракт пихты, хлорофиллин натрия-меди, эвгенол) показал сопоставимую высокую антибактериальную эффективность.
3. Гель 3 аналогичного состава с истекшим сроком годности 2 года показал среднюю антибактериальную активность.
4. Ополаскиватель и Гель 2 с корой осины и ДКВ не показали высокой цидной активности против пародонтопатогенной флоры.
5. Масляные растворы показали низкую цидную активность против пародонтопатогенной флоры.

Исследование антиадгезивной активности

Результаты антиадгезивной активности представлены в табл. 2.

Описание результатов:

1. Эликсир и гель с ДКВ (Гель 2) показали сопоставимую максимальную антиадгезивную эффективность.
2. Гель с ХГ и ополаскиватель показали средний эффект.
3. Масляные растворы показали низкую антиадгезивную активность.

Исследование антибиопленочных свойств растительных комплексов

Результаты антибиопленкообразующего действия различных форм выпуска представлены на рис. 2–рис. 4.

Описание результатов:

Все средства показали высокую антибиопленкообразующую активность. Максимальный результат получен в случае применения гелевых форм (Гель 1 и Гель 2).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Флора имеет тенденцию к изменению состава и качеств биопленки [1, 8, 20, 21, 23], поэтому необходимо оценивать физические показатели биопленки у конкретного пациента до начала лечения для более точной диагностики участия системных и общесоматических проблем, уровня гигиенической культуры пациента, персонифицированного подбора плана лечения, учета фенотипических показателей и достижения прогнозируемого положительного клинического результата, стабильного в долгосрочной перспективе при реабилитации пациентов с пародонтитом.

Антибактериальная активность растительных комплексов в отношении пародонтопатогенных бактерий проявляется в результате трех процессов: антиадгезивной активности, собственно антибактериального действия и антибиопленочных свойств [2, 8]. Поскольку любой инфекционный процесс бактериальной этиологии начинается с адгезии и колонизации микроорганизмов места внедрения, выявление антиадгезивных свойств у препаратов, используемых в стоматологической практике, позволяет предотвратить на ранних этапах адгезию и колонизацию бактерий. Тем самым ослабляется первая фаза инфекционного процесса и предотвращается образование бактериальной биопленки. У исследуемых растительных комплексов выявлена высокая антибиопленочная активность, что снижает вероятность развития очага хронической инфекции в области пародонта. В свою очередь наличие прямого антибактериального действия у растительных комплексов способствует снижению количества бактерий, при котором инициация инфекционного процесса становится маловероятной [6, 12].

Высокую антисептическую эффективность эликсира предположительно обеспечивает содержание этилового спирта (20% по массе) и высокая концентрация растительных антибактериальных компонентов.

Эффективность гелевой формы (Гель 1) вероятнее всего связана с пролонгированным высвобождением активных веществ за счет уникальной биоадгезивной пленкообразующей основы.

Сохранение антисептической эффективности гелевой формы аналогичного состава с истекшим сроком годности (Гель 3) с ее сравнительным снижением наиболее вероятно вызвано старением компонентов основы и ее быстрой деградацией, снижением кумулятивной активности сложных растительных комплексов, при сохранении антисептической активности хлоргексидина. Это также дает основание предполагать комплексное мультинаправленное комбинированное действие исследуемой композиции.

Высокая антиадгезивная эффективность вероятнее всего обусловлена альгинатом натрия, экстрактом коры осины и содержанием спирта в случае эликсира; за счет альгината натрия, ДКВ и экстракта коры осины в случае гелевой формы (Гель 2).

Сравнительная меньшая антисептическая активность водных и масляных форм связана с низкой концентрацией прямых антибактериальный агентов (экстракта коры осины в первую очередь) и малого времени экспозиции.

Форма выпуска существенно влияет на время экспозиции активных растительных комплексов: гели дают максимальный эффект за счет замедленного равномерного высвобождения действующих веществ, биоадгезии и образования пленки на десне и слизистой в полости рта [13–14]. Высокая концентрация активных веществ в водно-спиртовых растворах также вызывает стойкий и длительный антибактериальный эффект, но не обеспечивает длительной экспозиции на тканях пародонта. Гель с истекшим сроком годности теряет активность за счет старения основы из-за потери влаги. Целесообразно изготавливать гелевые формы небольшими сериями или в отдельных случаях экстемпорально. Основа гелей действует особенным образом: адгезируясь к высушенной поверхности слизистой или десны, длительно сохраняясь в локусе экспозиции, замедленно высвобождая активные компоненты, давая при этом возможность снижать дозировки в композиции; что требует дополнительных исследований.

Таким образом, трехэтапное антибактериальное действие растительных комплексов снижает риск развития пародонтитного процесса, даже в случае присутствия в этой области пародонтопатогенных бактерий. Использование в острый период в комплексной терапии после проведения кабинетной профессиональной гигиены растительных комплексов, особенно в виде гелевых форм выпуска, способствует быстрому восстановлению структуры и состояния тканей пародонта, нормализации трофики и питания, дыхания и обменных процессов в тканях. А применение после купирования острого процесса способствует удлинению периода ремиссии и существенно снижает риск повторных обострений, их течение и повторное повреждение тканей инфекционными агентами.

В острый период до 14–21 дня целесообразно применять комбинацию: Эликсир + Гель с хлоргексидином 0,12%, а после купирования острого процесса: Полоскание и Гель с корой осины и ДКВ [11, 13]. Полоскание и Гель с корой осины и ДКВ могут применяться для профилактики обострений у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом изза отсутствия химических компонентов, вызывающих резистентность бактерий при сохранении неспецифического антибактериального эффекта за счет изменения проницаемости клеточной стенки бактерий.

ВЫВОДЫ

У исследованных растительных комплексов в гелевой форме выявлена высокая антисептическая, антиадгезивная и антибиопленочная активность. Масляные формы выпуска целесообразно использовать в комплексной терапии заболеваний СОР (слизистой оболочки рта); эликсир и Гель с хлорофиллом и хлоргексидином 0,12% — в комплексной терапии пародонтита, Гель с корой осины и ДКВ и Ополаскиватель — для профилактики пародонтита и других поражений десны СОР. Необходимы дальнейшие исследования активности растительных комплексов в различных формах с титрованием концентраций у эликсира по сравнению с ополаскивателем, сравнением результатов частоты нанесения гелевых форм между собой и определением срока наступления резистентности в случае Геля с  химическим антисептиком. Важно продолжить работу по оценке биологических свойств пародонтопатогенных микроорганизмов in vitro, используя экспериментальные модели смешанных (мультивидовых) биопленок. Флора полости рта сильно изменилась за последние 20 лет, что обусловлено и спецификой регионов проживания. При проведении исследований рекомендовано сначала оценивать актуальный состав пародонтопатогенных бактерий в налете и на поверхности корня зуба, а также в пародонтальной жидкости.