Прорезывание зубов — это уникальный естественный процесс с многофакторным механизмом воспроизводимости, с помощью которого можно утверждать о развитии органов и тканей не только рта, но и всего организма [1]. Прорезывание представляет собой сложное биологическое событие, включающее динамические изменения на тканевом и клеточном уровнях [2]. Оно осуществляется анатомическими структурами, биологическими и молекулярными факторами, которые приводят к перемещению зуба в его окончательному функциональному положению во рту [3].

На этапе прорезывания зубы перемещаются в трех измерениях и постепенно увеличиваются в размерах в пределах альвеолярной части нижней челюсти до активного прорезывания. Во время формирования коронковой части зуб совершает незначительные круговые движения [4, 5].

Некоторые теории прорезывания зубов описаны уже несколько веков назад, многие из них подвергают пересмотру, дополняют или опровергают [6]. Наиболее известны и хорошо обоснованы следующие: корневая (Hunter, 1870), альвеолярная (L. J. Baume, 1890), пульпарная (Г. В. Ясвоин, 1929), перестройки костной ткани (J. Tandler, 1928; А. Я. Катц, 1940; B. Orban, 1953; J. Reichborn-Kjennerud, 1959; М. Я. Берри, 1968). Ряд авторов придерживаются теории, в которой соединительная ткань, охватывающая прорезывающийся нижний третий моляр со всех сторон, скорее всего является источником прорезывания [7]. По другим данным, корональные и базальные клетки эмали зуба и зубного фолликула могут посылать сигнал, который индуцирует дифференцировку относительно близких мезенхимальных клеток или клеток-предшественников, превращают их в клетки со специфическими функциями, то есть остеобласты и остеокласты [8].

Согласно еще одной гипотезе, сосудистое и тканевое давление может влиять на скорость прорезывания. В эксперименте на зубных альвеолах у крыс установлено, что после удаления интерстициальной жидкости происходит повышение давления, в конечном счете все заканчивается снижением скорости прорезывания [9].

Большую роль исследователи отводят дифференцировке тканей зачатка зуба, когда под действием силы во время прорезывания увеличивается объем и внутри него создается определенное давление (напряжение) [10].

Развивающиеся нижние третьи моляры должны проходить каскад минерализованных и неминерализованных соединительных тканей, при этом эмаль образует изолирующий барьер, который при благоприятных условиях защищает зуб от физических, химических, тепловых воздействий, в некоторых случаях неполноценность ее структуры может утяжелять течение стоматологических заболеваний. Есть мнение, что эмаль не содержит коллагена, хотя в литературе имеются единичные публикации, доказывающие его наличие в этой уникальной биологической ткани [11, 12].

На самом раннем этапе формирования зуба происходят сложные эпителиально-мезенхимальные молекулярные и перекрестные взаимоотношения внутри твердых тканей [13]. Недавние наблюдения позволяют оспорить общепринятые научные факты и предположить, что рост кристаллов эмали инициируют минерализованные коллагеновые волокна из дентина. Затем эти кристаллы проходят через эмалево-дентинную границу к мембране амелобластов и распространяются по всей поверхности эмали. Подобное строение позволяет создать соединительные комплексы, где секреторные амелобласты образуют полупроницаемый барьер для межклеточных перемещений минералов, ионов, свободно циркулирующих в матрице эмали. По указанным соединительным комплексам возможны межклеточные перемещения жидкостей, которые нейтрализуют рН в матрице эмали [14].

Наличие коллагеновых волокон в твердых тканях зубов представляет существенное научное и практическое значение для стоматологии. Установлено, что у человека амелогенины и энамелины взаимодействуют с членами семейства коллагенов во внутрикостную стадию прорезывания [13]. Коллагены являются продуктом одонтобластов и присутствуют в дентине, в то время как амелогенины являются продуктом амелобластов и содержатся в эмали. Было показано, что коллаген IV типа экспрессируется непосредственно в эмалево-дентинной границе, коллагены I и VII типов проходят из дентина через эмалево-дентинную границу в эмаль. Значение взаимодействий амелогенин–коллаген и энамелин– коллаген, или расширение коллагенов дентина во внутреннюю матрицу эмали поможет объяснить значение и необычные структурные и биохимические свойства эмалево-дентинной границы [15].

Благодаря развитию стоматологии, биохимии, нанотехнологий описаны новые виды белков, дентина, костей, которые обладают уникальными способностями воздействовать на структуру минералов твердых тканей. Результаты микроскопического исследования указывают на сложные взаимоотношения кристаллов апатита; особенно остро встают вопросы межмолекулярных и внутримолекулярных взаимодействий белковых матриц с неорганической фазой минерализованных тканей челюстно-лицевой области [16].

Известно, что неорганическая фаза эмали и дентина представлена кристаллами гидроксиапатита, колебания которых в средней инфракрасной области более стабильны [12].

В литературе описаны исследования белков зубного зачатка плода человека, зрелой эмали постоянных зубов. Подобные исследования затрагивают только некоторые частоты или ИК-спектры белков, а их интерпретацию можно найти в единичных работах. Более современные исследования показывают, что эмаль зубного зачатка плода не похожа на эмаль прорезавшегося зуба, при этом ее физические свойства и химический состав различны. В эмали зачатка зуба в тысячи раз меньше белка, чем в эмали постоянных зубов, а по плотности и содержанию белка она мало отличается от мягких тканей организма [17].

Установлено, что компоненты органического матрикса берут начало от эмалево-дентинной границы, где на всем протяжении частично переплетается с коллагеновыми фибриллами дентина. Выше эмалево-дентинной границы органический матрикс представлен слоем переплетающихся тонких волокон, образующих подобие неоднородной широкопетлистой сетки, вдоль всего эмалево-дентинного соединения, который отделяет эмаль от дентина. Наличие такого сложного строения позволяет многим исследователям утверждать о переплетении коллагеновых фибрилл дентина с органическим матриксом эмали [18]. Это в свою очередь приводит к появлению коллагена среди специфичных белков эмали амелогенинов и энамелинов, а дифракционную картину органического матрикса определяют диффузно размытые кольца. 

Другие исследования демонстрируют уменьшение с возрастом количества органического фосфата, входящего в состав белка эмали плода и зрелой эмали, что отражается уменьшением полос поглощения ИК-спектров. ИК-спектры белка эмали плода значительно отличаются от спектров коллагена и кератина, что позволило отнести основную массу белков эмали к белкам коллагенового либо кератинового типа [19].

При формировании эмали в ИК-спектрах уменьшается интенсивность белковых полос, лежащих в области поглощения карбоксильных групп, в результате связывания минеральных компонентов. Содержание ортофосфатных групп в процессе формирования структуры апатита возрастает в эмали зубных зачатков плода, тогда как в зрелой эмали их количество с возрастом почти не меняется. Интенсивность колебаний пирофосфатных групп возрастает в апатите эмали в процессе пре- и постнатального онтогенеза [20].

На основании изученной литературы мы считаем актуальным и востребованным описать новые представления о механизме прорезывания нижних третьих моляров, опираясь на биохимические и морфологические перестройки в них.

Цель исследования — изучить изменчивость и вариабельность органического матрикса и минерального компонента в твердых тканях нижних третьих моляров, находящихся на разных стадиях прорезывания, с применением микроскопических и биохимических методов.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Клиническое исследование

В исследовании приняли участие 67 женщин в возрастных группах 14–17, 18–21, 22–26, 27–31, 32–36 лет, которые находились на диспансерном наблюдении и лечении у врача-ортодонта и врача-стоматолога-хирурга в отделение стоматологии общей практики БУЗ Омской области «Городская клиническая стоматологическая поликлиника № 1», «Центр диагностики и лечения дисплазии соединительной ткани» ФГБОУ ВО «Омский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ (Омск, Российская Федерация). Всем участникам в 2021–2022 гг. проводили удаление зубов 38, 48 (по ортодонтическим показаниям или при затрудненном прорезывании). ИК-спектроскопию проводили на базе научно-исследовательской лаборатории биохимии ФГБОУ ВО «Омский государственный педагогический университет».

Критерии включения в группу исследования: женщины, у которых удаляли интактные зубы (38, 48) с подтвержденным диагнозом по МКБ 10: K05.22 (острый перикоронит), К05.32 (хронический перикоронит), К00.6 (нарушение прорезывания зубов), К01.0 (ретинированные зубы); возраст 14–36 лет; славянская внешность (европеоидная раса); наличие дисплазии соединительной ткани; в совокупности достигшие диагностического порога «+17» баллов (тяжелая степень). В группу сравнения вошли женщины с нормостеническим типом телосложения.

Критерии исключения: пациенты мужского пола и женщины в возрасте моложе 14 лет и старше 36 лет; наличие нижних третьих моляров с хроническими очагами инфекции в периапикальных тканях, пораженных кариесом; наличие хронических болезней в стадии субкомпенсации или декомпенсации; лица с алкогольной или наркотической зависимостью, ранее применявшие ульцерогенные лекарственные препараты (нестероидные противовоспалительные средства, глюкокортикостероиды и др.); гиперстеническое телосложение; азиатская или негроидная внешность; дисплазия соединительной ткани; в совокупности достигшие диагностического порога менее «17» баллов (легкая и средняя степень); диагнозы МКБ 10, не описанные в группе включения.

Стадию прорезывания нижних третьих моляров оценивали по компьютерным томограммам и систематизировали на четыре группы: зачаток, до уровня десны, до середины коронки второго моляра, полное прорезывание.

Диагностику дисплазии соединительной ткани и забор твердых тканей зубов для биохимических исследований проводили по методикам, описанным ранее [21, 22].

Метод забора эмали, эмалево-дентинного соединения, дентина для микроскопического исследования

На первом этапе зуб после экстракции фиксировали в столярной струбцине, с помощью алмазного диска производили сепарацию зуба в мезио-дистальном направлении, получали продольный срез. Подготовленный фрагмент зуба помещали в патрон из ПВХ-трубки срезом вниз, заливали двухкомпонентной эпоксидной смолой на 24 ч.

На втором этапе полученный препарат обрабатывали на шлифовально-полировальном станке «МР-1В GrinderPolisher» (MRC; Великобритания) шлифовальными кругами «dexter» (Leroy Merlin; Франция) зернистостью 800, 1500, 2000, 2500 grit. Окончательную полировку проводили с использованием полировального круга из войлока с пастой ГОИ для пластмасс. Протравливали поверхность препарата 37%-й ортофосфорной кислотой Н₃РО₄ в течение 20 с в зоне эмали, в течение 15 с в зоне дентина. Высушивали препарат с использованием салфетки из целлюлозы. Препарат укладывали на предметный стол растрового электронного микроскопа Jeol JCM – 5700 (JEOL Ltd.; Япония) для исследования. Применение описанного способа позволяет исследовать морфологию эмали, дентина, эмалево-дентинного соединения на продольном срезе в растровом электронном микроскопе.

Метод получения и предварительной обработки ИК-спектров

Образцы эмали, дентина и эмалево-дентинного соединения высушивали до постоянной массы при температуре 105 °С в течение 6 ч и определяли массовую долю влаги. Порошки исследовали в таблетках, спрессованных в смеси с бромистым калием (соотношение 1 : 100; диаметр — 3,5 мм). В качестве опорного спектра использовали спектр чистого бромистого калия, предварительного высушенного при температуре ~600 °С в течение 6 ч. ИК-спектры поглощения регистрировали на ИК-Фурье-спектрометре «ФТ-801» («СИМЕКС»; Россия) в диапазоне 500–4000 см^–1 (число сканов — 32, разрешение — 4 см^–1). Коррекцию базовой линии и нормализацию спектров проводили с использованием программного обеспечения ZaIR 3.5 («СИМЭКС»; Россия). На всех спектрах определяли положение и интенсивность полос поглощения (ПП).

Статистическая обработка данных

Статистический анализ полученных данных выполняли при помощи программ Statistica 10.0 (StatSoft; США) непараметрическим методом с использованием в зависимых группах критерия Уилкоксона, в независимых группах — U-критерия Манна–Уитни. Описание выборки проводили с помощью подсчета медианы (Ме) и интерквартильного размаха в виде 25-го и 75-го процентилей (LQ; UQ). Различия считали статистически значимыми при p ˂ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты наших исследований показали, что дентинные канальцы берут начало на внутренней поверхности дентина, пересекают его в направлении наружу, перпендикулярно тангенциальным волокнам основного вещества. Коллагеновые волокна, идущие в радиальном и тангенциальном направлениях, определяют топографическую анатомию и правильную ориентацию дентинных канальцев. Отмечено, что в молодом возрасте (14–17 лет, 18–21 лет) дентинные канальцы имеют небольшие размеры, в отличие от возрастных групп 22–26 лет, 27–31 лет, 32–36 лет. В возрастной группе 32–36 лет дентинные канальцы уменьшаются, что связано со снижением трофической функции и минерализации твердых тканей зубов, с облитерацией и появлением большого количества дентиклей, что негативно отражается на обменных процессах и может приводить к болезням твердых тканей. По мере движения нижнего третьего моляра к окклюзионной плоскости и полному их прорезыванию дентинные канальцы увеличиваются в размерах статистически значимо во всех возрастных группах (14–17 лет, 18–21 лет, 22–26 лет, 27–31 лет) (p < 0.05) (табл. 1; рис. 1А–Д).

Наши исследования продемонстрировали усиление минерализации внутреннего слоя дентинных канальцев на этапе прорезывания нижнего третьего моляра до середины коронки второго моляра в возрастных группах 21–26 лет, 27–31 лет, что не противоречит литературным данным о различной ширине дентинных канальцев [23]. Описанное кольцо минерализации дентинных канальцев в области пульпы уже и шире в области эмалево-дентинной границы (табл. 1; рис. 1А–Д). Отмечается утолщение дентинного слоя во всех сравниваемых возрастах, за исключением возрастной группы 32–36 лет, где его толщина остается неизменной по мере развития и перемещения нижнего третьего моляра до середины коронки второго моляра. Процесс образования нового дентина на всех этапах прорезывания идет равномерно, энергично, что отражается в статистическом анализе сравниваемых групп (p > 0,05) (табл. 1).

Показатель ширины эмалевых призм в различных отделах эмали изменяется с возрастом и по мере прорезывания нижних третьих моляров. Нами установлен значительный рост эмалевых призм в возрасте 27–31 лет, после 32 лет он не наблюдается (p > 0,05). Быстрый рост эмалевых призм в глубоком отделе эмали выявлен на следующих стадиях прорезывания: зачаток, до уровня десны во всех сравниваемых группах. Рост в ширину в поверхностном отделе эмали на ранних стадиях прорезывания нижних третьих моляров значительно отстает относительно глубокого отдела во всех возрастных группах (p > 0,05) (табл. 2; рис. 1Д–П).

Нами установлено, что в поверхностном отделе эмали рост эмалевых призм достоверно усиливается в возрастных группах 18–21 лет (p = 0,001), 22–26 лет (p = 0,002) на стадиях зачатка и при достижении уровня десны, в глубоком отделе в возрастной группе 22–26 лет на всех стадиях прорезывания (p < 0,05).

По содержанию воды в твердых тканях нижних третьих моляров в сравниваемых группах выявлены статистические различия, которые характеризуют обменные процессы и скорость их созревания по мере движения до полного прорезывания. Самое большое ее содержание в эмали в возрастах 18–21 лет, 22–26 лет на стадии нахождения нижнего третьего моляра на уровне с десной.  На остальных стадиях прорезывания статистически значимых изменений в эмали по содержанию воды не выявлено (p > 0,05) (табл. 3).

Количество воды в дентине изменяется с возрастом. Самое высокое ее содержание в дентине отмечено в возрастах 18–21 лет, 22–26 лет на всех стадиях прорезывания (p < 0,05). В описанных возрастных группах происходит значительное увеличение количества воды при полном прорезывании нижних третьих моляров. В остальных возрастных группах значимых различий не установлено, хотя видна тенденция к уменьшению ее количества в возрастной группе 32–36 лет (табл. 3).

В эмалево-дентинной границе по данному показателю получены аналогичные изменения, которые описаны в дентине, с положительной динамикой по увеличению в возрасте 22–26 лет на всех стадиях прорезывания (табл. 3).

На ИК-спектрах твердых тканей нижних третьих моляров выделено 19 полос поглощения: 3239 см^–1 (νsO-H); 2963 см^–1 (νasCH3); 2922 см^–1 (νasCH₂); 2855 см^–1 (νsCH2); 1769 см^–1 (νC = C); 1637 и 1618 см^–1 (νC = O); 1546 см^–1 (δN-H, νC-N); 1454 см^–1 (δasCH3, δCH2); 1418 см^–1 (νC-N, δN-H, δC-H); 1384 см^–1 (δCH3); 1342 см^–1 (CH2); 1249 и 1202 см^–1 (δN-H, νC-N); 1106 см^–1 (νsPO, νCC, νCO); 1050 см^–1 (PO₄); 1037 см^–1(νCC, νCO, νCH₂OH); 967 см^–1 (νPO₄); 876 см^–1 (δOC-O) [22].

Показано, что с возрастом качественный набор полос поглощения на ИК-спектрах твердых тканей нижних третьих моляров сохраняется, тогда как интенсивность отдельных полос поглощения существенно изменяется (рис. 2). Интенсивность полос поглощения метильных и метиленовых групп липидов и белков с возрастом уменьшается (2855, 2922 и 2963 см^–1), фосфатных групп увеличивается (1050 см^–1). Это указывает на большую степень минерализации твердых тканей в возрастных группах 27–31 лет, 32–36 лет. Выраженные изменения доминируют между возрастными группами в структуре эмалево-дентинного соединения (ЭДС) (рис. 2Б). С возрастом интенсивность полос поглощения коллагена в дентине уменьшается (1202, 1249 и 1342 см^–1) (рис. 2В), в эмали увеличивается (рис. 2А), ЭДС занимает промежуточное положение и сочетает снижение интенсивности полосы 1202 см^–1 с увеличением полосы 1342 см^–1 (рис. 2Б). Подобные результаты показывают важную роль ЭДС, которое является ключевым звеном между эмалью и дентином за счет обменной, амортизирующей, защитной, питательной функций.

Анализ результатов ИК-спектроскопии образцов эмали, дентина, эмалево-дентинного соединения в разных возрастных группах методом главных компонент показал, что для эмали и дентина разделение групп не происходит. Вертикальная ось частично отделяет возрастные группы 14–17 лет и 27–31 лет от остальных, однако такое разделение статистически незначимо (p = 0,5298 для эмали и p = 0,4157 для дентина) (рис. 3А, Б).

Противоположную картину можно наблюдать для ЭДС (рис. 3В, Г). Видно, что левее вертикальной оси расположены возрастные группы 14–17 лет и 27–31 лет, тогда как горизонтальная ось делит эти группы между собой (рис. 3В). В данном случае разделение групп статистически значимо (p = 0,0392). В разделение возрастных групп вносят максимальный вклад полосы поглощения фосфат-ионов 1050 см^–1 (r = 0,7843; p < 0,0001), метильных и метиленовых групп в структуре углеродного скелета липидов и белков 2963 см^–1 (r = 0,7268; p < 0,0001), 2855 см^–1 (r = 0,6967; p < 0,0001) и полосы поглощения коллагена 1202 см^–1 (r = 0,6592; p < 0,0001) и 1249 см^–1 (r = 0,4763; р < 0,0001) (рис. 3Г), что было отмечено нами ранее. Отрицательный коэффициент корреляции выявлен для полос поглощения 1037 см^–1 (r = –0,8105; p < 0,0001) и 1418 см^–1 (r = –0,6498; p < 0,0001).

По второй оси максимальный вклад отмечен для полосы поглощения 1454 см^–1 (r = 0,7371; p < 0,0001), которая соответствует колебаниям метильных и метиленовых групп в структуре белков и полосы поглощения коллагена 1249 см^–1 (r = –0,4117; p < 0,0001) (рис. 3Г).

На разных стадиях прорезывания нижних третьих моляров показаны различия в эмали, дентине, эмалево-дентинном соединении. В эмали на стадии зачатка значимых изменений не выявлено, биохимические процессы представляют собой единый процесс. По мере движения нижнего третьего моляра установлены выраженные изменения. Горизонтальная ось «0–0» отделяет группу с прорезыванием до середины второго моляра (выше оси) от групп с полным прорезыванием (ниже оси). Вертикальная ось «0–0» разделяет группы с полным прорезыванием и прорезыванием на стадии зачатка. В дентине и эмалево-дентинном соединении можно наблюдать более четкое разделение групп.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

При сравнении ИК-спектров в сравниваемых группах мы пришли к мнению, что структурная ориентация и организация коллагеновых волокон в дентине на ранних стадиях прорезывания определяют правильную упаковку эмалевых призм. Прочное сцепление эмали с дентином осуществляется за счет правильной организации эмалево-дентинного соединения через сложную систему переплетения коллагеновых волокон в ней [24]. Биохимические изменения в дентине могут приводить к серьезным нарушениям в созревании эмалевых призм, особенно на ранних стадиях.

Отмечено, что коллагены экспрессируются в эмалеводентинном соединении и дентине во всех возрастах. Значение таких взаимодействий, как амелогенин– коллаген и энамелин–коллаген, и расширение коллагенов дентина во внутреннюю матрицу глубокого слоя эмали позволяет объяснить структурные биохимические и морфофункциональные изменения эмали после прорезывания нижних третьих моляров [25, 26].

Нами установлено, что состоятельность соединительнотканного комплекса эмалево-дентинного соединения и дентина создает надежный полупроницаемый барьер для межклеточных перемещений минералов, ионов, которые свободно циркулируют в матрице эмали, что в итоге обеспечивает более быстрое и полноценное созревание нижних третьих моляров. Наши наблюдения дополняют данные зарубежных исследователей о росте кристаллов эмали, который индуцируется коллагеновыми волокнами из эмалево-дентинного соединения и дентина [27]. От биохимического и морфологического состояния ЭДС, дентина зависят однородность и целостность эмали. Наличие врожденных и приобретенных болезней или состояний может нарушать структуру коллагена дентина, что приводит к серьезным изменениям эмалеводентинного слоя и эмали [28, 29].

К ограничениям исследования можно отнести тот факт, что забор клинического материала произведен у жителей одного региона (Омская область) и у лиц женского пола, в качестве объекта использовали нижние третьи моляры, другие группы зубов не изучали, а также небольшой размер выборки пациентов в исследованных группах, что обусловливает необходимость продолжения исследований по данной проблеме.

ВЫВОДЫ

Результаты морфологического и биохимического исследования твердых тканей нижних третьих моляров подтверждают имеющиеся данные о том, что изменение их положения начинается еще с зачатка, когда выраженные изменения упаковки и ориентации коллагеновых фибрилл и волокон в эмалево-дентинной границе и дентине, их распространение в глубокие слои эмали влияют на первичную пространственную ориентацию и топографическое расположение описываемых зубов в нижней челюсти. Проведенные данные могут дать ответ на ключевой вопрос о том, что правильная ориентация коллагеновых волокон в дентине, эмалеводентинном соединении,  появление координированной работы дренажной сети между эмалью и дентином по внутрипризматическим и межпризматическим промежуткам и дентинным канальцам, которые совместно создают и усиливают давление в коронковой части зуба, являются пусковым механизмом движения и роста зачатка нижних третьих моляров. Подобная гипотеза является рабочей, нуждается в глубоком анализе и требует продолжения исследований.