Длинные некодирующие РНК (днРНК) — это молекулы длиной более 200 нуклеотидов, не имеющие открытых рамок считывания [1]. днРНК участвуют в различных физиологических и патологических процессах, таких как регуляция клеточного цикла, дифференцировка, апоптоз и воспаление [2]. Особое значение отводится роли днРНК в эволюции мозга млекопитающих и человека. В пользу этого говорит тот факт, что около 40% всех идентифицированных днРНК человека специфично экспрессируются в мозге [3]. В многочисленных исследованиях было продемонстрировано участие днРНК в развитии нервной системы, нейрональной пластичности, а также в патогенезе неврологических заболеваний [4]. Одной из таких днРНК, для которой убедительно показана связь с развитием патологических состояний нервной системы, является NEAT1 (от англ. nuclear enriched abundant transcript 1). Изменение уровня NEAT1 в мозге происходит при ряде нейродегенеративных заболеваний и психических расстройств, таких как боковой амиотрофический склероз (БАС), фронтотемпоральная деменция (ФТД), хорея Гентингтона (ХГ), болезнь Альцгеймера (БА), шизофрения [5]. Причем в большинстве случаев обнаружено повышение ее уровня в головном мозге пациентов с данными заболеваниями [6–8]. Остается неясным, какую роль играет такое повышение, протекторную или патогенетическую. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что NEAT1 является стресс-активируемым геном и повышает свою экспрессию в ответ на патологические воздействия стрессового характера на клеточном уровне [9, 10]. На основе гена NEAT1 образуются две изоформы РНК: короткая NEAT1_1 (3,7 т.п.о.) и длинная NEAT1_2 (23 т.п.о.), последовательность которых перекрывается на 5'-конце молекулы [5]. Накопление длинной изоформы NEAT1_2 в клетках нервной системы человека подтверждено только при развитии БАС [11, 12]. По-видимому, для других заболеваний нарушение функций NEAT1 связано с изменением уровня ее короткой изоформы (NEAT1_1) [13]. В нервной ткани мышей в норме длинная изоформа не обнаружена, тогда как короткая экспрессируется во всех отделах ЦНС [14].

В физиологических условиях эндоплазматический ретикулум (ЭПР) является центральным субклеточным компартментом контроля качества белков, в котором происходят их правильная укладка, созревание и деградация [15]. При нарушении этих процессов и накоплении несвернутых или неправильно свернутых белков развивается особый тип клеточного стресса – ЭПРстресс [16]. Это наиболее общее патологическое событие на клеточном уровне развивается в нервных клетках, которые находятся в зоне поражения при нейродегенерации [17]. В случае невозможности восстановления белкового гомеостаза адаптивные программы клетки смещаются в сторону индукции апоптотической сигнализации, что ведет к гибели необратимо поврежденных нейронов [18].

NEAT1 участвует в клетке в образовании специфичных рибонуклеопротеиновых комплексов [6, 11, 13]. В состав последних входят белки, такие как TDP-43 и FUS, патологическая агрегация которых приводит к развитию ЭПР-стресса и гибели нервных клеток. Агрегацию TDP-43 и FUS в нервной системе обнаруживают при БАС, ФТД, БА и других нейродегенеративных заболеваниях. Прямое взаимодействие NEAT1 с такими белками ставит вопрос о возможном влиянии этой РНК на развитие процесса патологической агрегации и клеточной гибели [12, 13].

В данной работе мы исследовали влияние повышенного уровня днРНК NEAT1_1 на выживаемость клеток в первичных культурах гиппокампа, полученных от трансгенных мышей, при ЭПР-стрессе, индуцированном ингибитором протеасом MG132.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Первичные культуры гиппокампа

Исследование выполняли на первичных нейронных культурах, полученных от трансгенных мышей NEAT1_1Tg, экспрессирующих в нервной системе короткую изоформу NEAT1_1 человека. Мыши данной линии были получены методом трансгенеза, как описано ранее [19], и несут в геноме трансген, кодирующий NEAT1_1 человека, под контролем паннейронального промотора Thy1 на генетическом фоне линии C57Bl/6J (в печати). Наличие трансгена у животных подтверждали ПЦР-анализом. Животных содержали в условиях искусственно регулируемого светового дня (12 ч светлого и 12 ч темного времени) со свободным доступом к воде и корму.

Первичные культуры нейронов получали из гиппокампа трансгенных мышей NEAT1_1Tg и контрольных мышей дикого типа (WT) на третий день после рождения (P3), как описано ранее [20]. Для получения культуры использовали гиппокампы, выделенные не менее чем от трех животных одного генотипа, каждый эксперимент независимо повторяли, как минимум, дважды. Проводили диссекцию гиппокампов, далее образцы инкубировали в растворе 0,1%-го трипсина в солевом растворе Хенкса (HBSS) с 10 мМ HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) и 1 мМ пирувата натрия в течение 40 мин. После этого осуществляли механическую диссоциацию в растворе среды Нейробазальная («ПанЭко»; Россия), содержащей 50 ед./мл пенициллина/стрептомицина, 0,2% бетамеркаптоэтанола, 500 мкМ L-глютамина, 0,36% глюкозы и 10% лошадиной сыворотки. Образцы центрифугировали 5 мин при 1500 об./мин. Осадок ресуспендировали в свежеприготовленной среде, производили подсчет клеток в камере Горяева с использованием красителя трипанового синего. В среду вносили добавку В27 (Thermo Fisher Scientific; США) или НейроМакс («ПанЭко»; Россия), для повышения выживаемости первичных нейронов в культуре. Затем клетки высевали на покровные стекла диаметром 12 мм, покрытые поли-L-лизином. На каждое стекло приходилось около 3 × 10⁴ клеток. На следующий день меняли среду на свежую без сыворотки. Последующую смену среды проводили через 3 дня, заменяя только половину объема на свежую. Культуры поддерживали в инкубаторе при 37 °C, 5% CO₂ и относительной влажности 95%. Анализ культур проводили через 7 дней после посева.

Для индукции стресса эндоплазматического ретикулума (ЭПР-стресса) клетки обрабатывали раствором ингибитора протеасом MG132 («Sigma-Aldrich»; США) в ДМСО («ПанЭко»; Россия) с конечной концентрацией в среде 200 мкМ или 10 мкМ.

Для визуализации тела нейронов и сети отростков для последующего Sholl-анализа проводили иммуноцитохимическую окраску на белок Tau, ассоциированный с микротрубочками (антитела SAB4300377; Sigma-Aldrich, США), для подтверждения нейронного фенотипа клетки параллельно окрашивали на маркер NeuN (антитела MAB377; Millipore, США). Получали микрофотографии с использованием микроскопа Carl Zeiss Axio Observer 3 (Германия), оснащенным камерой Axiocam 712 mono  (Carl Zeiss; Германия). Полуавтоматический Sholl-анализ проводили в программе ImageJ, как описано ранее [10]. Было проанализировано по 30 нейронов для каждого генотипа.

Иммуноцитохимическое окрашивание

Для характеристики клеточного состава первичных нейронных культур проводили иммуноцитохимическое окрашивание на маркеры основных типов клеток нервной ткани: NeuN — маркер дифференцированных нейронов (антитела MAB377; Millipore, США), GFAP — маркер астроцитов (антитела G9269; Sigma-Aldrich, США), Olig2 — маркер олигодендроцитов (антитела ab109186; Abcam, Великобритания) и Iba1 — маркер микроглиоцитов (антитела ab178846; Abcam, Великобритания). Для каждого маркера было проанализировано шесть стекол, полученных от двух независимых культур для каждого генотипа. Оценку апоптотической гибели клеток проводили с помощью окрашивания антителами к активированной форме каспазы 3, СС3 (антитела AB3623; Sigma-Aldrich, США). Клетки отмывали от среды 1× ФСБ (фосфатно-солевой буфер), фиксировали 4%-м параформальдегидом в течение 15 мин и проводили пятиминутную пермеабилизацию холодным метанолом. Блокирование неспецифичного связывания проводили в растворе 5%-й сыворотки козла в ФСБ-Твин 20 в течение 1 ч при комнатной температуре. Далее покровные стекла инкубировали с первичными антителами, в разведении 1 : 1000 в блокирующем растворе, в течение 1 ч при комнатной температуре. Промывали 1× ФСБ и проводили инкубацию с вторичными флуоресцентно-меченными антителами Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor™ 568 (A-11011; Thermo Fisher Scientific, США) и Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor™ 488 (A-11029; Thermo Fisher Scientific, США) в разведении 1 : 1000 в растворе ФСБ-Твин 20, в течение 90 мин при комнатной температуре. Ядра клеток окрашивали с помощью раствора DAPI (Sigma-Aldrich; США). Покровные стекла монтировали на предметные стекла, в каплю среды Immu-Mount (Thermo Fisher Scientific; США). Для анализа типов клеток и апоптоза проводили съемку препаратов на приборе Cytation 3 (BioTek; США), с программным обеспечением Gen5 3.08 (BioTek; США). Сканировали область размером не менее чем 3000 × 3000 мкм в мультиканальном флуоресцентном режиме. Отсканированную область сшивали в единое панорамное изображение и анализировали количество клеток, окрашенных на специфичный маркер. Результаты для каждого маркера нормализовали относительно общего числа клеток, которое оценивали путем подсчета ядер, окрашенных DAPI.

Анализ экспрессии генов

Оценку экспрессии генов, основных сигнальных путей ЭПР-стресса и апоптоза проводили методом количественной ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР) на приборе CFX96 (Bio-Rad; США). Клетки выращивали на шестилуночном планшете в течение 7 дней. Выделение тотальной РНК проводили с помощью реагента ExtractRNA («Евроген»; Россия), согласно протоколу производителя. Далее пробы РНК обрабатывали ДНКазой (Sigma-Aldrich; США), по протоколу производителя. Концентрацию очищенной РНК измеряли с помощью спектрофотометра Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, США). Далее проводили синтез комплементарной цепи (кДНК) с использованием набора «Обратная транскриптаза Magnus» («Евроген»; Россия) согласно протоколу производителя. Количественную ПЦР в реальном времени проводили на приборе CFX96

Touch (Bio-Rad; США) с использованием набора qPCRmixHS SYBR («Евроген»; Россия) согласно протоколу производителя. В качестве эндогенного контроля использовали ген бета-2 микроглобулина (B2m). Список использованных праймеров представлен в таблица.

Программа для кПЦР включала первичную денатурацию в течение 5 мин при 95 °C, затем 40 циклов: 20 с при 95 °C, 30 с при 60 °C, 30 с при 68 °C. Результаты анализировали с помощью программы Bio-Rad CFX Manager (Bio-Rad; США).

Статистический анализ данных

Статистическую обработку данных проводили с помощью программных пакетов Statistica 12.0 (StatSoft, Inc.; США) и GraphPad Prism 8 (GraphPad Software; США). Во всех случаях результаты представлены в виде среднего арифметического и стандартной ошибки среднего (x ± m) с указанием индивидуальных значений, где это целесообразно. Детали статистического анализа для каждой группы данных представлены в описании к рисункам. Различия полученных результатов считали статистически достоверными при уровне значимости p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Первичные нейронные культуры, экспрессирующие NEAT1_1, не отличаются по клеточному составу и морфологии нейронов от контрольных

В эксперименте были использованы первичные культуры клеток гиппокампа, полученные от трансгенных мышей NEAT1_1Tg и от животных дикого типа (WT) на третий день постнатального развития (P3). Выделенные клетки культивировали in vitro на протяжении 7 дней. Условия культивирования (использование сыворотки, питательной добавки B27 и др.) были подобраны таким образом, чтобы получить смешанную культуру, содержащую все основные типы клеток, характерные для нервной ткани. Характеристика клеточного состава культур с помощью окраски на маркеры основных типов клеток показала, что полученные первичные нейронные культуры содержали около 9 ± 1,3% нейронов, 61 ± 5,6% астроцитов, 28 ± 2,5% олигодендроцитов и 2 ± 0,5% микроглиоцитов (рис. 1А, Б). Различий между культурами клеток разного генотипа NEAT1_1Tg и WT по клеточному составу обнаружено не было.

Для морфологической характеристики нейронов и оценки влияния повышенной экспрессии NEAT1_1 на морфофункциональные характеристики, связанные с активностью и пластичностью этих клеток, был проведен Sholl-анализ, который позволяет оценить разветвленность сети нейритов. Значимых различий в разветвленности отростков у нейронов разного генотипа (NEAT1_1Tg и WT) выявлено не было, хотя отмечена тенденция к снижению числа отростков в проксимальной области сети у нейронов из трансгенных NEAT1_1Tg-культур (рис. 2А, Б). Таким образом экспрессия NEAT1_1 не оказывает выраженного влияния на пластичность нейронов.

В трансгенных NEAT1_1Tg-культурах выявлена более выраженная апоптотическая гибель при ЭПР-стрессе

Анализ апоптотической гибели клеток методом иммуноцитохимического окрашивания к активированной каспазе 3 (CC3) показал, что при обычных условиях в культурах выявляется небольшое количество (2–4%) CC3позитивных (CC3+) клеток, при этом сигнал в основном не колокализовался с маркером NeuN, что говорит о глиальной природе гибнущих клеток (рис. 3А–В).

Далее в культурах клеток индуцировали острый и умеренный ЭПР-стресс обработкой ингибитором протеасом MG132 в концентрации 200 мкМ и 10 мкМ соответственно. На седьмой день культивирования в среду вносили ингибитор протеасом MG132 на 4 ч, после чего воздействие вещества снимали путем смены среды. Далее оценивали уровень апоптоза в культуре через 4, 12 и 24 ч. При этом анализировали общую клеточную гибель, т. е. подсчитывали все CC3⁺-клетки без учета их принадлежности к нейронам или глии.

При остром ЭПР-стрессе, вызванном высокой концентрацией MG132 (200 мкМ) в WT-культурах, выраженная гибель клеток детектировалась уже через 4 ч после обработки. Число гибнущих в результате апоптоза клеток было еще больше через 12 ч и сохранялось таким же высоким через 24 ч. При этом в культурах, полученных от трансгенных животных, обнаруживалось значимо большее число гибнущих при апоптозе клеток через 4 ч после обработки, тогда как в последующие временные точки этот показатель был сравним с WT-культурами, обработанными MG132 (рис. 3А).

Для моделирования умеренного транзиентного ЭПРстресса использовали низкую концентрацию MG132 (10 мкМ). В таких условиях общая апоптотическая гибель также увеличивалась через 4 ч, однако к 12 ч количество CC3⁺-клеток снижалось, а к 24 ч соответствовало значениям для контрольных культур без обработки MG132, что свидетельствует о восстановлении клеточных культур после стресса. В NEAT1_1Tg-культурах в сравнении с WT после стресса количество апоптотических клеток было больше через 4 ч после обработки, и такая же тенденция сохранялась на 12 ч, тогда как на 24 ч разница нивелировалась (рис. 3Б).

Для оценки того как ЭПР-стресс влияет на выживаемость нейронов, проводили совместную окраску на CC3 и маркер дифференцированных нейронов NeuN, после чего подсчитывали клетки, экспрессирующие оба маркера. В культурах с высокой концентрацией MG132 пик гибели нейронов приходился на 4 ч (рис. 4А), тогда как при низкой концентрации MG132 — на 12 ч (рис. 4Б).

При этом в каждом случае гибель нейронов была значимо выше в культурах, экспрессирующих трансген NEAT1_1Tg.

В трансгенных NEAT1_1Tg-культурах изменен ответ на ЭПР-стресс

Для определения возможного механизма повышенной гибели клеток, и в частности нейронов, в трансгенных нейронных культурах, экспрессирующих NEAT1_1 человека, был проведен анализ экспрессии генов, участников сигнальных путей реализации клеточного ответа на ЭПР-стресс, а также генов апоптоза. Показано, что через 4 ч после обработки клеточных культур 10 мкМ MG132 происходит повышение экспрессии геновмаркеров ЭПР-стресса: транскрипционного фактора Atf4, проапоптотического гена Chop (Ddit3), шаперона Hspa5 (Grp78 или BiP) (рис. 5А–В). Аналогичные изменения экспрессии данных генов происходили в трансгенных культурах после обработки MG132. В то же время уровни экспрессии Atf4 и Ddit3 не достигали уровня, наблюдаемого в WT-культурах после индукции ЭПР-стресса. Уровень экспрессии гена, кодирующего белок ЭПР Emc4, который обладает протекторными свойствами при стрессе [21], был значимо снижен в культурах NEAT1_1Tg как в нормальных условиях, так и при ЭПР-стрессе (рис. 5Г).

Уровень мРНК гена каспазы 3 (Casp3) не различался между трансгенными и контрольными культурами и не изменялся в ответ на стресс (рис. 5Д). Анализ экспрессии известных генов-ингибиторов (Bcl2l1, Bcl2l2, Mcl1) апоптоза (рис. 5Е–З) показал, что индукция умеренного ЭПР-стресса в WT-культурах приводит к повышению уровня мРНК генов Bcl2l2 и Mcl1, тогда как экспрессия Bcl2l1 остается неизменной. В трансгенных NEAT1_1Tgкультурах, в отличие от этого, при стрессе не наблюдалось значимой активации Bcl2l2 и Mcl1, хотя для последнего имел место тренд к повышению.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Для NEAT1 убедительно показано участие в различных патологических процессах, связанных с нейродегенерацией, включая нейровоспаление и апоптоз [5]. Промотор гена NEAT1 имеет сайт связывания с белком p53, который способен повышать уровень NEAT1 [22]. Большое количество экспериментальных данных указывает на протекторную роль NEAT1. В экспериментах на мышах с использованием аденовирусного вектора для доставки РНК было показано, что Neat1_1 обладает антиапоптотическим эффектом на модели травмы мозга, а также на клеточной культуре нейронов гиппокампов мышей HT-22 в условиях гипоксии и недостатка глюкозы [23]. Нокдаун NEAT1 в клетках нейробластомы человека SH-SY5Y повышал апоптотическую гибель при имитации вирусной инфекции с помощью обработки двухцепочечной РНК [12]. В то же время сверхэкспрессия NEAT1 способна стимулировать ферроптоз в клетках гепатокарциномы HepG2 [24], а ингибирование NEAT1 в токсических (МФП⁺) клеточных и животных моделях болезни Паркинсона приводило к снижению гибели клеток и проапоптотических маркеров [25, 26]. Таким образом существуют противоречивые данные о влиянии NEAT1 на гибель клеток. Возможно, что конкретный про- или антиапоптотический эффект NEAT1 зависит от типа повреждающего воздействия, которое оказывается на них. Понимание механизма действия NEAT1 осложнено еще и тем, что, в отличие от нервной ткани in vivo и первичных нейронов, в большинстве культур клеток дополнительно к короткой изоформе экспрессируется еще и длинная изоформа (NEAT1_2), которая служит основой для сборки параспеклов [5, 12]. Образование параспеклов, в свою очередь, может быть стимулировано клеточным стрессом разного типа, в том числе при ингибировании протеасом [27]. Поэтому сложно выделить независимые функции короткой и длинной изоформ NEAT1 при реализации клеточного ответа на стресс.

Нами показано, что эктопная экспрессия трансгена, кодирующего короткую изоформу NEAT1_1 человека в нервной системе мышей, не влияет на клеточный состав (рис. 1) и морфологию первичных нейронных культур (рис. 2), полученных из гиппокампов. Индукция ЭПР-стресса с помощью ингибитора протеасом MG132 приводила к апоптотической гибели клеток первичной культуры (рис. 3), и выраженность такой гибели зависела от силы стресса (концентрации MG132). При этом в культурах, экспрессирующих трансген NEAT1_1, количество апоптотических клеток было больше в сравнении с клетками WT в условиях стресса. Как ранее было показано на нокаутных по гену Neat1 эмбриональных фибробластах мыши, отсутствие Neat1 повышает гибель этих клеток в ответ на обработку MG132 [27]. Возможно, что для выживания клеток при стрессе важен определенный стабильный уровень Neat1 либо ее влияние на гибель зависит от типа клеток. Первичная культура, которую мы использовали в данном исследовании, была смешанной и содержала как нейроны, так и глиальные клетки. Это позволяет учитывать в эксперименте выживаемость нейронов в условиях взаимного влияния разных популяций клеток нейронного происхождения. Для того чтобы определить специфичное влияние повышения уровня NEAT1_1 на выживаемость нейронов, мы оценили количество клеток, экспрессирующих одновременно маркер зрелых нейронов NeuN и активированную каспазу 3 (CC3). Стресс приводил к более выраженной гибели нейронов в трансгенных культурах (NEAT1_1Tg) по сравнению с культурами дикого типа (WT) (рис. 4). Таким образом, экспрессия NEAT1_1 усиливает апоптоз первичных нейронов при ЭПР-стрессе. Обращает на себя внимание тенденция к увеличению количества апоптотических нейронов в трансгенных культурах без обработки в сравнении с контрольными культурами, которая проявляется на всех временных точках. Хотя данные различия и не достигали статистической значимости можно предположить, что существует некоторая предрасположенность трансгенных нейронов к запуску апоптоза в нормальных условиях. Этот факт требует дальнейшего исследования.

Реакция ЭПР-стресса в клетке реализуется через три основные сигнальные пути, в основе которых лежат киназы, играющие роль сенсоров стресса: PERK, ATF6 и IRE1 [16]. При их активации в клетке тормозится общий синтез белка и запускаются защитные механизмы, направленные прежде всего на адаптацию к стрессу и восстановление белкового гомеостаза. Однако при сильном стрессе или его длительном сохранении баланс сдвигается в сторону активации проапоптотических сигнальных путей, что ведет к гибели клетки [28]. Мы показали, что ЭПР-стресс вызывает активацию PERK-пути, о чем говорит повышение уровня мРНК гена Atf4, однако эта активация менее выражена в NEAT1_1Tg-культурах (рис. 5). В соответствии с этим в NEAT1_1Tg-культурах также снижена активация проапоптотического гена Ddit3 (Chop), который относится к тому же сигнальному пути PERK/ATF4/CHOP и является активатором перехода клетки к апоптозу при ЭПРстрессе [29]. В обеих культурах при стрессе повышается экспрессия гена шаперона Hspa5 (BiP), что также указывает на развертывание ЭПР-стресса. Быстрый ответ NEAT1_1Tg-клеток на стресс и запуск апоптоза через активацию каспазы 3 мог бы быть объяснен изначальными различиями в количестве неактивной формы каспазы 3 в клетках. Анализ экспрессии каспазы 3 (Casp3) показал, что по крайней мере на начальном этапе развития стресса, через 4 ч после обработки клеток MG132, ее уровень одинаков во всех четырех группах. Учитывая повышение числа клеток, окрашивающихся антителами к активированной форме каспазы 3 уже через 4 ч после запуска стресса, можно сделать вывод о том, что различия в гибели между NEAT1_1Tg- и WT-клетками обусловлены другими регулирующими факторами, в частности расщеплением прокаспазы 3 с образованием ее активированной формы. Далее мы проанализировали экспрессию ряда генов ингибиторов апоптоза: Bcl2l1, Bcl2l2, Mcl1 [30]. Экспрессия Bcl2l1 не изменялась в ответ на ЭПР-стресс. Для генов Bcl2l2 и Mcl1 выявлено повышение их уровня в WT-культурах, тогда как в культурах NEAT1_1Tg такая активация практически отсутствовала для Bcl2l2 и была значительно менее выражена для Mcl1. Мы также обнаружили, что в NEAT1_1Tg-культурах снижен уровень мРНК гена Emc4, который относится к семейству консервативных трансмембранных белков, необходимых для укладки белков в ЭПР. Недостаток белков Emc сам по себе способен приводить к развитию ЭПР-стресса [31]. Таким образом, повышенный уровень NEAT1_1 в нейронных культурах при развитии ЭПР-стресса приводит к снижению регуляторных антиапоптотических сигналов, что усиливает клеточную гибель, в том числе и нейронов.

ВЫВОДЫ

Дополнительная экспрессия трансгенной длинной некодирующей РНК NEAT1_1 человека в условиях развития ЭПР-стресса способствует апоптотической гибели нервных клеток в первичных культурах гиппокампов. Повышение уровня данной РНК в нервной системе пациентов с нейродегенеративными заболеваниями (БАС, ФТД, ХГ), при которых происходят белковая агрегация и развитие ЭПР-стресса, может быть рассмотрено как патогенетический фактор.