Мночисленными исследованиями доказана роль плацентарной дисфункции в основе неблагоприятных исходов беременности, среди которых преэклампсия (ПЭ) и задержка роста плода (ЗРП). Молекулярная составляющая данных синдромов представлена ключевыми процессами, обьединенными стрессом — гипоксическим, окислительным/нитратным, митохондриальным и эндоплазматического ретикуллума [1–4], который возникает в результате аномальной эндоваскулярной инвазии спиральных артерий трофобластом. Вследствие этого в кровоток матери выделяются различные факторы, нарушающие ангиогенный баланс [5]. Происходящие при этом патологические изменения приводят к более высокому риску метаболических, сердечно-сосудистых и нефрологических заболеваний у женщин и их плодов в отдаленном периоде [6, 7].

В целом, ПЭ определяют как мультисистемное заболевание, с впервые возникшей артериальной гипертензией, сопровождающейся значительной протеинурией (или без нее) после 20 недель беременности [8, 9]. За прошедшие три десятилетия это определение было расширено по времени появления симптомов на ранних или поздних сроках беременности, с родоразрешением до или после 34 недель, а также различных фенотипов, обусловленных неблагоприятным воздействием на плод (ПЭ в сочетании или без ЗРП) [8]. Следует отметить дискуссионные споры, возникающие в последнее время, согласно которым сердечно-сосудистая система матери является этиологической первопричиной ПЭ [5, 10]. Тем не менее, связующим механизмом между плацентарной дисфункцией и сердечно-сосудистой дезадаптацией матери служит ангиогенно-антиангиогенный дисбаланс [10]. При физиологической беременности уровни ангиогенного плацентарного фактора роста (PLGF) и антиангиогенного фактора sFlt-1 (растворимая fms-подобная тирозинкиназа1) сбалансированы, но в условиях гипоксии и окислительного стресса происходит увеличение секреции sFlt-1 цитотрофобластом, что приводит к нарушению ангиогенеза. Предполагается, что есть различные пути, модулирующие экспрессию PLGF [11]. Один из них опосредован транскрипционным фактором GCM-1, играющим критическую роль в поддержании баланса между пролиферацией и дифференцировкой синцитиотрофобласта в I триместре беременности [12] и его вышестоящей мишенью DREAM [13]. Важно подчеркнуть, что модуляция активности последних осуществляется на посттрансляционном уровне, в том числе с помощью сумоилирования [14]. Интересно, что данная модификация также является ключевым игроком в управлении клеточными реакциями на тепловой шок, воспаление и различные виды стресса (окислительный, гипоксический, митохондриальный), лежащего в основе плацентарной дисфункции [15–18].

Сумоилирование — динамичный обратимый процесс, осуществляемый белками SUMO (от англ. small ubiquitin-like modifier), имеющими четыре изоформы, а их конъюгацию (образование изопептидной связи между SUMO и целевым белком) осуществляет фермент UBC9 [19]. Сумоилирование привлекает все больше внимания в контексте регуляции экспрессии молекул, опосредующих функцию плаценты и ангиогенез. Однако количество данных по изучению сумоилирования при плацентарных заболеваниях ограничено. Так, опубликованы результаты исследования о значимом повышении уровня SUMO 1 и SUMO 2/3 в плаценте при тяжелой ранней ПЭ [20]. А эволюционный подход WGCNA идентифицировал модули коэкспрессии генов, играющих решающую роль в патогенезе ПЭ, среди которых SUMO 1 и гетерогенный ядерный белок hnRNP, участвующий в связывании с микроРНК (мкРНК), в качестве кандидатных генов положительного отбора [21].

Скоординированный интерфейс между фетоплацентарной и материнской системой представляет собой сложный многомерный массив тканей, резидентных и циркулирующих факторов, охватывающий развивающийся плод, плаценту, децидуа и динамичную сердечно-сосудистую систему матери [1]. Он осуществляется посредством внеклеточных везикул (экзосомы, микровезикулы, апоптотические пузырьки), которые секретируются различными типами клеток, несут определенный груз (белки, липиды, транскрипты мРНК), а также имеют способность модулировать функцию клетокмишеней и обладают терапевтическим потенциалом [22, 23]. В частности, экзосомы избирательно упакованы сигнальными молекулами, такими как мкРНК и белки. Их секреция синцитиотрофобластом увеличивается при плацентарной дисфункции [24–26]. И что наиболее примечательно, избирательность и загрузка мкРНК в экзосомы осуществляются посредством сумоилирования гетерогенного ядерного белка hnRNPA2/B1 [27].

Прогресс в понимании молекулярных процессов, обьединяющих плацентарную дисфункцию и сердечнососудистую систему матери, указывает на то, что нарушения ангиогенно-антиангиогенного баланса могут являться целью для поиска экзосомных прогностических маркеров. В наших предыдущих исследованиях было продемонстрировано наличие регуляторного механизма по оси miR-652-3р / SUMO 2/3/4 / UBC9 / GCM-1 / PlGF в ткани плаценты беременных с ранней ПЭ [28] и изменение экспрессии SUMO 1–4 и UBC9 в экзосомах беременных с ранней ПЭ на момент родов [29]. В продолжение данных исследований мы сфокусировали свое внимание на оценке экспрессии экзосомных белков SUMO 1–4, UBC9, а также hnRNPA2/B1 в качестве предикторов плацентарной дисфункции на ранних гестационных сроках (11–14 недель) до проявления клинических признаков данной патологии.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования и когорты пациентов

В данное исследование включены беременные женщины, которые находились под наблюдением в ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В. И. Кулакова» Минздрава Российской Федерации. Общая выборка пациенток репродуктивного возраста составила 66 беременных, разделенных на две когорты (рис. 1). Критерии включения: одноплодная беременность; возраст пациенток 25–40 лет; родоразрешение естественным путем и с помощью операции кесарево сечение. Критерии исключения:  в обе когорты не включали беременных с многоплодной беременностью, возникшей в результате вспомогательных репродуктивных технологий, отягощенным соматическим анамнезом и наличием генетических патологий у матери и плода. Когорта I включала 39 беременных и была разделена на группы: беременные, у которых в последующем манифестировала ранняя ПЭ (11 беременных) и поздняя ПЭ (10 беременных); беременные с высоким риском развития ПЭ по данным комбинированного пренатального скрининга I триместра и благоприятным исходом беременности (9 беременных); беременные с физиологическим течением беременности (9 беременных). Экспрессию белков SUMO, UBC9 и hnRNPA2/B1 оценивали в экзосомах беременных на сроке 11–14 недель гестации. В когорту II включили 27 беременных с ранней ПЭ (7 беременных), поздней ПЭ (7 беременных) и контрольную группу соответствующего срока (7 и 6 беременных соответственно) для оценки экспрессии белков в образцах плацент. Клинические характеристики беременных представлены в табл. 1 и табл. 2. Выделение экзосом из сыворотки крови беременных

Образцы цельной крови брали у беременных на сроке 11–14 недель беременности (когорта I). Предварительно их центрифугировали в течение 20 мин (+4 °С, 300 g). Затем верхнюю фазу аккуратно переносили в чистую пробирку с коническим дном и повторно центрифугировали в течение 10 мин (+4 °С, 16 000 g) для удаления клеточного дебриса. Из приготовленных образцов в количестве 600 мкл использовали для очистки экзосом с помощью miRCURY Exosome Serum/Plasma Kit (кат. № 76603; Qiagen, Германия) в соответствии с инструкцией производителя и последующего проведения вестерн-блоттинга.

Вестерн-блоттинг экзосомных и тканевых белков

Для оценки экспрессии белков использовали плацентарную ткань (поперечный срез материнской и плодной части плаценты толщиной не более 5 мм, полученный сразу после родов) беременных (когорта II). Порошкообразные образцы тканей, предварительно измельченные в жидком азоте, гомогенизировали в буферной системе для лизиса RIPA (sc-24948; Santa Cruz Biotechnology, США). Разделение белков (20 мкг на дорожку геля) проводили в буфере Трис/Трицин/SDS (12,5%). Перенос экзосомных и тканевых белков на нитроцеллюлозную мембрану (0,45 мкм, кат. № 1620115; Bio-Rad, США) осуществляли с помощью Trans-Blot SD™ (кат. № 170-3957; Bio-Rad, США) в 10 мМ CAPS + 10% С2Н5ОН (pH = 11). Мембраны блокировали 5%-м раствором NFDM/TBST в течение 2 ч при комнатной температуре. Инкубацию с первичными антителами SUMO 1 (1:500, sc-5308; Santa Cruz Biotechnology, США), SUMO 2/3/4 (1:500, sc-393144; Santa Cruz Biotechnology, США), UBC9 (1:500, sc-271057;

Santa Cruz Biotechnology, США), hnRNPA2/B1 (1:500, sc374053; Santa Cruz Biotechnology, США) и Actin (1:100, sc-376421; Santa Cruz Biotechnology, США) проводили в течение 2 ч при комнатной температуре. Со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2031; Santa Cruz Biotechnology, США), инкубировали в 1%-м NFDM/TBST в течение 1 ч при комнатной температуре. В качестве реагента для обнаружения использовали SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Kit (кат. № 34096; Thermo Scientific™, США). Денситометрический анализ проводили с использованием программного обеспечения Bio-Rad ImageLab 6.0 (Bio-Rad; США). Экспрессию тканевых белков SUMO 1–4, UBC9 и hnRNP A2/B1 нормировали по отношению к актину, а уровень SUMO 1–4, UBC9 и hnRNP A2/B1 в экзосомах нормировали на концентрацию общего белка.

Оценка биохимических показателей пренатального скрининга в сыворотке крови беременных женщин

Концентрацию плацентарных факторов (sFlt-1, PLGF) и гормонов (РАРР-А, b-HCG) в сыворотке крови у беременных на сроках 11–14 недель гестации определяли электрохемилюминесцентным методом на автоматическом иммунохимическом анализаторе Cobas е411 (Roche Diagnostics GmbH; Германия) с использованием коммерческих наборов данного производителя.

Статический анализ данных

Оценку статистической значимости между клиническими показателями и экспрессией белка в исследуемых группах проводили с помощью теста Уилкоксона–Манна–Уитни с использованием скриптов, написанных на языке R (https://www.R-project.org). Для оценки связи экспрессии белка с клиническими показателями беременных женщин использовали метод непараметрической ранговой корреляции Спирмена. Модели логистической регрессии экспрессии белков были созданы для проверки возможности их использования в качестве биомаркеров. Эффективность созданных моделей оценивали с помощью ROC-анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценка экспрессии SUMO 1–4, UBC9 и hnRNPA2/B1 в экзосомах на сроках 11–14 недель беременности

Экспрессия SUMO 1–4, UBC9 и hnRNPA2/B1 в экзосомах, выделенных из плазмы крови беременных на сроках 11–14 недель гестации, с физиологической беременностью, манифестировавшей впоследствии ранней и поздней ПЭ, а также беременных с высоким риском развития ПЭ по данным комбинированного пренатального скрининга, была оценена методом вестерн-блоттинга. Детектировано несколько конъюгированных форм указанных белков, различающихся по молекулярным массам, при этом свободных форм в экзосомах не обнаружено (рис. 2A–Г).  

Сравнительный анализ показал, что в экзосомах беременных c ранней ПЭ экспрессия конъюгированной формы SUMO 1 (~50–52 кДа) значимо снижена (p = 0,03), а SUMO 2/3/4 (~55–58 кДа) повышена относительно физиологической беременности (p = 0,03). Экспрессия примерных по молекулярному весу конъюгированных UBC9 (~54–63 кДа) и hnRNPA2/B1 (~51–55 кДа) также была повышена, но без статистически значимых отличий (p = 0,07 и p = 0,3 соответственно). Предположительно, указанные формы являются конъюгатом SUMO 1 + UBC9, поскольку молекулярный вес их свободных форм составляет ~12 кДа и ~18 кДа соответственно. А при присоединении hnRNPA2/B1 (свободная форма ~36/38 кДа) как мишени SUMO 1 их суммарный молекулярный вес может составлять ~50–56 кДа. 

При поздней ПЭ также наблюдается значимое снижение экспрессии конъюгированной формы SUMO 1 (~50–52 кДа; p = 0,03), при этом экспрессия конъюгированных форм SUMO 2/3/4 (~55–58 кДа; p = 0,04), UBC9 (~54–63 кДа; p < 0,0001) и hnRNPA2/B1 (~51–55 кДа; p < 0,0001) значимо повышена относительно физиологической беременности (рис. 3A–Г).

Интересно, что при анализе экспрессии исследуемых белков в группе беременных с высоким риском развития ПЭ также выявлено значимое снижение экспрессии конъюгированного SUMO 1 (~50–52 кДа; p = 0,007) и повышение экспрессии конъюгированных UBC9 (~54–63 кДа), hnRNPA2/B1 (~51–55 кДа) относительно физиологической беременности (p = 0,01 и p = 0,001 соответственно).

Оценка экспрессии SUMO 1–4, UBC9 и hnRNPA2/B1 в плаценте при ранней и поздней ПЭ

В связи со значимыми измененими экспрессии конъюгированных форм SUMO 1–4, UBC9 и hnRNPA2/ B1 в экзосомах беременных, секретируемых синцитиотрофобластом на сроках 11–14 недель гестации, была оценена их экспрессия в плаценте у беременных с ранней и поздней ПЭ. Методом вестерн-блоттинга идентифицированы различающиеся по молекулярным массам конъюгированные фрагменты указанных белков, соответствующие выявленным таковым в экзосомах. Сравнительный анализ позволил выявить в плаценте значимое снижение экспрессии конъюгированных форм SUMO 1 (~50–55 кДа, p = 0,04; p = 0,04 соответственно), SUMO 2/3/4 (~55–59 кДа; p = 0,008, p = 0,05 соответственно) и hnRNPA2/B1 (~54 кДа; p = 0,01, p = 0,009 соответственно) при ранней и поздней ПЭ, которые примерно соответствуют молекулярным весам фрагментов, детектированных в экзосомах. При этом экспрессия конъюгированного UBC9 (~53–55 кДа; p = 0,04) значимо снижена только при поздней ПЭ относительно группы сравнения соответствующего срока гестации (рис. 4A–Г).

Оценка взаимосвязи экспрессии экзосомных SUMO 1–4, UBC9 и hnRNPA2/B1 с клиническими показателями комбинированного пренатального скрининга I триместра в группах беременных. Прогностическая значимость

Учитывая значимое изменение экспрессии исследуемых белков в экзосомах, мы оценили взаимосвязь данных изменений с показателями комбинированного пренатального скрининга I триместра в группах беременных с манифестацией ранней и поздней форм ПЭ с использованием метода непараметрической ранговой корреляции Спирмена (табл. 3).

В сыворотке крови беременных с ранней ПЭ уровни экзосомных SUMO 1 (r = 0,59; p = 0,01), SUMO 2/3/4 (r = 0,54; p = 0,02) и hnRNPA2/B1 (r = 0,75; p = 0,0001) значимо коррелировали с пульсационным индексом маточной артерии, а уровень UBC9 — со средним артериальным давлением (r = 0,53; p = 0,03). При этом наблюдали высокую обратную корреляцию уровня SUMO 2/3/4 (r = –0,59; p = 0,01) и UBC9 (r = –0,88; p = 0,0001) с концентрацией PlGF. Интересно, что у беременных с поздней ПЭ была установлена взаимосвязь с биохимическими показателями комбинированного скрининга: концентрации b-hCG с уровнем экзосомных UBC9 (r = –0,48; p = 0,03) и hnRNPA2/B1 (r = –0,48; p = 0,03), а также концентрации РАРР-А с уровнем SUMO 2/3/4 (r = –0,60; p = 0,006).

С целью оценки возможности использования экзосомных SUMO 1–4, UBC9 и hnRNPA2/B1 в качестве потенциальных предикторов развития ПЭ на ранних сроках беременности были разработаны модели логистической регрессии (рис. 5A–Г; табл. 4). ROC-кривые для логистических моделей представлены различными комбинациями, среди которых были выбраны значимые (формулы для них представлены в табл. 4). Особенно важно, что выбранные модели позволяют также дифференцировать беременных с высоким риском развития ПЭ по данным комбинированного пренатального скрининга I триместра от беременных с ПЭ и беременных с физиологически протекающей беременностью.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В основе развития успешной беременности лежит механизм коммуникации между фетоплацентарным и материнским компартментами, осуществляемый посредством высвобождения биоактивных молекул и внеклеточных везикул, которые отражают патофизиологическое состояние клеток-доноров и могут модулировать функции клеток-мишеней [30]. Известно, что экзосомы плацентарного происхождения опосредуют адаптацию сосудов матери к беременности, а их концентрация в плазме увеличивается по мере прогрессирования беременности и коррелирует с кровотоком в маточных артериях [31]. Такая функциональная уникальность позволяет их рассматривать в качестве динамичных биомаркеров, осуществляющих мониторинг плацентарной дисфункции в режиме «реального времени» [32].

Интересным аспектом, обращающим на себя внимание, является экзосомный контент, который обусловливает биоактивность экзосом, а его загрузка находится под контролем одной из посттрансляционных модификаций — сумоилирования [27]. Обратимая конъюгация небольшого пептида SUMO с белками-мишенями имеет решающее значение для функции клеток и различных клеточных процессов, включая транскрипцию, репарацию ДНК, регуляцию клеточного цикла, ремоделирование хроматина, транспорт нуклеоцитоплазмы, апоптоз [33]. Экспрессия изоформ SUMO 2 и SUMO 3, идентичных друг другу на 97%, а SUMO 1 на 46%, обнаружена во всех эукариотических клетках [19, 34]. Недавно продемонстрировано, что в плаценте экспрессируется еще одна изоформа — SUMO 4 [35]. При этом нарушения гомеостаза сумоилирования связаны с различными патологическими состояниями [36, 37]. Несмотря на имеющиеся данные о вовлеченности сумоилирования в плацентарную дисфункцию [13, 20], информации об экспрессии экзосомных белков SUMO при данной патологии нет. 

В контексте вышесказанного мы оценили экспрессию белков SUMO в экзосомах беременных на сроке 11–14 недель гестации (когорта I). Следует отметить, что ранее нами было показано повышение экспрессии конъюгированных форм SUMO 1–4 и UBC9 в экзосомах беременных с ранней ПЭ на момент родов [29] и свободных форм SUMO 1–4, UBC9 в плаценте при ранней ПЭ [28]. В настоящем исследовании экспрессия конъюгированной формы SUMO 1 в экзосомах беременных с ранней ПЭ на сроке 11–14 недель гестации была значимо снижена, в то время как экспрессия SUMO 2/3/4 повышена относительно физиологически протекающей беременности. У беременных с поздней ПЭ выявлена аналогичная картина по направленности экспрессии конъюгированных форм SUMO 1 и SUMO 2/3/4 в экзосомах. Как показано ранее, характер экспрессии белков SUMO может быть обусловлен их уникальным пространственно-временным распределением в слоях трофобласта на протяжении беременности, а также активностью в ответ на окислительный стресс и воспаление. В частности, свободные формы SUMO 1 и SUMO 4 экспрессируются преимущественно в цитотрофобластах в I и II триместрах беременности со смещением в синцитиотрофобласт в III триместре. SUMO 2/3 демонстрирует стабильную экспрессию по всему слою трофобласта в течение беременности. Однако в ответ на гипоксический/окислительный стресс наблюдаются активность и перераспределение SUMO 1 и SUMO 4 в синцитий из цитотрофобласта, а экспрессия SUMO 2/3 увеличивается при воспалительном стрессе [38]. Примечательно, что результаты нашего исследования, в целом, согласуются с приведенными выше данными, демонстрируя разнонаправленную активацию экспрессии экзосомных конъюгированных белков SUMO 1 и SUMO 2/3/4 в ответ на клеточный стресс при плацентарной дисфункции. Тем не менее, под воздействием различных стрессовых стимулов в клетках должна увеличиваться экспрессия всех изоформ SUMO, и их последующая секреция соответственно. Однако в нашем исследовании экспрессия SUMO 1 в экзсосомах была снижена, как при ранней, так и при поздней ПЭ. Ранее были обнаружены уменьшение пула свободной формы SUMO 2/3 в клетках и накопление его высокомолекулярных конъюгатов в ответ на клеточный стресс, в отличие от SUMO 1 [39]. Принимая во внимание эти данные, мы выдвинули предположение, что гипоксический и окислительный стресс, возникающий при плацентарной дисфункции на ранних сроках, активирует свободную форму SUMO 2/3 для формирования большого количества конъюгатов с белками-мишенями и индукции стресс-чувствительных сигнальных каскадов посредством экзосом, в то время как SUMO 1 способен избирательно конъюгироваться в ответ на стресс, о чем свидетельствует снижение экспрессии его конъюгированной формы в экзосомах. Интересно, что свободных форм указанных белков в экзосомах мы не обнаружили, а молекулярный вес конъюгированных форм, предположительно, соответствовал суммарному весу их свободной формы с UBC9. Кроме того, экспрессия самого конъюгированного UBC9 также была значимо повышена только при поздней ПЭ относительно физиологической беременности. Следует отметить, что UBC9 является единственным ферментом, который осуществляет конъюгацию изоформ SUMO 1–4 с белкамимишенями, в отличие от системы убиквитинирования [19]. Следовательно, уровень его экспрессии имеет решающее значение для сумоилирования. Основываясь на ранее продемонстрированном пространственно-временном распределении SUMO 1–4 в клетках трофобласта [38], мы предположили, что имеется определенная специфичность конъюгирования UBC9 с SUMO 1 и SUMO 2/3 в контексте их субклеточных мишеней. Тем более, что на модельных объектах уже получены доказательства его различной иммуннореактивности с SUMO-белками в зависимости от популяции клеток [40].

Известно, что сумоилирование модулирует транскрипционную активность и локализацию множества ядерных [41] и цитоплазматических белков [42], регулируя, таким образом, широкий спектр биологических процессов. И безусловный интерес представляет недавнее открытие процесса сумоилирования членов семейства гетерогенных ядерных рибонуклеопротеинов (hnRNPs), который обеспечивает универсальный механизм регуляции их РНК-связывающей активности и последующей селективной сортировки транскриптов в экзосомы [27, 43]. Сумоилирование hnRNPA2/B1 с помощью SUMO 1 является необходимым условием для его связывания со специфичными экзомотивами мкРНК и осуществления их последующей загрузки в экзосомы, тогда как ингибирование сумоилирования может нарушить связывание белка с мкРНК. В нашем предыдущем исследовании были идентифицированы экзомотивы ряда мкРНК, чувствительных к гипоксии, а также установлены корреляции их экспрессии с уровнем SUMO 2/3/4 в плаценте беременных с ранней ПЭ [29]. Опираясь на данную связь, мы оценили экспрессию hnRNPA2/B1, которая, как и в случае с UBC9, была значимо повышена в экзосомах беременных с поздней формой ПЭ на сроке 11–14 недель. Поскольку hnRNPA2/B1 является субстратом SUMO [44], вполне вероятно, что регуляцию его экспрессии в экзосомах может также осуществлять SUMO 2/3/4, если уровень SUMO 1 снижен. Более того, учитывая специфичность конъюгирования UBC9, можно предположить, что при поздней форме ПЭ экспрессия hnRNPA2/B1 активируется посредством конъюгации с UBC9. И это необходимо для загрузки в экзосомы мкРНК, регулирующих ассоциированные с сосудистой дисфункцией мишени. Стоит отметить не менее интересные результаты по экспрессии белков у беременных с высоким риском развития ПЭ по данным комбинированного пренатального скрининга I триместра. Несмотря на наличие маркеров плацентарной дисфункции, исход их беременностей был благополучный. Однако направленность экспрессии конъюгированной формы SUMO 1, UBC9 и hnRNPA2/B1 совпадала с таковой при ранней и поздней ПЭ, за исключением SUMO 2/3/4, уровень которого не изменялся.

В связи с установленными изменениями экспрессии конъюгированных форм белков в экзосомах беременных с ПЭ на сроках 11–14 недель гестации представилось интересным оценить их экспрессию в ткани плаценты беременных с ранней и поздней ПЭ (когорта II). Мы обнаружили снижение экспрессии конъюгированных форм SUMO 1–4 и hnRNPA2/B1 в плаценте как при ранней, так и при поздней ПЭ, а уровень UBC9 был значимо снижен только при поздней ПЭ. Результаты оказались и неожиданными, и интригующими. Как было ранее отмечено, процесс сумоилирования, являясь критическим регулятором ответа на клеточный стресс, обусловливает увеличение уровня высокомолекулярных конъюгатов SUMO, равно как и свободных форм. Более того, в предыдущем исследовании выявлено повышение свободных форм SUMO при ранней ПЭ [28]. Такую разнонаправленную экспрессию свободных и конъюгированных форм исследуемых белков в плаценте можно объяснить тем, что свободные формы экспрессируются исключительно в ответ на стрессовые стимулы, выполняя адаптационную функцию, в то время как формирование конъюгатов SUMO необходимо для запуска регуляторных каскадов. При этом изменение их экспрессии зависит от того, что необходимо в данный момент времени — сумоилирование или десумоилирование белка-мишени. Наше предположение нашло подтверждение в ряде исследований. Так, показано, что на ранних сроках беременности (9–10 недель) уровень свободных форм SUMO увеличивается, и это совпадает с физиологической плацентарной гипоксией. Однако на 10–12-й неделе гестации сверхэкспрессия SUMO 2/3 может ингибировать активность HIF 1A (фактора, индуцируемого гипоксией) и для сохранения стабильности последнего десумоилирующий белок SENP 3 снижает экспрессию SUMO 2/3 [45]. Другими авторами приведено доказательство роли десумолирующего белка SENP 1 в эндотелиальных клетках как положительного регулятора обусловленной гипоксией экспрессии VEGF и ангиогенеза [46, 47]. Что касается плацентарной дисфункции, изменение экспрессии GCM-1, индуцированной гипоксией и регулируемой транскрипционным фактором p45 NF-E2 [48], связано, в том числе, с десумоилированием [49, 50]. Важно отметить, что факторы, повышающие глобальное сумоилирование, не обязательно приводят к изменениям в сумоилировании всех субстратов SUMO. Сумоилирование отдельных белков осуществляется специфичным для субстрата образом и часто в отсутствие глобальных изменений [51].

Открытие плацентарных факторов способствовало всплеску исследований по их использованию в качестве биомаркеров для диагностики и прогнозирования риска развития ПЭ и ЗРП с 2003 г. [52]. Однако наиболее достоверных результатов удалось достичь в прогнозировании раннего начала ПЭ. Исследователи связывают это с тем, что изменение их уровней является отражением стресса синцитиотрофобласта, т. е. плацентарной дисфункции в целом, а не биомаркером ПЭ [53]. Кроме того, предлагаемый диагностически значимый уровень циркулирующих в крови матери про- и антиангиогенных факторов может быть достигнут в случае проявления патологического состояния, а не на начальном этапе нарушения эндоваскулярной инвазии спиральных артерий трофобластом [54]. В этой связи необходим поиск специфичных маркеров. Интересно, что снижение уровня ангиогенного PLGF и повышение антиангиогенного sFlt-1 в течение III триместра коррелирует с наблюдаемыми изменениями в перераспределении SUMO 1 и SUMO 4 из цитотрофобласта в синцитий, который является единственным типом клеток плаценты, находящимся в непосредственном контакте с материнским кровообращением [38]. А ранее мы обнаружили корреляционную связь между изменениями экспрессии miR-423-3p, miR-652-3p, уровнем SUMO 2/3/4, UBC9 в плаценте и снижением концентрации PLGF в крови беременных с ранней ПЭ на момент родов [28]. Опираясь на данные результаты, мы осуществили поиск корреляций с показателями комбинированного пренатального скрининга беременных I триместра. В сыворотке крови беременных на ранних сроках повышенный уровень экзосомных SUMO 2/3/4 и UBC9 обратно коррелировал с концентрацией PLGF, что хорошо согласуется с нашими предыдущими данными. Кроме того, обнаруженная взаимосвязь подтверждает регуляцию плацентарного фактора посредством сумоилирования и дает основание предполагать специфичность SUMO 2/3/4 и UBC9 по отношению к PLGF. Интересно, что эта взаимосвязь установлена только для ранней формы ПЭ. Примечательно, что помимо взаимосвязи с плацентарным фактором, обнаружены значимые корреляции экспрессии всех конъюгированных изоформ SUMO и hnRNPA2/B1 с пульсационным индексом маточной артерии, а UBC9 коррелировал с показателем среднего артериального давления. Особенность в том, что при поздней форме ПЭ повышенный уровень SUMO 2/3/4 обратно коррелировал с РАРР-А, а UBC9 и hnRNPA2/B1 — с концентрацией β-ХГЧ. При этом не обнаружено корреляций SUMO 1 ни с одним из показателей. Низкие концентрации β-ХГЧ и РАРР-А в I триместре беременности связывают с риском развития ПЭ и ЗРП [55–57].

Учитывая результаты корреляционного анализа, а также отсутствие данных о прогностическом потенциале модификаций SUMO, мы создали модели логистической регрессии с ROC-кривыми для оценки возможности использования исследуемых экзосомных белков в качестве потенциальных предикторов риска развития ПЭ на ранних сроках беременности. В модели предикции ранней ПЭ определены значимые коэффициенты для UBC9 (AUC = 0,88; Se-0,72; Sp-1), а поздней ПЭ — для SUMO 1 (AUC = 0,79; Se-0,8; Sp-0,77). Кроме этого, на основе оценки экспрессии UBC9, hnRNPA2/B1 (AUC = 0,94; Se-0,80; Sp-1) и SUMO 1 (AUC = 0,91; Se-0,88; Sp-1) возможно дифференцировать беременных с высоким риском развития ПЭ по данным комбинированного скрининга I триместра от беременных с ПЭ и с физиологической беременностью соответственно. Мы обратили внимание на то, что SUMO 2/3/4 не достиг значимого уровня ни в одной из моделей. Тем не менее, полученные результаты позволяют предположить дифференциальную специфичность UBC9 и SUMO 1 в патогенезе подтипов ПЭ, а также различную функциональную роль белков SUMO при плацентарной дисфункции в целом, что важно для превентивной терапевтической стратегии. Бесспорно, использование прогностических моделей потребует последующей валидации на большой когорте беременных с соответствующими клиническими исходами, включая изолированные формы ПЭ и ЗРП.

ВЫВОДЫ

Основная ценность настоящего исследования заключается в том, что оно открывает несколько поисковых направлений для предикции состояний, связанных с плацентарной дисфункцией, на основе изучения паттерна сумоилирования экзосомного контента. Это первые данные об экзосомной экспрессии конъюгированных изоформ SUMO 1–4, а также UBC9 и hnRNPA2/B1, дифференциально изменяющейся на ранних сроках у беременных с ПЭ. Возможность прогноза данной патологии может быть обусловлена функциональной специфичностью изоформ SUMO, а также механизмом конъюгации/деконъюгации, с помощью которого осуществляется координация сигнальных путей. Стоит отметить, что наше исследование имеет ограничение, которое связано с небольшим размером выборки в каждой когорте. Мы обратили на это внимание, поскольку для валидации прогностических моделей необходимо расширение когорт беременных. Кроме того, в данной работе мы не оценивали экспрессию белков в экзосомах, осуществляющих деконъюгацию SUMO с субстратами. Это можно рассматривать в качестве перспективы для будущих исследований, как и изучение самих субстратов, вовлеченных в регуляцию при плацентарной дисфункции.