Сниженный овариальный резерв (СОР) — одна из актуальных проблем репродуктивной медицины. Уменьшение числа антральных фолликулов (КАФ), снижение уровня антимюллерового гормона (АМГ) и повышение уровня базального фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) в сыворотке крови приводят к формированию бесплодия, бедного овариального ответа, ухудшению качества ооцитов, снижению процента фертилизации, частоты наступления беременности в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО/ИКСИ) и увеличению частоты ранних репродуктивных потерь [1].

Метаболизм гормонов и аминокислот может отражать эпигенетические изменения процессов фолликуло- и оогенеза [2] и характеризуется изменением не только уровней отдельных метаболитов, но и их взаимодействий в виде сложных метаболических «сетей» [3].  Рассматривая суммарный вклад эндокринно-метаболомных изменений крови и фолликулярной жидкости в клеточный метаболизм и их влияние на результаты программ ЭКО, возможно приоткрыть отдельные патогенетические механизмы формирования СОР, а также определить метаболиты, которые могут выступать в качестве потенциальных биомаркеров оценки овариального резерва [4, 5]. 

В опубликованном нами ранее исследовании у женщин с бесплодием и сниженным овариальным резервом было обнаружено значимое снижение уровней аминокислот саркозина и триптофана в плазме крови и фенилаланина, триптофана, метионина, аспарагина, аргинина и лизина в фолликулярной жидкости, а также их взаимосвязь с показателями фолликулогенеза, оогенеза и раннего эмбриогенеза в программе ЭКО [6].

Целью исследования было проанализировать изменения метаболических путей аминокислот в плазме крови и фолликулярной жидкости, их взаимосвязь с возрастом, а также оценить их клиническое значение в патогенезе СОР.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В проспективное обсервационное исследование были включены женщины репродуктивного возраста с бесплодием, обратившиеся в ФГБУ «НМИЦ АГП им. В. И. Кулакова» Минздрава России для проведения программы ЭКО. 

Общая выборка составила 115 женщин, которые были стратифицированы на группы СОР (антимюллеров гормон (АМГ) < 1,2 нг/мл, число антральных фолликулов (КАФ) < 5)) и нормального (АМГ ≥ 1,2 нг/мл, КАФ ≥ 5). Для уточнения роли возраста на аминокислотный профиль у женщин с бесплодием исследуемые группы были дополнительно стратифицированы по возрасту: до 35 и после 35 лет. Критерии включения в исследование: репродуктивный возраст 25–42 лет; отсутствие наступления беременности в течение не менее года регулярной половой жизни без контрацепции; добровольное согласие на участие в исследовании. Критерии исключения: противопоказания к ВРТ; операции на яичниках в анамнезе; иммунодефицитные состояния; системные заболевания соединительной ткани и ревматические заболевания; онкологические заболевания любой этиологии; наличие хромосомных и генетических аномалий; использование донорских ооцитов или эмбрионов, суррогатного материнства.

Всем пациенткам было проведено обязательное обследование перед вступлением в программу вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) согласно нормативным документам [7]. Для определения содержания аминокислот и их метаболитов в плазме крови и фолликулярной жидкости методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с детектированием на масс-спектрометре (ВЭЖХ-МС) использовали жидкостной хроматограф Agilent 1260 II (Agilent; США) с масс-спектрометрическим детектором Agilent 6460 (Agilent; США). Параметры масс-спектрометра и хроматографического разделения соответствовали рекомендациям, приведенным в руководстве JASEM по анализу аминокислот (JASEM; Турция).

Перед статистической обработкой ВЭЖХ-МС данные нормировали на суммарный сигнал всех аналитов и приводили к стандартизованному виду согласно следующей формуле  [9]:

формула

Поиск метаболических путей, потенциально вовлеченных в патогенез СОР, выполняли с помощью MetaboAnalyst посредством анализа вовлеченности аминокислот, уровни которых значимо различаются между исследуемыми группами. Оценка обогащения метаболических путей была выполнена с помощью анализа избыточного представления (over representation analysis, ORA) с использованием гипергеометрического теста. Статистическую значимость метаболического пути определяли с использованием гипергеометрического теста с коррекцией по Бенджамини–Хохбергу. Статистическая значимость пути (р) соответствовала вероятности случайного пересечения экспериментальных данных с метаболитами конкретного метаболического пути (тест Фишера). Пути, ассоциированные с патологией, считали статистически значимыми при частоте ложноположительных результатов (false discovery rate, FDR) < 0,05.

Для оценки возможности классификации пациентов по группам на основе аминокислотного профиля плазмы крови и фолликулярной жидкости были разработаны модели логистической регрессии. Для этого рассматривали все возможные комбинации аминокислот в качестве независимых переменных, а принадлежность пациентки к одной из групп — в качестве зависимой переменной. Качество моделей оценивали при помощи ROC-анализа, а также расчета чувствительности и специфичности. Из всех моделей выбирали четыре с наибольшей площадью под ROC-кривой (AUC). Для каждой модели определяли критерий Уальда, 95%-й доверительный интервал (ДИ), отношение шансов (ОШ) и его доверительный интервал.

Для статистической обработки данных ВЭЖХ-МС использовали скрипты, разработанные на языке R в программе RStudio [8]. Перед проведением целевого сравнительного метаболомного анализа данных в исследуемых группах определяли вид распределения данных (тест Колмогорова–Смирнова, графический анализ данных).

При нормальном виде распределения данных определяли среднее значение со стандартным отклонением M (SD), для оценки различий в группах — t-тест. При отсутствии нормального распределения данные были представлены в виде медианы с интерквартильным интервалом Ме (Q₁; Q₃), сравнение уровней аминокислот проводили с помощью непараметрического критерия Уилкоксона–Манна–Уитни. Величину порогового уровня значимости p принимали равной 0,05. 

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клинико-анамнестическая и гормональная характеристики исследуемых представлена в табл. 1. Все пациентки были сопоставимы по возрасту и антропометрическим показателям, имели регулярный менструальный цикл, средний возраст составил 37,2 ± 5,3 лет. Значимых различий по частоте гинекологической и соматической патологии выявлено не было. У пациенток с СОР был отмечен статистически значимо более короткий менструальный цикл, меньшее число антральных фолликулов и меньший уровень АМГ. При анализе эндокринного профиля отмечена тенденция к повышению уровня ФСГ и снижению уровней андрогенных стероидов: андростендиона и ДГЭА-С.

При исследовании аминокислотного профиля в группе СОР обнаружено значимое снижение уровней саркозина и триптофана в плазме крови и фенилаланина, триптофана, метионина, аспарагина, аргинина и лизина в фолликулярной жидкости. Подробные результаты анализа опубликованы ранее [6]. Был осуществлен анализ метаболических путей, в которые вовлечены аминокислоты со статистически значимо более низкими уровнями.

Изменения аминокислотного профиля плазмы крови и фолликулярной жидкости при бесплодии и СОР оказывают наибольшее влияние на биосинтез фенилаланина, тирозина и триптофана (влияние = 0,5, p = 0,026). Также выявлено значимое влияние на биосинтез аргинина (влияние = 0,289, p < 0,001), метаболизм аспартата (влияние = 0,25, p = 0,027), метаболизм аланина, аспартата и глутамата (влияние = 0,114, p = 0,013) (рис. 1; табл. 2).

По результатам ВЭЖХ-МС-анализа аминокислотного профиля были разработаны модели логистической регрессии, позволяющие различать образцы венозной плазмы и фолликулярной жидкости пациенток группы СОР и группы контроля. Для построения моделей использовали все возможные комбинации аминокислот. Для каждой из моделей выполнили ROC-анализ и выбрали четыре модели, характеризующиеся наибольшей площадью под ROC-кривой (AUC).

Наибольшее значение AUC (0,82) было у модели, построенной на показателях возраста и уровнях серина, тирозина и фенилаланина. Специфичность и чувствительность составили 94 и 68% соответственно, пороговое значение — 0,69. Во все построенные модели вошли значения возраста и уровня фенилаланина (рис. 2; табл. 3).

Для фолликулярной жидкости были также построены модели логистической регрессии аналогично описанным ранее. Все модели имели одинаковую площадь под кривой (AUC = 0,88). Модели 1 и 2 характеризовались большей чувствительностью (84%), а модели 3 и 4 — большей специфичностью (88%). Во все построенные модели вошел фенилаланин — очевидно, как аминокислота, содержание которой наиболее различалось между группами (рис. 2; табл. 3).

Для уточнения влияния возраста на аминокислотный профиль пациентки обеих групп были разбиты на две подгруппы: младше 35 и старше 35 лет. В группе СОР позднего репродуктивного возраста (старше 35 лет) в плазме крови выявлено статистически значимое снижение уровней лизина, глютамина, серина, глицина, треонина, тирозина, лейцина, триптофана, глютаминовой и аспарагиновой кислот, а также повышение пролина (рис. 3А). Однако в фолликулярной жидкости возрастассоциированных изменений аминокислотного профиля при бесплодии и СОР с возрастом не выявлено (рис. 3Б). Также у женщин с нормальным овариальным резервом как в плазме крови, так и в фолликулярной жидкости не было выявлено значимых возраст-ассоциированных изменений аминокислотного профиля (рис. 3В, Г).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные данные свидетельствуют о значимых изменениях метаболизма аминокислот в патогенезе СОР. По нашим результатам, СОР характеризуется изменением биосинтеза фенилаланина, тирозина и триптофана — ароматических аминокислот, являющихся предшественниками нейротрансмиттеров, серотонина и катехоламинов (дофамина, норадреналина и адреналина), дефицит которых может привести к оксидативному стрессу, оказывающему токсическое влияние на процессы фолликуло- и оогенеза [10]. Фенилаланин играет значительную роль в формировании третичной структуры белка и стабилизации белковых структур [11]. Сниженные уровни фенилаланина у женщин с СОР в нашем исследовании согласуются с результатами других авторов [12]. Роль фенилаланина в патогенезе СОР также подтверждается в нашем исследовании включением фенилаланина во все модели логистической регрессии с наибольшей значимостью.

При снижении уровня фенилаланина, являющегося основным субстратом синтеза тирозина в организме, снижается его доступность для производства тирозина [13], который служит основой для синтеза медиаторов и гормонов аминной природы: катехоламинов, серотонина, мелатонина. Все метаболиты тирозина способствуют правильной и последовательной работе всех систем организма для обеспечения репродуктивной функции. Тирозин, как и его предшественник, необходим для синтеза структуры бензохинона, которая входит в состав кофермента Q10 — антиоксиданта, обладающего способностью нейтрализовать свободные радикалы, ингибировать перекисное окисление липидов в биологических мембранах и защищать митохондриальные белки и ДНК от окислительного повреждения, а также участвующего в синтезе АТФ в митохондриях в качестве переносчика электронов [14]. Описана также антиоксидантная способность тирозина в исследовании семенной плазмы [15].

Участие триптофана неоценимо во многих физиологических процессах, например, при поддержании роста клеток и регуляции иммунной функции, а также в синтезе серотонина и мелатонина, снижение которых приводит к нарушению этапов раннего эмбрионального развития [16].

В нашем исследовании у женщин с СОР позднего репродуктивного возраста снижение уровней тирозина и триптофана коррелирует с ухудшением результатов программ ЭКО, что подтверждает их роль в возрастных изменениях оогенеза и раннего эмбрионального развития и согласуется с данными зарубежных коллег [17].

Биосинтез аргинина, значимое изменение которого выявлено в нашем исследовании, играет решающее значение для синтеза оксида азота (NO). Последний является фактором релаксации сосудов, оптимизирующим кровоснабжение тканей [18] и способствующим нормальному росту эндометрия [19], регуляции стероидогенеза и фолликулогенеза [20]. Применение препаратов с высоким содержанием аргинина при бедном овариальном ответе в программе ЭКО приводит к повышению уровней аргинина, цитруллина и NO в плазме крови и фолликулярной жидкости и ассоциировано с улучшением маточного и яичникового кровоснабжения, увеличением частоты оплодотворения и наступления беременности и снижением частоты осложнений беременности (ранних репродуктивных потерь, задержки внутриутробного развития и преэклампсии) [21].

Анализ вовлеченности аминокислот в метаболические пути продемонстрировал статистически значимое изменение метаболизма аланина, аспартата и глутамата. Аспартат и глутамат являются возбуждающими медиаторами ЦНС, участвуя в синтезе пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов. Аспартат, по данным нашего исследования, присутствует в более высоких концентрациях в фолликулярной жидкости у женщин раннего репродуктивного возраста, по сравнению с женщинами позднего репродуктивного возраста, что также подтверждено в одном из исследований  наличием прямой корреляционной взаимосвязи уровня D-аспарагиновой кислоты в фолликулярной жидкости с морфологией ооцитов, их созреванием, процентом зрелых ооцитов и скоростью оплодотворения [22]. Из аспарагиновой кислоты образуется метионин, участвующий в синтезе полиаминов, посттрансляционной модификации белков и регуляции процессов считывания ДНК. В эксперименте на животных ограничение пищевого потребления метионина снижало в плазме крови уровни инсулиноподобного фактор роста 1, тиреоидных гормонов и снижало фертильность [23].

В нашем исследовании отмечен высокий прогностический потенциал фолликулярной жидкости у женщин с СОР наравне с плазмой крови, что согласуется с результатами других исследований, подтверждающими роль метаболизма аминокислот в фолликулярной жидкости как функционального показателя качества ооцитов у женщин позднего репродуктивного возраста в программах ЭКО/ИКСИ [24]. Вероятное снижение доступности аминокислот в фолликулярной жидкости может приводить к увеличению их потребления ооцитами в культуральной среде в программе ЭКО.

Важная роль антиоксидантной системы в ооцитах и связанный с возрастными изменениями дисбаланс между прооксидантной активностью и системами антиоксидантной защиты в ооцитах [25] провоцирует развитие митохондриальной дисфункции, способствует увеличению частоты анеуплоидии ооцитов/эмбрионов и снижению частоты наступления беременности [26]. Полученные нами данные о выраженных изменениях аминокислотного профиля при СОР у женщин позднего репродуктивного возраста подтверждают общее снижение обмена аминокислот с возрастом, связанное в том числе со снижением их антиоксидантной способности и могут быть использованы для оценки овариального резерва. Актуальным остается дальнейшее исследование применения аминокислот в клинической практике для улучшения исходов программ ЭКО/ИКСИ как in vitro, при их добавлении в эмбриологические среды, так и in vivo, при приеме препаратов с высоким содержанием необходимых аминокислот [27, 28].

ВЫВОДЫ

Значимое изменение метаболизма аминокислот в плазме крови и фолликулярной жидкости при бесплодии и СОР, в том числе фенилаланина, тирозина и триптофана, задействованных в реализации антиоксидантной защиты в тканях яичника, синтезе нейромедиаторов, катехоламинов и гормонов, оказывает непосредственное влияние на репродуктивную систему, изменяя клеточный энергетический метаболизм. На основании найденных различий при использовании методов целевой полуколичественной метаболомики были предложены модели, позволяющие с вероятностью 82% в плазме крови и 88% — в фолликулярной жидкости подтверждать СОР по аминокислотному профилю. Данные о возрастассоциированном изменении уровней аминокислот при СОР подтверждают актуальность исследований применения предварительной терапии препаратами, содержащими аминокислоты с целью улучшения исходов программ ЭКО.