Заболевания микобактериальной этиологии, в том числе туберкулез, представляют собой существенную проблему для здравоохранения. Туберкулез является второй по частоте причиной смерти от инфекционных заболеваний [1]. Заболеваемость туберкулезом в РФ снижается, а заболевания, вызываемые нетуберкулезными микобактериями, встречаются все чаще. Такая же тенденция отмечена во всем мире [2–6]. Исследователи связывают рост микобактериоза со старением общемирового населения и повышением частоты встречаемости врожденных и приобретенных иммунодефицитных состояний [4, 7–9].

В ряде случаев, чаще в пожилом возрасте и при иммуносупрессии, пациент может быть инфицирован одновременно МБТК и НТМБ, или несколькими видами НТМБ [2, 10–12]. В России частота встречаемости микобактериальной коинфекции составляет 1,16% от всех бактериовыделителей. Наиболее распространенными сочетаниями видов в составе смешанных популяций микобактерий являются M. tuberculosis + M. avium, M. tuberculosis + M. abscessus, M. avium + M. intracellulare, M. avium + M. kansasii, M. avium + M. abscessus [2].

Случаи смешанной микобактериальной инфекции важно вовремя диагностировать, так как невыявленное коинфицирование несколькими видами микобактерий неизбежно приведет к неудачному лечению. Неудача лечения будет обусловлена тем, что нетуберкулезные микобактерии устойчивы к большинству противотуберкулезных препаратов и имеют видоспецифичный профиль чувствительности к антибактериальным препаратам [13–15].

Поскольку туберкулез и микобактериоз имеют схожую клинико-рентгенологическую картину, дифференцировать их можно, проведя видовую идентификацию культуры микобактерий методами ВЭЖХ, масс-спектрометрии или молекулярно-генетическими методами [16–19]. Преимущество молекулярно-генетической диагностики туберкулеза и микобактериоза заключается в том, что она позволяет проводить анализ не только из культур, но и непосредственно из клинического диагностического материала. В 2021 г. в ФГБНУ «ЦНИИТ» совместно с «НПФ Синтол» был разработан тест «Амплитуб-НТМБдифференциация», основанный на мультиплексной ПЦР, который позволяет выявлять МБТК, проводить дифференциацию МБТК с НТМБ и выявлять 12 видов НТМБ (M. avium, M. intracellulare, M. xenopi, M. chimaera, M. kansasii, M. gordonae, M. lentiflavum, M. paragordonae, M. abscessus, M. chelonae, M. fortuitum, M. malmoense) [20].

Согласно назначению, тест должен иметь хороший потенциал для выявления микобактериальной коинфекции, в том числе обусловленной несколькими видами НТМБ. Следовательно, представлялось актуальным определить способность этого набора выявлять смешанные популяции микобактерий в зависимости от видового состава смеси.

Цель исследования — определить дискриминирующую способность метода мультиплексной ПЦР для видовой идентификации при выявлении смешанных популяций микобактерий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования

Модельные образцы представляли собой смешанную в разных соотношениях ДНК микобактерий, наиболее часто выявляемых в составе смешанных популяций. Для создания модельных образцов использовали ДНК, выделенную из культур штаммов микобактерий из коллекции микобактериальных культур отдела микробиологии ФГБНУ «ЦНИИТ» M. tuberculosis H37Rv (TMC 102), M. avium. (ATCC-35719), M. intracellulare. (ATCC-25120), M. kansasii (ATCC-12478), M. abscessus (ATCC-19977).

Дизайн исследования

ДНК из культур исследуемых видов микобактерий была выделена набором «Амплитуб-РВ» («Синтол»; Россия). Концентрацию ДНК микобактерий каждого вида определяли спектрофотометрически (Спектрофотометр Picopet «Picodrop»; Великобритания) и пересчитывали на число геномных эквивалентов. Далее готовили серийные разведения ДНК микобактерий каждого вида, которые смешивали в пропорциях 1 : 1, 1 : 9, 1 : 99 и 1 : 999, суммарная концентрация ДНК в смесях составляла 10⁶ ГЭ/мл, 10⁵ ГЭ/мл, 10⁴ ГЭ/мл и 10³ ГЭ/мл. Модельные образцы были исследованы с использованием набора «Амплитуб-НТМБдифференциация» («Синтол»; Россия). Амплификацию проводили в термоциклере с оптическим модулем CFX96Touch (Bio-Rad; США). Видовую идентификацию осуществляли согласно инструкции к набору по наличию кинетических кривых усиления флюоресценции по соответствующим сигналам: кинетические кривые в пробирке стрипа № 1 отражали накопление продуктов амплификации, соответствующих специфичным участкам генома МБТК и/или участкам генома, специфичным для всех видов НТМБ, в пробирках № 2–4 — кинетические кривые усиления сигнала флюоресценции соответствовали наличию в образце ДНК целевых для набора видов НТМБ (табл. 1).

Таким образом, были исследованы образцы разной степени нагрузки ДНК, каждый из которых содержал ДНК двух видов микобактерий, смешанную в разных пропорциях (табл. 2). Каждый вариант модельных образцов был исследован в 10-ти повторностях.

Дискриминирующую способность метода устанавливали по его предельной возможности обнаруживать два вида микобактерий, что будет выражено в наименьшей доле содержания в образце ДНК одного из видов микобактерий, обнаруживаемой в составе смеси во всех 10-ти повторностях.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты исследования модельных образцов ДНК методом мультиплексной ПЦР для видовой идентификации микобактерий представлены в табл. 3. Дискриминирующая способность мультиплексной ПЦР для видовой идентификации зависела от суммарной концентрации ДНК в образце. При высокой суммарной концентрации ДНК, равной 10⁶ ГЭ/мл дискриминирующая способность метода составляла 0,1%, при концентрации 10⁵ ГЭ/мл — 1%, при 10⁴ ГЭ/мл — 10% и при 10³ ГЭ/мл — 50%. Такая закономерность была характерна для всех исследованных видов микобактерий и прослеживалась также при дифференциации МБТК и НТМБ. Во всех видах модельных образцов эта минимальная доля вида соответствовала концентрации ДНК вида микобактерий как минимум 5 × 10² ГЭ/мл.

Вероятность обнаружения каждого вида в доле, на одну ступень ниже дискриминируемой (далее — преддискриминируемая доля), варьировала для разных видов микобактерий, входящих в состав смеси (табл. 3). Наибольшая вероятность быть обнаруженной в составе смеси в преддискриминируемой доле (1 × 10² ГЭ/мл) была у МБТК, M. avium и M. intracellulare, которые выявлялись как второй вид в смеси в 7/10–9/10 повторностях, в зависимости от суммарного содержания ДНК. Вероятность выявления в преддискриминируемой доле M. kansasii была несколько ниже (5/10–6/10) и наименьшей — у M. abscessus (2/10–4/10). Такая же закономерность для вероятности обнаружения микобактерий в смеси в преддискриминируемой доле была показана и при анализе результатов дифференциации МБТК и НТМБ: M. avium как НТМБ в преддискриминируемой доле были выявлены в составе смеси c M. tuberculosis в 8/10–9/10 повторности, с M. abscessus — 4/10–5/10. При доле вида микобактерий, на две ступени ниже дискриминируемой (соответствует 1,00 × 10¹ ГЭ/мл), результат ПЦР на этот вид был отрицательным и в смеси регистрировали только доминирующий вид.

Таким образом, можно заключить, что мультиплексная ПЦР позволяет выявлять смесь видов микобактерий, если концентрация ДНК каждого из видов составляет не менее 5 × 10² ГЭ/мл. При более низкой концентрации ДНК микобактерий (1 × 10² ГЭ/мл) чувствительность набора для обнаружения смешанных популяций микобактерий будет зависеть от видового состава: вероятность выявить в смеси МБТК M. avium и M. intracellulare выше, чем M. kansasii и, особенно, M. abscessus.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

МБТК и НТМБ вызывают заболевания человека, характеризующиеся практически идентичной клиникорентгенологической картиной [21]. Однако, в зависимости от этиологического агента, схемы терапии пациентов будут кардинально различаться, поэтому необходимость дифференциальной диагностики заболеваний, вызванных МБТК и НТМБ, закреплена в нормативных документах [22, 23]. В существующих нормативах все же не учтена возможность инфицирования одного пациента несколькими видами микобактерий и не определена ценность методов этиологической диагностики микобактериальных коинфекций.

Особенно полезны при диагностике заболеваний микобактериальной природы молекулярно-генетические методы, которые позволяют определить возбудителя в течение суток, в отличие от культуральных исследований, результаты которых получают не ранее, чем через три недели [24]. Существует достаточно много отечественных ПЦР-тестов, которые позволяют выявлять МБТК и/или проводить дифференциацию видов внутри комплекса МБТК [25]. Зарегистрированных в РФ наборов, детектирующих НТМБ в диагностическом материале, только два: набор «MTB-тест» производства «ТестГен» (Россия), который предназначен для выявления МБТК или НТМБ, и использованный в представленном исследовании набор «Амплитуб-НТМБ-дифференциация» производства «НПФ Синтол» (Россия), который, помимо дифференциации МБТК от НТМБ, позволяет провести видовую идентификацию НТМБ. Следовательно, «Амплитуб-НТМБдифференциация» — единственный зарегистрированный в РФ отечественный набор, позволяющий проводить ускоренную видовую идентификацию возбудителей микобактериальных инфекций. Поэтому целью проведенного исследования было оценить возможность этого теста выявлять микобактериальную коинфекцию. Для этого были созданы модельные образцы, представляющие собой смешанную в разных соотношениях ДНК микобактерий разных видов. Было показано, что набор «Амплитуб-НТМБ-дифференциация» позволяет выявлять микобактериальную коинфекцию, если концентрация ДНК видов НТМБ в смеси составляет не менее 5 × 10² ГЭ/мл, или от 0,1 до 50% вида в смеси в зависимости от суммарной концентрации ДНК в образце.

Исследований, оценивающих диагностическую ценность молекулярно-генетических методов для выявления смешанной инфекции, недостаточно. Лишь в одном проведена оценка методов GeneXpert (Cepheid, США) и мультилокусного секвенирования для выявления смешанных культур микобактерий [26]. Его авторы показали, что GeneXpert способен идентифицировать МБТК в смеси с разными видами НТМБ в доле 1% (в рамках описанного исследования предел детекции вида в составе смеси — 3000 КОЕ/мл).

Сравнение результатов дискриминирующей способности картриджной технологии GeneXpert и метода ПЦР в режиме реального времени, описанного в нашем исследовании, показало, что дискриминирующая способность метода мультиплексной ПЦР при выявлении МБТК в составе смешанных популяций выше, чем установленная для GeneXpert (5 × 10² ГЭ/мл против 3 × 10³ КОЕ/мл соответственно). Кроме того, система GeneXpert выявляет только МБТК и не способна выявить смесь разных видов микобактерий. При наличии коинфекции МБТК и НТМБ результат исследования GeneXpert отразит только наличие МБТК, а при смеси видов НТМБ результат исследования GeneXpert будет отрицательным.

Дискриминирующая способность метода секвенирования, установленная ранее [26], зависела от видов микобактерий, входящих в состав смеси. Смесь МБТК с M. intracellulare, M. kansasii, M. abscessus и M. fortuitum методом секвенирования определялась как два вида в том случае, если доля одного из видов составляла не менее 1% (3 × 10³ КОЕ/мл). При исследовании методом секвенирования смеси МБТК и M. avium, наличие M. avium в смеси определяли, если ее доля составляла не менее 10% (3 × 10⁴ КОЕ/мл), если доля M. avium была меньше 10% — определялись только МБТК [26]. Следовательно, дискриминирующая способность мультиплексной ПЦР выше, чем метода секвенирования для видов M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. abscessus. Дискриминирующая способность метода мультиплексной ПЦР для смеси МБТК + M. fortuitum нами не определялась, так как вид M. fortuitum, по нашим данным, не является частой причиной заболеваний микобактериальной природы и крайне редко встречается в составе смешанных популяций, выделенных от пациентов [2]. Преимуществом мультиплексной ПЦР перед секвенированием при выявлении микобактериальной коинфекции является также тот факт, что для секвенирования используют ДНК, выделенную из культур микобактерий, а для мультиплексной ПЦР — ДНК, выделенную непосредственно из диагностического материала, что ускоряет получение результата и делает его независимым от видоспецифичных культуральных особенностей микобактерий.

ВЫВОДЫ

Была изучена диагностическая ценность метода мультиплексной ПЦР при выявлении смешанных популяций микобактерий. Показано, что основанный на мультиплексной ПЦР набор «Амплитуб-НТМБ-дифференциация» способен выявлять смеси видов микобактерий с высокой дискриминирующей способностью. Дискриминирующая способность метода ПЦР в режиме реального времени при анализе смеси ДНК двух видов микобактерий зависела от суммарного содержания ДНК в образце и варьировала от 0,1% для высоконагруженных образцов (суммарная концентрация ДНК 10⁶ ГЭ/мл) до 50% для низконагруженных образцов (суммарная концентрация ДНК × 10³ ГЭ/мл) и соответствовала количеству ДНК вида в смеси не менее 5 × 10² ГЭ/мл. При количестве ДНК каждого вида в смеси не менее 5 × 10² ГЭ/мл результат ПЦР на выявление коинфекции не зависел от видов микобактерий, входящих в смесь. Если количество ДНК вида микобактерий в смеси было ниже 5 × 10² ГЭ/мл, прослеживалась зависимость результатов ПЦР от вида микобактерий: вероятность выявить в составе смеси МБТК виды M. avium и M. abscessus была выше, чем M. kansasii; наименьшая вероятность быть выявленной в преддискриминируемой доле была у M. abscessus, что необходимо учитывать при анализе результатов ПЦР.