Выделение пяти основных молекулярных подтипов опухолей молочной железы и дифференциальный подход к терапии больных раком молочной железы (РМЖ) стали настоящим прорывом в онкологии. Опухоли, экспрессирующие эстрогеновый (ESR) и прогестероновый (PGR) рецепторы, относятся к люминальным подтипам и, как правило, хорошо поддаются гормональной терапии.

У женщин в постменопаузе эстрогены образуются преимущественно при участии фермента ароматазы, который превращает синтезирующиеся в надпочечниках и жировой ткани андрогены (тестостерон и андростендион) в эстрадиол и эстрон. Поэтому для данной когорты пациенток при лечении опухолей молочной железы люминальных подтипов используют селективные ингибиторы ароматазы (летрозол, анастрозол). Ингибиторы ароматазы блокируют синтез эстрогенов путем высокоспецифичного конкурентного связывания с субъединицей ароматазы, кодируемой геном цитохрома Р450 CYP19A1.

Экспрессирующие эстрогеновый рецептор опухоли доминируют в структуре молекулярных подтипов РМЖ [1, 2]. Однако даже внутри этой большой группы имеются существенные различия в особенностях течения заболевания и терапевтического ответа на гормонотерапию, что диктует необходимость изучения всех доступных биологических характеристик злокачественного новообразования для формирования оптимальной тактики лечения.

Одним из таких инструментов является предоперационный тест на гормоночувствительность. Смысл теста заключается в краткосрочном (2–4 недели) назначении гормональных препаратов на дооперационном этапе. Оценка динамики пролиферативной активности опухоли по изменению уровня Ki67 и экспрессии гормональных рецепторов позволяет спрогнозировать клинический ответ и оценить эффективность эндокринотерапии in vivo, и соответственно избавить часть пациентов от ненужной высокотоксичной химиотерапии. Рекомендация по проведению тестовой гормонотерапии включена в Консенсус ведущей Международной конференции по раннему раку молочной железы в Санкт Галлене уже в 2021 г. и сохранилась в рекомендациях 2023 г. [3, 4], а также в отечественных рекомендациях по лечению рака молочной железы [5, 6].

Полезным инструментом в оценке эффективности проводимой терапии могут стать транскрипционные панели генов, задействованные в онкогенезе, разработанные специально для РМЖ, такие как  Oncotype DX, PAM50, Mammaprint, и отечественные исследования [7, 8].

В связи с этим цель исследования состояла в оценке изменения экспрессионной активности генов при проведении предоперационного теста на гормоночувствительность опухоли к ингибиторам ароматазы у женщин постменопаузального возраста при ESR⁺/HER2-негативном раке молочной железы.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В исследование включено 100 больных РМЖ, получивших лечение в отделении патологии молочной железы ФГБУ «НМИЦ АГП имени В. И. Кулакова в период с января 2019 г. по август 2024 г. Для каждой пациентки исследован материал трепан-биопсии до проведения теста на гормоночувствительность и материал опухоли, полученный в результате хирургического вмешательства.

Цель исследования состояла в оценке изменения экспрессионной активности генов при проведении предоперационного теста на гормоночувствительность опухоли к ингибиторам ароматазы у женщин постменопаузального возраста при ESR⁺/HER2-негативном раке молочной железы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование включено 100 больных РМЖ, получивших лечение в отделении патологии молочной железы ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова в период с января 2019 г. по август 2024 г. Для каждой пациентки исследован материал трепан-биопсии до проведения теста на гормоночувствительность и материал опухоли, полученный в результате хирургического вмешательства.

Критерии включения: инвазивный РМЖ, люминальный Her2-негативный подтип опухоли, постменопаузальный возраст, предоперационный тест на чувствительность опухоли к ингибиторам ароматазы. Критерии исключения: неадекватное качество полученного материала трепанбиопсии для проведения молекулярно-генетических исследований.

В качестве теста на гормоночувствительность на дооперационном этапе пациенты в течение 2–4 недель принимали ингибиторы ароматазы — летрозол 2,5 мг или анастрозол 1 мг один раз в сутки.

Проведено гистологическое и иммуногистохимическое исследование биопсийного и операционного материала. Образцы отбирали в течение 30 мин после удаления опухоли и фиксировали в течение 48 ч в нейтральном забуференном формалине. После фиксации образцы помещали в автоматический микроволновой гистопроцессор LOGOS (Milestone, Италия) для ускоренной проводки тканей. Полученные срезы толщиной 4–5 мкн окрашивали гематоксилином и эозином. Микроскопические препараты исследовали методом обзорной микроскопии, которую осуществляли на световом микроскопе Olympus BX46 (Olympus Corp., Япония). Иммуногистохимическую диагностику проводили на иммуногистостейнере BenchMark ULTRA (Ventana, Roche) с использованием антител к рецепторам эстрогенов (ER, клон SP1, VENTANA), прогестерона (PgR, клон 1E2, VENTANA), к Ki-67 (клон MIB–1, VENTANA), к онкопротеину гена эпидермального фактора роста 2 типа человека (c–erbB2).

При проведении молекулярно-генетических исследований использовали транскрипционную панель, включающую 45 целевых (ESR1, PGR, AR, ERBB2, GRB7, EGFR, FGFR4, MKI67, MYBL2, CCNB1, AURKA, BIRC5, MYC, CCND1, CCNE1, CDKN2A, KIF14, PPP2R2A, PTTG1, SFRP1, TMEM45B, TMEM45A, TPX2, MMP11, CTSL2, EMSY, PAK1, ANLN, BCL2, BAG1, PTEN, TYMS, EXO1, UBE2T, TPT1, SCGB2A2, KRT5, MIA, GATA3, FOXA1, ZNF703, NAT1 CD68, TRAС, CD274/PD-L1) и три референсных (B2M, GUSB, HPRT1) гена. Для проведения исследования парафиновые срезы толщиной 4–5 мкн в количестве 2–3 штук помещали в сухие пластиковые пробирки объемом 1,5 мл. Подбор и подготовка материала осуществлялись врачом-патоморфологом с учетом результатов патоморфологического исследования.

Выделение тотальной РНК проводили после предварительной обработки образцов протеиназой К (набор реагентов «Проба-ПК»; «ДНК-Технология ТС», Россия), далее использовали набор реагентов для выделения нуклеиновых кислот на основе спиртового осаждения «Проба НК-плюс» («ДНК-Технология ТС», Россия). Полученные препараты РНК сразу использовали для постановки реакции обратной транскрипции со смесью олигонуклеотидов, специфичных для каждого гена. Реакцию обратной транскрипции проводили в течение 30 мин при температуре 40 °С с последующей инактивацией обратной транскриптазы в течение 10 мин при температуре 95 °С.

Транскрипционный профиль генов определяли методом мультиплексной ОТ-ПЦР «в реальном времени». Постановку ПЦР осуществляли с использованием детектирующих амплификаторов «ДТпрайм» («ДНК-Технология ТС», Россия) по программе 94 °С 5 мин; пять циклов 94 °С 30 с — 64 °С 15 с; далее 45 циклов 94 °С 10 с — 64 °С 15 с и хранение.

В состав реакционных смесей входили олигонуклеотиды, специфичные в отношении мРНК, не амплифицирующие с матриц геномной ДНК, фланкирующие ампликоны размером до 100–120 п.н., что важно при работе с ДНК после фиксации в формалине. Детекцию продуктов амплификации осуществляли при температуре отжига праймеров за счет использования флуоресцентно-меченных TaqMan проб (Fam, Cy5).

По завершении амплификации уровень представленности транскриптов рассчитывали методом сравнения индикаторных циклов (метод ∆Ct) с нормировкой относительно референсных генов B2M, GUSB, HPRT1. Данные представлены в относительных единицах (о.е.) в ln-шкале.

Для лучшего восприятия результатов исследования было рассчитано соотношение уровня экспрессии до терапии к уровню экспрессии после терапии (R) по формуле: R = Eb/Ea, где Eb — нормированный уровень экспрессии до терапии, Eа — нормированный уровень экспрессии после терапии. R > 1 расценивали как снижение экспрессии, R < 1 — как повышение экспрессии.

Статистические методы

Полученные результаты представлены в виде Ме [1Q–3Q] (медиана, 1-й и 3-й квартили). При сравнении транскрипционных профилей генов до и после терапии ингибиторами ароматазы использовали Т-критерий Уилкоксона для сравнения двух зависимых выборок. Критерий статистической значимости результатов принимали во внимание при значении р < 0,01. Расчет проводили с помощью программы статистической обработки результатов SPSS 17 (IBM, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование включено 100 пациенток РМЖ в возрасте 49–84 лет (63,3 [51–79]). Патоморфологическая характеристика опухолей представлена в табл. 1.

Размеры опухоли менее 2 см были зарегистрированы в 75% случаев. У 2/3 (76%) пациенток метастазы в региональные лимфатические узлы не были диагностированы. Во всех случаях заболевания отсутствовали отдаленные метастазы.

Среди гистологических вариантов преобладал неспецифический вариант — 65 (65%). В исследование включено 18% образцов с низкой степенью злокачественности (G1), 74% — с умеренной (G2) и 8% — с высокой степенью (G3).

При определении подтипа РМЖ методом ИГХ в 44 (44%) случаях был диагностирован люминальный А подтип и в 56 случаях (56%) — люминальный В Her2-негативный подтип опухоли.

После применения ингибиторов ароматазы в качестве предоперационного теста на гормоночувствительность в исследуемых образцах опухолей определены статистически значимые изменения в экспрессии мРНК 37 генов, из них снижение уровня экспрессии установлено для 35 генов (ESR1, PGR, AR, ERBB2, FGFR4, MKI67, MYBL2, CCNB1, AURKA, BIRC5, CCND1, CCNE1, CDKN2A, KIF14, PPP2R2A, PTTG1, TMEM45B, TPX2, ANLN, MMP11, CTSL2, EMSY, PAK1, BCL2, BAG1, PTEN, TYMS, EXO1, UBE2T, NAT1, SCGB2A2, GATA3, FOXA1, ZNF703, CD274/PD-L1), повышение для двух генов SFRP1 и KRT5 (табл. 2).

На рисунок представлены результаты по пяти маркерам пролиферации, рецепторам эстрогена и прогестерона, уровень которых снизился после терапии.

Статистически значимое снижение экспрессии выявлено в группе маркеров пролиферации и регуляции клеточного цикла. Наиболее выраженные изменения отмечены для генов MYBL2, AURKA, PTTG1, TPX2, ANLN, для которых снижение экспрессии наблюдали у 96–97% женщин в среднем от 3,5 до 5,5 раз.

Статистически значимое снижение экспрессии наблюдали также:

• в группе маркеров миграции клеток и организации цитоскелета, наиболее выраженное снижение наблюдали для MMP11 у 94% женщин в среднем 3,4 раза (интерквартильный размах 1,9–6,3);
• в группе маркеров репарации ДНК, наиболее выраженное снижение выявлено для EXO1 у 96% женщин в среднем 6,4 раза (интерквартильный размах 3,1–15,3);
• в группе факторов транскрипции, наиболее выраженное снижение выявлено для ZNF703 у 97% женщин в среднем 6,6 раза (интерквартильный размах 2,9–12,6);
• в группе гормональных рецепторов отмечено снижение уровня экспрессии мРНК гена ESR1 у 84% женщин в среднем в 2,3 раза, однако наиболее выраженное снижение выявлено для генов PGR и AR более чем в 2 раза и более чем у 90% женщин;
• для несгруппированных маркеров гена убиквитинирования белков UBE2T и гена ариламин-N-ацетилтрансферазы NAT1 более чем у 90% женщин.

Чуть менее впечатляющее, но статистически значимое снижение экспрессии наблюдали для маркеров апоптоза (BCL2, BAG), рецепторов ростовых факторов (FGFR4, ERBB2), секреторного белка маммоглобин SCGB2A2 и PTEN.

Статистически значимое повышение экспрессии отмечено для маркера дифференцировки эпителиальных клеток цитокератина KRT5 и супрессора опухолей SFRP1: более чем у половины пациенток, в 67% и в 57% случаев соответственно.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Эстрогенпозитивные или люминальные опухоли молочной железы составляют до 70–75% всех случаев РМЖ [1, 2], а ESR1-зависимые сигнальные пути, регулируемые эстрогенами, играют одну из ключевых ролей в опухолевой прогрессии.

Основу современных представлений о механизме действия стероидных гормонов заложила теория E. V. Jensen, предложившего модель действия гормона. В рамках этой модели молекула стероидного гормона, проникая внутрь клетки-мишени, связывается со специфическим рецептором, затем образовавшийся гормон-рецепторный комплекс транслоцируется в клеточное ядро, где взаимодействует со специфическими последовательностями ДНК и изменяет экспрессию соответствующих генов [9].

Рецептор ESR1 является фактором транскрипции, активируемым эстрогенами. Как фактор транскрипции, ESR1 регулирует экспрессию генов, участвующих в клеточных циклах, пролиферации и апоптозе. Активация ESR1 запускает экспрессию таких факторов, как MYC, Cyclin D1, FOXM1, GREB1, BCL2 или амфирегулин, IGF-1 и CXCL12, которые обладают онкогенным потенциалом, увеличивая пролиферацию раковых клеток [2]. Полагают, что лиганд-активированный ESR1 связывается с эстрогенчувствительными элементами (ERE, estrogen responsive element) в промоторах целевых генов, также ESR1 может взаимодействовать с факторами транскрипции, такими как активаторный белок 1 (AP1) и специфический белок 1 (SP1). Таким образом, это геномное действие регулирует транскрипцию сотен целевых генов, участвующих в росте и дифференцировке клеток [2, 10].

ESR1 также может быть встроен в цитоплазматическую мембрану клеток в специальном углублении (кавеоле) и взаимодействовать с G-белками, участвуя таким образом в продукции вторичных мессенджеров (цАМФ) и стимуляции различных сигнальных путей, например, PI3K/AKT или Ras/MAPK. Эта негеномная активность ERα в итоге приводит к активации факторов транскрипции, участвующих в регуляции пролиферации и выживания клеток [2, 10].

Поэтому не вызывает сомнения, что отсутствие или снижение количества лиганда ESR1 (эстрогенов) при терапии ингибиторами ароматазы приводит к такому впечатляющему снижению экспрессии мРНК большого числа генов. Согласно полученным результатам, статистически значимое снижение экспрессии мРНК отмечено для факторов транскрипции GATA3, FOXA1, ZNF703, апоптоза BCL2, BAG1, пролиферации и регуляции клеточного цикла (MKI67, MYBL2, CCNB1, AURKA, BIRC5, CCND1, CCNE1, CDKN2A, KIF14, PPP2R2A, PTTG1, TMEM45B, ANLN, TPX2). В условиях снижения пролиферативной активности также снижается экспрессия маркеров репликации и контроля репарации ДНК (TYMS, EXO1), маркеров организации цитоскелета и миграции клеток (MMP11, CTSL2, EMSY, PAK) и убиквитинирования белков UBE2T.

Интересно, что в другом исследовании при атипичной гиперплазии молочной железы наблюдалось повышение экспрессии мРНК генов, включенных в нашу панель, таких как ESR1, AR, рецептора эпидермального фактора роста ERBB2, транскрипционных факторов FOXA1, GATA3, ZNF703, а также снижение цитокератина KRT5 и супрессора опухолей SFRP1 [11]. Данные изменения авторы связали с активацией сигнальных путей, задействованных в онкогенезе.

В нашем исследовании после терапии ингибиторами ароматазы получены данные о снижении экспрессии мРНК генов ESR1, AR, FOXA1, GATA3, ZNF703, ERBB2 и о повышении экспрессии мРНК генов KRT5 и SFRP1, что может быть свидетельством позитивного влияния проводимой терапии на сигнальные пути, задействованные в онкогенезе.

Только для двух маркеров KRT5 и SFRP1 в нашем исследовании отмечено статистически значимое повышение экспрессии. Высокая экспрессия гена цитокератина KRT5 характерна для базального эпителия молочной железы. Люминальный эпителий экспрессирует цитокератины KRT8 и KRT18 [2].

В настоящее время общепринято представление о том, что главным физиологическим регулятором экспрессии ядерных рецепторов в организме является концентрация циркулирующих стероидных гормонов. Эстрогены усиливают синтез собственных рецепторов, а также рецепторов прогестерона и рецепторов андрогенов [10]. Поэтому снижение экспрессии мРНК гена ESR1, а также PGR и AR на фоне проводимой терапии было прогнозируемым. Нужно отметить, что при проведении исследования в первую очередь мы обратили внимание на снижение экспрессии прогестеронового рецептора, даже в большей степени, чем ESR1.

Экспрессию мРНК гена PGR напрямую регулирует активированный эстрогеновый рецептор. Некоторые авторы даже рассматривают PGR как индикатор функциональности ESR1 [12]. Поэтому на фоне снижения эстрогенов и транскрипционной активности гена ESR1 экспрессия мРНК гена PGR также снижается.

ВЫВОДЫ

Применение ингибиторов ароматазы в предоперационном тесте на гормоночувствительность сопровождается статистически значимыми изменениями в экспрессии мРНК 37 генов, из них снижение уровня экспрессии мРНК установлено для 35 генов (MKI67, MYBL2, CCNB1, AURKA, BIRC5, CCND1, CCNE1, CDKN2A, KIF14, PPP2R2A, PTTG1, TMEM45B, TPX2, ANLN, ESR1, PGR, AR, ERBB2, FGFR4, MMP11, CTSL2, EMSY, PAK1, BCL2, BAG1, GATA3, FOXA1, ZNF703, TYMS, EXO1, PTEN, UBE2T, NAT1, SCGB2A2, CD274), повышение для 2 генов (KRT5 и SFRP1). Полученные результаты могут быть использованы при дальнейшей разработке способов оценки эффективности теста на гормоночувствительность и персонификации адъювантной системной терапии больных раком молочной железы.