Иммунозахват на основе специфических антител является ключевым этапом во многих лабораторных иммунологических методах исследований. Традиционно для реализации данного метода используют полистироловые микропланшеты, которые обеспечивают возможность одновременной обработки множества образцов. Полистирол, как правило, обладает способностью пассивно (неспецифически) иммобилизировать на своей поверхности практически любые крупные молекулы, имеющие доступные гидрофобные участки, например антитела [1]. Однако этот материал подвержен деформации при температурах выше +70 °С (а при длительном нагреве — выше +60 °С) [2]. Это серьезный технический недостаток при использовании дополнительных молекулярногенетических этапов анализа, таких как термическая экстракция нуклеиновых кислот и термоциклирование (например, в реакции иммуно-ПЦР [3]), органичивающий широкое практическое применение таких методов. Предложенные в качестве альтернативы полистироловым планшетам собирающиеся в 96-луночный планшет стрипованные пробирки из поликарбоната устойчивы к нагреванию и обладают высокой сорбционной способностью [4].

Тем не менее, применение планшетов имеет высокий риск перекрестной контаминации [5, 6]. Этот риск может нивелироваться различными методическими подходами, например, использованием автоматизированных систем пробоподготовки. Применение классических для молекулярно-генетических исследований полипропиленовых пробирок потенциально могло бы снизить риск контаминации при работе по принципу «одной открытой пробирки». Однако использование пробирок ограничивается низкой сорбционной способностью полипропилена к белкам, в том числе к антителам [7], что препятствует их применению для высокочувствительных методов, к которым относится иммуно-ПЦР, требующих стабильной иммобилизации антител иммунозахвата [4].

Развитие таких методов, как иммуномолекулярные реакции, может значительно повысить чувствительность и специфичность молекулярно-генетических исследований, что особенно важно для диагностики и мониторгина вирусных инфекций с высокой мутационной изменчивостью патогена, таких как вирус SARS-CoV-2 [8]. Следует отметить, что такие реакции до настоящего времени не получили широкого практического применения. Исследования возбудителя COVID-19 с применением иммуно-ПЦР до настоящего времени в научной литературе описаны не были. Вероятно, это связано со сложностью дизайна и постановки этапов реакции. Поэтому для успешного практического применения таких комбинированных подходов необходима оптимизация их ключевых компонентов с преодолением технологических ограничений, присущих существующим форматам реакций [4, 9].

В связи с этим нами предложено оригинальное покрытие полипропиленовых пробирок полистиролом. Это решение позволяет комбинировать преимущества обоих материалов: высокую сорбционную способность полистирола и термостойкость полипропилена при снижении риска перекрестной контаминации.

Целями исследования стали разработка метода простого получения и продемонстрированная на примере SARSCoV-2 апробация новых пробирок для иммунозахвата, обеспечивающих эффективную иммобилизацию первичных антител, предназначенных для универсального применения в молекулярно-генетических исследованиях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы SARS-CoV-2 и антитела

В качестве антигена использовали охарактеризованные образцы положительного контроля штамма ГК2020/1 (идентификатор GISAID: EPI_ISL_421275, вариант B.1.1.1, Ухань) и штамма hCoV-19/Russia/MOW-PMVL-51/2021 (идентификатор GISAID: EPI_ISL_12748382, вариант B.1.1.529+BA.* генетической линии Омикрон) коронавируса SARS-CoV-2, химически инактивированные при помощи глутарового альдегида в конечной концентрации 0,01% с последующей инкубацией при +4 °С в течение 24 ч.

Для исследования эффективности иммобилизации первичных антител (иммунозахвата) использовали экспериментальные моноклональные антитела к RBD спайк-белка коронавируса P2C5 (получены в лаборатории иммунобиотехнологии ФГБУ «НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи» Минздрава России), имеющие наиболее широкий спектр действия, охватывающий в том числе некоторые варианты линии Омикрон [10]. Кроме того, были протестированы моноклональные антитела R107 («Хайтест», Россия), обладающие специфичной активностью преимущественно к RBD вируса варианта B.1.1.1.

Исследование эффективности иммунозахвата с использованием полистироловых планшетов для ИФА

Для оптимизации процесса иммобилизации антител использовали 96-луночные плоскодонные полистироловые иммунологические планшеты FEP-101-896 (Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd., Китай). В каждую лунку планшета вносили по 100 мкл антител в концентрации 10 мкг/мл, растворенных в 0,5 М карбонатном буфере (pH = 9,5), заклеивали планшеты пленкой и инкубировали при температуре +37 °С в течение 30 мин. В качестве блокирующего буфера применяли по 100 мкл фосфатносолевого буфера (ФСБ, pH = 7,4) с добавлением 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) с инкубированием при +37 °С в течение 30 мин. Промывочный буфер состоял из ФСБ (pH = 7,4) с добавлением 0,05% Твин-20.

После промывки лунок, выполненной трехкратно по 300 мкл с инкубированием в течение 45 с, в них вносили 50 мкл инактивированных предварительно разведенных в ФСБ до концентрации 1 × 10⁶ копий/мл образцов SARSCoV-2 и инкубировали при +37 °С в течение 30 мин. Затем проводили отмывку, выделение РНК с использованием набора РИБО-преп (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и постановку количественной ОТ-ПЦР.

Выделение РНК осуществляли по модифицированному протоколу производителя: в лунки полистиролового планшета вносили по 50 мкл буфера TE, добавляли 155 мкл лизирующего раствора, заклеивали лунки пленкой для ИФА-планшетов и инкубировали при +65 °С в течение 10 мин. Затем переносили содержимое лунок полистироловых планшетов в микропробирки и дальнейшие этапы выделения РНК выполняли в соответствии с инструкцией производителя. Постановку количественной ОТ-ПЦР проводили с использованием набора реагентов «SARS-CoV2-ПЦР» («Медипалтех», Россия) в сочетании с образцами химически инактивированного штамма ГК2020/1 в качестве калибратора. Все эксперименты проводили в десятикратной повторности (n = 10).

Исследование иммунозахвата с использованием модифицированных микропробирок

В качестве компонентов для изготовления модифицированных микропробирок использовали стерильные микропробирки из прозрачного полипропилена, свободные от ДНКаз и РНКаз, объемом 1,5 мл (SPINWIN Tarsons, Индия) и растворенный в ацетоне полистирол из иммунологических планшетов FEP-101-896 (Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd., Китай). Раствор полистирола вносили асептически на дно пробирок в объеме 50 мкл и высушивали в вытяжном шкафу. Механическую стабильность полученного слоя полипропилена оценивали визуально после перемешивания внесенного 1 мл воды на вортексе при 2500 об./мин в течение 2 мин, путем двадцатикратного пипетирования с касанием наконечником пипеткидозатора дна микропробирки и центрифугирования при 15 000 g в течение 15 мин. В модифицированные таким образом микропробирки вносили 100 мкл антител в карбонатном буфере (10 мкг/мл) и инкубировали при +37 °С в течение 30 мин с закрытыми крышками. После блокировки остаточной свободной от антител поверхности ФСБ с добавлением 2% БСА и промывки (аналогично планшетам) образцы SARS-CoV-2 вносили в объеме 50 мкл. Дальнейшие отмывку, выделение РНК и постановку ОТ-ПЦР выполняли так же, как при использовании полистироловых планшетов. Все этапы выделения РНК проводили в модфицированных микропробирках.

В качестве контроля использовали немодифицированные полипропиленовые пробирки. Все эксперименты проводили в десятикратной повторности (n = 10).

Исследование перекрестной контаминации

Для оценки перекрестной контаминации образцы штаммов ГК2020/1 (вариант B.1.1.1) и hCoV-19/Russia/MOWPMVL-51/2021 (Омикрон) по 50 мкл вносили в шахматном порядке в 96-луночные планшеты и модифицированные пробирки с иммобилизированными антителами P2C5. После инкубации, промывки и выделения РНК проводили генотипирование при помощи ОТ-ПЦР. Для выявления штамма ГК2020/1 проводили сиквенсспецифическую ОТ-ПЦР с оригинальными праймерами Wu_fw1mod 5'-CGTGGTTCCATGCTATACATG-3' и Wu_rv1mod 5'-CGTCCCTGTGGTAATAAACAC-3' в готовой реакционной смеси OneTube RT-PCR SYBR («Евроген», Россия) с детекцией в реальном времени по каналу SYBRGreen. Выявление штамма генетической линии Омикрон проводили с использованием набора реагентов АмплиТест SARS-CoV-2 VOC v.3 (ФГБУ «ЦСП» ФМБА России, Россия) согласно инструкции производителя. Для эксперимента использовали три планшета и 288 пробирок. Эксперимент проводили в ламинарном потоке воздуха в боксе микробиологической безопасности класса II типа A2 («Ламинарные системы», Россия).

Статистический анализ

Данные анализировали с помощью программного обеспечения GraphPad PRISM v.10.4.0 (Graphpad Software, Inc., США). Оценку распределения проводили с использованием теста Шапиро–Уилка. Для множественных сравнений параметрических данных применяли двусторонний метод ANOVA с тестом аддитивности Тьюки и уровнем значимости различий p < 0,05 (доверительный интервал (95%).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Модифицированные микропробирки

Полипропиленовая микропробирка после модификации полистиролом представлена на рис. 1. Полученные модифицированные микропробирки были механически стабильны при перемешивании как на вортексе, так и путем пипетирования. Центрифугирование тоже не оказывало заметного влияния на целостность слоя полистирола.

Иммунозахват инактивированного SARS-CoV-2

При использовании штамма ГК2020/1 (вариант B.1.1.1) в качестве антигена эффективный иммунозахват был выявлен как для антител P2C5, так и для антител R107 (рис. 2). Количество связанного антителами вируса оказалось достоверно выше при использовании модифицированных пробирок по сравнению с полистироловыми планшетами (p < 0,0001). Количество копий РНК SARS-CoV-2 в контрольных группах с использованием БСА было достоверно ниже количества, выявленного в группах с антителами при использовании как планшетов, так и модифицированных пробирок. При применении пробирок без покрытия определялось одинаково низкое количество РНК коронавируса (p > 0,05) во всех группах, что свидетельствует об отсутствии специфического иммунозахвата антигена независимо от применения антител.

При использовании штамма hCoV-19/Russia/MOWPMVL-51/2021 (генетическая линия Омикрон) эффективный иммунозахват наблюдали только для антител P2C5 (рис. 3). Антитела R107, специфичные к RBD преимущественно вируса SARS-Cov-2 варианта Ухань, не показали значительного отличия от контрольной группы с БСА. Таким образом, штамм линии Омикрон продемонстрировал способность ускользать от нейтрализующих антител R107, что соответствует данным других исследователей о снижении эффективности некоторых моноклональных антител против новых вариантов SARS-CoV-2 [11, 12]. Модифицированные пробирки обеспечивали лучшие результаты, чем полистироловые планшеты, как для линии B.1.1.1, так и для линии Омикрон.

Перекрестная контаминация

Перекрестная контаминация была обнаружена в 14 из 288 образцов при использовании полистироловых планшетов (рис. 4). Контаминация выявлялась как смешение РНК штаммов ГК2020/1 и hCoV-19/Russia/MOW-PMVL-51/2021, что подтверждает риск переноса материала между лунками в таких условиях. В модифицированных пробирках перекрестной контаминации не было выявлено.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные результаты показывают, что модифицированные полипропиленовые пробирки с полистироловым покрытием обладают значительными преимуществами по сравнению с традиционными полистироловыми планшетами, включая снижение риска перекрестной контаминации и улучшение эффективности иммунозахвата. Эти данные согласуются с исследованиями, демонстрирующими, что полистироловые планшеты являются хорошим материалом для иммобилизации антител, но их использование ограничено из-за слабой устойчивости к высоким температурам и рисков контаминации [2, 5, 6].

Различия в эффективности антител P2C5 и R107 при работе с разными штаммами SARS-CoV-2 соответствуют данным о значительных мутациях в RBD линии Омикрон, которые снижают эффективность антител, специфичных варианту B.1.1.1 (Ухань) вируса [13, 14]. Предполагается, что такие мутации приводят к конформационным изменениям RBD, что препятствует связыванию антител, как это ранее описывалось для антител первого поколения против SARS-CoV-2 [15]. Высокая эффективность P2C5, охватывающих широкий спектр вариантов, включая Омикрон, подтверждает их универсальность и актуальность для мониторинга новых штаммов.

Отсутствие перекрестной контаминации в модифицированных пробирках можно объяснить отсутствием непосредственного контакта между образцами и минимизацией аэрозольного переноса. Аналогичные выводы были сделаны в исследованиях, где использовали другие замкнутые системы для молекулярной диагностики [16].

Несмотря на положительные результаты, требуется дальнейшая оптимизация условий иммобилизации антител и выделения РНК для повышения воспроизводимости метода при использовании модифицированных пробирок. Кроме того, для широкого применения пробирок необходимо провести тестирование на других патогенах, чтобы подтвердить универсальность метода. Дальнейшие исследования и усовершенствования пробирок могут быть также проведены по следующим направлениям: изучение пригодности и сочетаемости полипропилена и полистирола различных марок; снижение неспецифического сигнала за счет применения пробирок из полипропилена с низкой адгезивной способностью; автоматизация процесса нанесения полистирола.

В целом, модифицированные пробирки представляют собой перспективную основу для комбинированных иммунологических и молекулярно-генетических исследований, требующих высокой чувствительности и точности, особенно в условиях высокой изменчивости патогенов, таких как SARS-CoV-2.

ВЫВОДЫ

Модифицированные полипропиленовые пробирки с полистироловым покрытием показали высокую эффективность иммунозахвата и отсутствие перекрестной контаминации, превосходя традиционные полистироловые планшеты. Эти результаты подтверждают достижение целей исследования. Антитела P2C5 продемонстрировали универсальность против различных линий SARS-CoV-2, включая Омикрон, что делает их перспективными для диагностики новых вариантов возбудителя COVID-19. Дальнейшие исследования должны быть направлены на тестирование пробирок с другими патогенами и улучшение их функциональных характеристик. Возможные направления применения модифицированных полипропиленовых пробирок с полистироловым покрытием включают клиническую диагностику и разработку высокочувствительных методов для поиска, селекции и выявления вирусов.