Ионизирующее излучение оказывает влияние на человеческую жизнь повсюду: медицинские диагностические процедуры, использование воздушного транспорта, действие природного ионизирующего излучения в местах с повышенным фоновым уровнем радиации. Помимо спланированного и контролируемого воздействия излучения, существует также незапланированное воздействие в результате случайных аварийных ситуаций с источниками ионизирующего излучения. Изучение механизмов влияния радиации на здоровье человека является важной и актуальной задачей.

Более 60 лет назад на Южном Урале более 100 тыс. человек подверглись кумулятивному хроническому облучению в широком диапазоне доз. Поступление радионуклидов ^89,90Sr с пищей и водой обусловило внутреннее облучение, а внешнее сформировалось от поверхности речной воды, куда осуществляли сбросы жидких радиоактивных отходов (γ-облучение). В результате длительного наблюдения за облученными на Южном Урале людьми были отмечены изменения в состоянии многих систем организма [1, 2].

Влияние ионизирующего излучения на процесс формирования хромосомных перестроек доказано многочисленными исследованиями. Структура ДНК в клетке нарушается из-за воздействия ионизирующего излучения с образованием соединений, способных повреждать ДНК. К таким соединениям относят, например, активные формы кислорода, продукты перекисного окисления липидов и др. В результате возникают разрывы межатомных связей в сахаро-фосфатном остове, что ведет к нарушению непрерывности молекулы ДНК. При отсутствии или при недостаточной репарации они могут стать инициирующим событием на пути к старению и онкогенезу [3, 4]. Разрывы бывают одноцепочечные (если разорвана одна цепь ДНК) и двухцепочечные (если разорваны обе цепи).

За поддержание стабильности хромосом и генома в клеточном ядре отвечают повторяющиеся нуклеотидные последовательности — теломеры. Изучение теломерных районов хромосом человека — актуальная научная задача в связи с доказанным участием теломер в таких процессах, как старение, онкотрансформация клеток. Ряд генетических заболеваний связан с изменениями в теломерных участках хромосом.

В проведенных ранее исследованиях теломерных районов хромосом с использованием метода флуоресцентной in situ гибридизации FISH (от англ. fluorescence in situ hybridization) были выявлены качественные изменения хроматина у облученных лиц. Было отмечено, что внутри хромосомных плеч наблюдались теломерные сигналы, что является результатом инверсий с вовлечением теломерных районов [5]. Показано также статистически значимое снижение длины теломер у облученных лиц в некоторых хромосомных плечах по сравнению с необлученными [6]. Во время исследований обратил на себя внимание тот факт, что не все метафазные хромосомы в клетке имеют четыре теломеры на концевых участках, у части хромосом теломерный участок вообще не визуализируется.

Потеря теломерных участков может возникать как изза постепенного укорочения теломер во время деления клеток, так и в результате стохастических событий, при которых теломерные повторяющиеся последовательности теряются, например, после терминальной делеции или двухцепочечного разрыва в субтеломерной области [7]. Некоторые исследования опухолевых клеточных линий показывают, что такие cпонтанные делеции теломер характерны для раковых клеток [8, 9].

Для эволюции человека потеря теломерных участков имеет важное значение. Многие генетические заболевания возникают в результате изменений вблизи концов хромосом, например, умственная отсталость и мышечная дистрофия [10]. Кроме того, у женщин с бесплодием выявлена значительно более выраженная потеря теломер, чем у пациенток контрольной группы [11].

Влияние ионизирующего излучения также может стать причиной потери теломерных участков хромосом. Механизм этого действия остается обсуждаемым вопросом среди ученых и не имеет однозначного ответа. Из-за того что на долю теломер приходится всего 0,02% от генома человека, маловероятно прямое действие радиации, вследствие которого произойдет разрыв хроматиды и потеря теломерного участка. Анализ литературы дает основание полагать, что влияние активных форм кислорода может приводить к образованию модифицированных оснований и к разрывам отдельных цепей ДНК, в том числе в теломерных участках [12]. Богатые гуанином теломерные последовательности ДНК (-TTAGGG-) становятся мишенью для окислительного повреждения, ведь именно гуанин обладает самым низким окислительно-восстановительным потенциалом из всех азотистых оснований. Гуанин легко окисляется до 8-оксогуанина, который принято считать одним из основных биомаркеров окислительного стресса [13]. Одноцепочечные разрывы в G-богатых цепях плохо восстанавливаются и дольше сохраняются в теломерах [14]. Под действием ионизирующего излучения вблизи теломер могут возникать двухцепочечные разрывы, что может привести к хромосомным перестройкам. Это один из механизмов репликативного старения нормальных клеток человека, вызванного ионизирующим излучением. Клеточные изменения, влияющие на эффективность механизма репликации ДНК, могут способствовать остановке репликационных вилок в теломерах и потере теломер [15].

Существуют также исследования, в которых отмечается, что потери теломерного участка в хромосоме могут появиться в результате действия различных белков, например, TZAP (от англ. telomeric zinc finger associated protein) с одиннадцатью цинковыми пальцами, который способен специфически связываться с теломерами хромосом и обрезать их [16].

Применение FISH и локусспецифичных зондов позволяет выявлять изменения в теломерных участках хромосом. Потеря теломерных участков может затрагивать как одно плечо, так и оба (хромосомная потеря теломерных участков на сестринских хроматидах).

Цель пилотного исследования — оценить потери теломерных участков хромосом в лимфоцитах периферической крови с применением метода флуоресцентного окрашивания у женщин, облученных на реке Теча. 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Характеристика обследованных лиц

Так как исследование потерь теломерного участка было пилотным и проводилось в ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА России впервые, было принято решение ограничить группы по половому признаку, и на начальном этапе оценить исследуемый эффект только у групп женщин. Критерии включения: женщины, проживавшие на загрязненных радионуклидами территориях, 1939–1959 гг. рождения, подвергшиеся хроническому радиационному воздействию в широком диапазоне доз: женщины из группы сравнения, которые аварийному облучению не подвергались. 

Информация о выборке и состоянии здоровья облученных лиц была предоставлена отделом «База данных "Человек"». Индивидуализированные суммарные дозы от внешнего и внутреннего облучения (далее — дозы облучения) на ККМ были рассчитаны по системе TRDS2016 в биофизической лаборатории [17]. Данные о наличии онкопатологии в анамнезе обследуемых женщин были предоставлены эпидемиологической лабораторией ФГБУН УНПЦ РМ. Критерии исключения из исследования: наличие в анамнезе аутоиммунных, онкологических, хронических воспалительных заболеваний в фазе обострения; прием в анамнезе цитостатиков, антибиотиков, дата рождения после 1961 г.

Было обследовано 32 женщины. Группу сравнения (далее — группа 1) составили 10 человек, шесть из них имели дозу на ККМ от 0,0001 до 0,01 Гр, а четыре аварийному облучению не подвергались. 10 женщин подверглись хроническому радиационному воздействию в дозах 0,2–0,9 Гр (далее — группа 2), средняя доза 0,64 ± 0,21 Гр. В группу высокодозовых облученных (далее — группа 3) были включены 12 женщин с кумулятивной дозой на ККМ более 1 Гр, так как именно при высоких дозах наиболее часто проявляются цитогенетические эффекты [1]. Диапазон — 1,01–4,6 Гр, средняя доза — 1,7 ± 0,9 Гр (табл. 1).

Получение препаратов метафазных хромосом Т-лимфоцитов периферической крови

Цитогенетическое исследование проводили на метафазах Т-лимфоцитов периферической крови, стимулированных фитогемагглютинином (ФГА). Препараты хромосом получали по принятому в лаборатории протоколу: проводили культивирование клеток в течение 54 ч. За 3 ч вводили колцемид в итоговой концентрации 0,1 мг/мл. Гипотоническую обработку метафазных клеток проводили за 40–50 мин до фиксации теплым 37 °С раствором KCl (0,55%). Затем смесь центрифугировали. Далее проводили фиксацию метафазных пластинок (три части этанол медицинский, 95%: одна часть — ледяная уксусная кислота) и получение препаратов хромосом [18].

В процессе раскапывания клеточной суспензии на предметные стекла для получения лучшего результата стремились свести к минимуму чрезмерное распределение и наложение хромосом, чтобы каждая метафаза была пригодна для анализа. После раскапывания клеточной суспензии предметные стекла сушили на термоплато при температуре 42 °С, затем флуоресцентно окрашивали.

Методика окраски теломерных районов методом флуоресцентной in situ гибридизации с локусспецифичными зондами (FISH)

Использовали зонды набора Telomere FISH Kit/Cy3 (Dako, Дания). Окрашивали хромосомы в соответствии с протоколом производителя зондов. Зонд окрашивает только теломерные районы хромосом и не распознает субтеломерные последовательности [19]. Для получения данного зонда производитель использует Cy3конъюгированную пептидную нуклеиновую кислоту, которая является синтетическим аналогом ДНК, и связывается с ДНК хромосом по правилам спаривания оснований.

Анализ флуоресцентно окрашенных препаратов проводили на микроскопе Axio Imager Z2 (Zeiss, Германия), фильтры DAPI и SpO, ПО Isis. Для поиска и оцифровки метафазных пластинок система Metafer была настроена таким образом, чтобы автоматически получать изображения пяти кадров для канала SpO, каждый из которых будет отличаться по высоте друг от друга на полмикрона. После того как Metafer сделал пять кадров, в фоновом режиме автоматически из каждого кадра выбираются самые контрастные участки. В результате получается итоговая фотография, где все сигналы резкие и контрастные, что повышает точность результата анализа. Таким образом, возможности программы ISIS позволяют достоверно установить отсутствие теломерного сигнала на любой хроматиде. Для этого оцифрованное изображение просматривается при использовании фильтров DAPI-SpO и при черно-белом инвертированном изображении интересующей хромосомы.

Потери теломерного участка в ходе анализа разделяли на два вида — хроматидные и хромосомные. Хроматидные потери определяли, если теломерный сигнал отсутствовал в одной из сестринских хроматид, а вторая не была изменена. На рис. 1 представлена пятая пара хромосом: в левой хромосоме визуализируются все четыре теломеры, в правой хромосоме видно, что один теломерный район q-плеча отсутствует. В случае отсутствия теломерных сигналов в двух сестринских хроматидах потерю считали хромосомной (рис. 2). Отсутствие двух сигналов на не парных хроматидах или на разных плечах одной хроматиды считали, как две хроматидные одиночные потери.

В анализ включали метафазы, содержащие 46 хромосом без наложений и артефактов. В каждой клетке анализировали все хромосомы. Считали 25–100 клеток для каждого донора. Данные о потере теломерных участков заносили в протокол анализа.

Статистическая обработка данных

Таким образом, исходными данными для статистического анализа стали результаты исследования 1560 клеток для 32 людей в возрасте 62–81 год, разделенные на три группы в соответствии с дозами облучения. Для каждой клетки просматривали все 46 хромосом и отмечали факт хроматидной или хромосомной потери теломерных участков для каждой из них. Анализ результатов проводили с использованием пакета программ STATISTICA 10 (StatSoft, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исходные данные, разделенные на дозовые группы, для обоих случаев потерь теломер (хроматидных и хромосомных) представлены на рис. 3. Изучаемое явление (потери теломерных участков для разных дозовых групп) не может быть представлено с помощью нормального распределения (рис. 4), поэтому для сравнения результатов наблюдений между группами использовали непараметрический критерий Манна–Уитни.

За нулевую гипотезу принимали отсутствие различий числа потерь теломер (хромосомных или хроматидных) в отдельных клетках между дозовыми группами. Было установлено, что хроматидные потери для группы сравнения (группа 1) и группы с высокими уровнями облучения (группа 3) статистически не различимы (p > 0,33), в то же время группа средних доз (группа 2) статистически отличается от них (p < 0,05). Для хромосомных потерь было установлено статистически значимое различие (p < 0,05) между всеми группами. Таким образом, можно сделать вывод, что во второй группе среднее число хроматидных потерь выше и статистически значимо отличается от других групп.

На рис. 5 представлены диаграммы размаха исходных данных для каждой из групп облучения (прямоугольниками отображены 5-й и 95-й процентили, центральная точка — медиана, «усы» соответствуют максимальным и минимальным значениям), в табл. 2 — данные для каждой из исследуемых дозовых подгрупп для хроматидных потерь и хромосомных потерь: относительное содержание в клетках, медиана, процентили 5%–95%, минимум и максимум.

Потеря хотя бы одного теломерного участка встречалось в 99,85% проанализированных клеток.

Во всех группах достоверно чаще встречались потери на одной из хроматид, чем хромосомная потеря (p < 0,05).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Одна из функций теломер — обеспечение стабильности хромосомы, поэтому понимание причин изменений в теломерных областях позволит пролить свет на механизмы развития онкопатологии, генетических заболеваний человека, бесплодия а также старения организма [20]. Воздействие ионизирующего излучения на клетки человека способно вызывать изменения на уровне хроматина, например, разрывы цепей ДНК, неправильное воссоединение которых может приводить к возникновению хромосомных перестроек. Эти события приводят к перераспределению гетерохроматина по плечам хромосом, могут влиять на распределение генов на хромосомах, изменять экспрессию генов, а, значит, могут приводить к реализации различных биомедицинских эффектов, что в итоге скажется на здоровье человека [21].

Пилотный проект, представленный в настоящей статье, является частью исследования по изучению теломерных участков хромосом в лаборатории радиационной генетики УНПЦ РМ. Ранее были оценены такие показатели, как длина теломерных районов и частота инверсий с захватом теломерного участка для лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию на реке Теча [5, 6]. В ходе настоящего исследования предметом исследования были потери теломерного участка в метафазных хромосомах культивированных Т-лимфоцитов периферической крови у облученных жителей Южного Урала. Для этих целей использовали метод флуоресцентной окраски теломерных районов хромосом. Был проведен анализ влияния радиационного фактора на потери теломерных районов хромосом. Согласно полученным данным, теломерные потери присутствуют в 99,85% клеток доноров. Оказалось, что достоверно чаще во всех группах встречались потери теломерного участка на одной из хроматид. Потеря одной из сестринских теломер может возникать из-за дефектов репликации в S-стадии клеточного цикла, а хромосомная, скорее всего, в результате возникновения потери до синтетической стадии, когда хромосома представляет собой одну хроматиду, впоследствии удваивается в синтетической стадии (соответственно участок с потерей теломеры также удваивается и образуется хромосомная потеря) [22, 23]. Также низкие частоты хромосомных потерь, по сравнению с хроматидными, можно объяснить тем, что эти события реализуются с разной вероятностью. Хромосома занимает определенное пространство в ядре и в норме не пересекается с хроматином других хромосом, поэтому наиболее частые изменения будут отмечаться в пределах одной хроматиды. Лишенные теломерных районов концы плеч сестринских хроматид могут являться маркером для гибели данной клетки. То есть клетка с большим количеством теломерных потерь будет элиминирована в ходе деления для сохранения целостности генома.

В результате нашего исследования было установлено, что потери одиночных хроматид для группы сравнения и группы с высокими уровнями облучения статистически не различимы (p > 0,33), тогда как группа средних доз статистически отличается от них (p < 0,05). Для хромосомных потерь было установлено статистически значимое различие (p < 0,05) между всеми дозовыми группами. Таким образом, можно сделать вывод, что во второй группе среднее число потерь теломерных участков выше и статистически значимо отличается от других групп.

Вопреки ожиданиям, в группе женщин, подвергшихся самым высоким уровням облучения, показатели потерь теломерных участков стастистически не отличались от таковых у группы сравнения. При этом мы видим, что хроническое облучение все же оказывает влияние на количество теломерных потерь, судя по результатам, полученным для группы 2, где достоверно выше количество потерь хромосомных и хроматидных по сравнению с женщинами из группы сравнения того же возраста, проживавшими в сходных социально-экономических условиях, но не подвергавшихся действию хронического радиационного воздействия в дозах выше 0,01 Гр. Возможно, при достижении какого-то критического уровня в клетке происходит элиминация поврежденных хромосом, в результате чего показатели группы сравнения и группы доноров, облученных в дозах выше 1 Гр находятся на одном уровне и не имеют статистически значимых различий.

Такие «парадоксальные» данные на самом деле не противоречат результатам других цитогенетических исследований, где было выдвинуто предположение, что критерии отбора доноров для цитогенетических исследований могут способствовать выбору наиболее радиоустойчивых доноров среди облученных лиц, которые в пожилом возрасте не имеют ни аутоимунных, ни онкологических заболеваний, не имеют сахарного диабета, а также не принимают препараты, которые могут оказать влияние на получаемые цитогенетические результаты. Косвенным подтверждением этому служат исследования, в которых отмечалось, что у облученных лиц показатели частоты хромосомных аберраций сравнялись с рассчитанными для необлученных доноров [24].

Таким образом, понимание механизмов, ответственных за чувствительность теломерных областей к влиянию внешних факторов, позволит по-новому взглянуть на причины генетических заболеваний человека, бесплодия, старения и развития онкопатологии. Дальнейшее изучение структуры хромосом цитогенетическими методами важно для понимания взаимодействия генов друг с другом. Требуются продолжение данной работы и расширение выборки для подтверждения полученных результатов, а также для оценки влияния нерадиационных факторов.

ВЫВОДЫ

В выборке жителей Южного Урала женского пола, подвергшихся сочетанному хроническому облучению в диапазоне поглощенных доз на ККМ от 0 до 4,6 Гр, было установлено, что хроматидные потери теломер для группы сравнения и группы с высокими уровнями облучения более 1 Гр статистически не различимы (p > 0,33), в то же время группа средних доз 0,2–0,9 Гр статистически отличается от них (p < 0,05). Для хромосомных потерь установлено статистически значимое различие между всеми дозовыми группами (p < 0,05). Таким образом, во второй группе среднее число потерь теломерных участков выше и статистически значимо отличается от других групп женского пола в исследуемом возрастном диапазоне.