Пористость и плотность керамических материалов — ключевые параметры, определяющие их механические и биологические свойства. Эти характеристики играют решающую роль в разработке материалов для медицинских имплантатов.

Пористость как показатель количества пустот в материале значительно влияет на его способность взаимодействовать с окружающими тканями [1]. Высокая пористость улучшает биологическую совместимость, создавая условия для инвазии остеогенных клеток и формирования кровеносных сосудов в структуре имплантата [2]. Этот процесс, известный как остеоинтеграция, критически важен для успешного приживления имплантатов. Кроме того, высокая пористость способствует свободной циркуляции биологических жидкостей, что восстанавливает метаболизм в окружающих тканях и ускоряет процесс регенерации кости [3].

Однако высокая пористость имеет недостатки. Она снижает механическую прочность имплантатов, что особенно критично в условиях высоких циклических нагрузок, например, на опорных поверхностях суставов или позвоночнике. В то же время низкая пористость может затруднять остеоинтеграцию, ограничивая развитие костной ткани и замедляя процесс заживления [4].

Плотность отражает степень уплотнения материала и может влиять на механические свойства, такие как прочность, модуль упругости, ударная вязкость, износостойкость, предел текучести и усталость. Материалы с высокой плотностью обычно обладают высокой прочностью, так как в них атомы расположены более плотно, что обеспечивает более сильные межатомные связи. Это делает такие материалы устойчивыми к механическим воздействиям. В то же время монолитность небиологических материалов, обладающих высокой прочностью, не позволяет клеткам проникать в объем материала биоинженерных конструкций и, тем самым, может негативно повлиять на биологическую совместимость имплантатов, затрудняя остеоинтеграцию. Для получения управляемых механических свойств имплантов в ряде случаев прибегают к созданию композитных изделий на основе уже изученных и применяемых материалов [5]. Применение композитов и композитных покрытий, представляющих собой смесь исходного металла и биорезорбируемого материала, позволяет не только получить пористую структуру, постепенно заселяемую клетками организма, но и предоставить структурную матрицу для роста костной ткани [6].

Материалы на основе гидроксиапатита (ГА), трикальцийфосфата (ТКФ) и консервированного костного аллографта демонстрируют уникальное сочетание механических и биологических свойств, что делает их незаменимыми в реконструктивной и регенеративной медицине. Их пористость играет критическую роль в процессе остеогенеза, создавая оптимальную среду для формирования новой костной ткани и интеграции имплантата с костной структурой. Поверхности керамических имплантов из ГА и ТКФ обладают выраженными остеокондуктивными свойствами и создают оптимальные условия для адгезии и пролиферации остеогенных клеток. В отличие от костных алло- и ксеноимплантатов, керамика не содержит биологически активных факторов, индуцирующих остеогенез, однако ее микропористая структура способствует формированию костной ткани за счет пассивной остеокондукции. Остеоиндукция керамики обеспечивается за счет постепенного высвобождения ионов кальция и фосфатов в окружающую среду, что стимулирует пролиферацию остеобластов и дифференцировку мезенхимных стволовых клеток. Кроме того, механические свойства пористых керамических имплантатов играют важную роль в регенерации костной ткани, обусловливая структурную поддержку для формирования новой кости и васкуляризации. Оптимальный размер пор (100–300 мкм) обеспечивает благоприятные условия для адгезии остеогенных клеток и васкуляризации [7, 8]. В частности, поры оптимальных размеров улучшают взаимодействие материала с костной тканью, что создает условия для формирования новой кости [9].

Остеоиндуктивные свойства материалов характеризуют их способность стимулировать образование новой костной ткани. Биокерамика на основе гидроксиапатита или трикальцифосфата является высокобиосовместимой и обладает хорошими остеокондуктивными свойствами, создает структуру, способствующую росту костной ткани по ее поверхности. Но керамика, как правило, не обладает выраженными остеоиндуктивными свойствами, как некоторые другие материалы, и действует скорее, как каркас для костной ткани, обеспечивая механическую поддержку. Аллогенные имплантаты, полученные от доноров того же вида, часто имеют выраженные остеоиндуктивные и остеокондуктивные свойства. Изделия из этого материала могут включать как минерализованные, так и деминерализованные компоненты, и именно деминерализованные костные аллоимплантаты имеют более выраженные остеоиндуктивные свойства. Ксеноимплантаты, полученные от животных, также могут обладать остеокондуктивными свойствами, но их остеоиндуктивность ограничена. Из-за различий в клеточных компонентах и белках ксеноимплантаты могут не всегда эффективно взаимодействовать с человеческой костной тканью, что ограничивает их остеоиндуктивный потенциал по сравнению с аллоимплантатами. При этом они могут быть использованы для замещения костной ткани в определенных ситуациях, но с более ограниченными возможностями для стимуляции роста новой кости [10].

Особую роль в обеспечении безопасности и эффективности использования медицинских устройств и имплантатов играет выбор оптимального метода стерилизации. В медицинском арсенале имеется множество методов стерилизации, каждый из которых оказывает различное воздействие на имплантируемые биоматериалы. Физические методы включают тепловую стерилизацию, фильтрацию и применение излучения. Химические методы основаны на использовании химических агентов для уничтожения микроорганизмов. К ним относят газовую и жидкостную стерилизацию [11, 12]. Высокую эффективность показывают комбинированные методы — плазменная стерилизация с применением газообразной перекиси водорода и плазмы, а также стерилизация ультрафиолетовым методом в кислороде [13, 14]. 

Проводившиеся ранее исследования стерилизации пористых биокерамических материалов показали влияние стерилизации на физико-химические свойства имплантов, но не сравнивают биологический эффект различных видов стерилизации для пористых керамических имплантов [11, 15]. 

Данное исследование ставит своей целью определение цитотоксичности керамических образцов с пористой структурой после проведения наиболее распространенных методов стерилизации для дальнейшего улучшения материалов и технологии производства керамических имплантов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Изготовление образцов

Подготовка цифровой модели

На первом этапе геометрию образцов разрабатывали в программном обеспечении Компас-3D («АСКОН-Системы проектирования», Россия). Образцы проектировали в виде цилиндров с диаметром 4 мм и высотой 2 мм. Размеры образцов были адаптированы под стандартные планшеты, которые использовали для проведения MTT-теста (methylthiazolyl-tetrazolium), что обеспечило полное соответствие их геометрических параметров нормативным требованиям тестирования. Усадка на этапе термообработки и отжига связующего вещества составляла около 20%, что характерно для керамических материалов при высокотемпературном спекании. На рис. 1 представлена цилиндрическая 3D-модель керамического образца (диаметр 4 мм, высота 2 мм), созданная с учетом усадки 20%, характерной для высокотемпературного спекания керамических материалов.

Печать образцов из гидроксиапатита, трикальцифосфата и оксида алюминия 

Перед началом 3D-печати был проведен предварительный тест полимеризации, который позволил определить такие параметры, как длина волны лазерного излучения и толщина слоя фотополимеризуемой пасты. По результатам теста, были установлены их оптимальные значения, которые использовали в процессе печати. Лазерную стереолитографию изделий из гидроксиапатита, трикальцифосфата и оксида алюминия осуществляли на установке Ceramaker 900 (3D Ceram Sinto, Франция), для фотополимеризации керамической пасты применяли лазер с длиной волны 355 нм, что обеспечивало высокую точность и однородность структуры образцов (рис. 2).

Очистка образцов

После завершения печати образцы подвергались процессу механической промывки с использованием системы Cerakleaner (3D Ceram Sinto, Франция). На рис. 3 представлены напечатанные образцы, очищенные от остатков неполимеризованной пасты с использованием системы Cerakleaner. Очистка была необходима для удаления остатков неполимеризованной керамической пасты и подготовки образцов к этапу термообработки.

Далее образцы помещали в высокотемпературную печь Kittec CLL15 (KITTEC GmbH, Германия) для отжига при температуре 800 °C. Термообработку осуществляли при скорости нагрева 3 °C в минуту, время экспозиции составило 4 ч. Данные параметры были выбраны с целью обеспечения равномерного прогрева образца, что позволило уменьшить вероятность образования трещин и полностью удалить влагу, а также полимерное связующее. 

На заключительном этапе образцы подвергали термообработке и спеканию в лабораторной печи L15/14/C450 производства Nabertherm GmbH (Германия).

Температурные режимы спекания подбирали индивидуально для каждого типа керамического материала с целью предотвращения нежелательных структурных изменений. Для оксида алюминия (ОА) применяли более высокие температуры, так как этот материал сохраняет свою структуру даже при сильном нагреве. Для трикальцийфосфата (ТКФ) и гидроксиапатита (ГА) использовали более низкие температуры спекания, поскольку при повышенных температурах эти материалы могут изменить свою структуру: ТКФ подвержен фазовым превращениям, а ГА может частично преобразовываться в ТКФ. Учитывая эти особенности, были подобраны оптимальные температурные режимы, что позволило избежать нежелательных изменений и получить три типа керамических образцов с различной пористостью: высокой, средней и низкой [16]. На рис. 4 продемонстрированы финальные образцы, прошедшие термообработку при различных режимах спекания. 

Печать образцов из суспензии костного аллографта

Для осуществления 3D-печати методом DLP (Digital Light Processing) была подготовлена суспензия из размолотого до фракции 0–5 мкм порошка костного аллографта. На 3D-принтере Elegoo Mars 4 (ELEGOO, Китай) из суспензии полимеризовались образцы с толщиной слоя 25 мкм (рис. 5).

В результате 3D-печати из костного аллографта были получены образцы в формате «зеленого тела». Для получения полноценных образцов проводили двухстадийную термическую обработку. На первой стадии образцы нагревали до температуры 700 °С со скоростью 3 °С/ч. В результате первой стадии термообработки были получены слабоконсолидированные образцы (рис. 6), имеющие высокую пористость (до 42,3%). На второй стадии термообработки образцы были подвергнуты высокотемпературному спеканию при температуре 1300 °С и выдержке 1 ч. Скорость нагрева составляла 120 °С/ч. В результате второй стадии термообработки были получены относительно прочные и плотные образцы.

Определение пористости и плотности

В нашем исследовании параметры пористости и плотности были определены для каждого образца с использованием данных о массе, объеме и теоретической плотности материалов.

Измерение массы: массу каждого образца была измеряли с помощью аналитических весов с точностью до 0,001 г.

Измерение объема: объем образца рассчитывали по его геометрическим параметрам (цилиндрической формы) по формуле:

V = π × r² × h,

где V — объем образца, r — радиус основания цилиндра, а h — высота образца.

Расчет плотности: плотность (ρ образца) каждого образца определяли по формуле:

форм. 1

где m образца — масса образца, V образца — объем образца.

Расчет пористости: пористость (P) определяли по следующей формуле:

форм. 2

где ρ теоретическая — это теоретическая плотность материала без пор.

После проведения измерений массы, объема, плотности и пористости образцов было выявлено, что данные параметры демонстрируют значительные вариации в зависимости от типа керамического материала и применяемого режима спекания (таблица). Эти изменения обусловлены особенностями фазовых переходов при термообработке, влияющими на степень уплотнения структуры материала и формирование пор.

Электронная микроскопия

Для оценки микроструктуры, среднего размера частиц и степени спекания при различных температурных режимах использовали метод сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Образцы были предварительно подготовлены для исследования путем контролируемого разрушения для получения срезов внутренней структуры, что обеспечило возможность детального анализа микроструктурных изменений после процесса спекания. Исследования проводили на сканирующем электронном микроскопе модели Quattro S (Thermo Fisher Scientific, Нидерланды) при уровне увеличения ×10 000. Особое внимание было уделено определению среднего размера частиц и степени их уплотнения в процессе спекания (рис. 7). 

Метод оценки цитотоксичности

Для оценки цитотоксичности применяли МТТ-тест, который определяет суммарную метаболическую активность живых клеток по способности сукцинатдегидрогеназы митохондрий восстанавливать МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2ил)–2,5-дифенил-тетразолиум бромид), имеющий желтую окраску, до темно-фиолетового формазана, кристаллы которого растворяются в диметилсулфоксиде (ДМСО).

Для МТТ теста: клетки разводили до концентрации 50 000 кл./мл и по 200 мкл на лунку высевали в 96-луночный планшет с подготовленными имплантатами или без них, помещали в СО2-инкубатор на 24 ч. В процессе раскапывания суспензию перемешивали повторным пипетированием по 3 раза.

Согласно нормативным документам, отрицательный контрольный образец — это материал, который, подвергаясь исследованию в соответствии с настоящим стандартом, не проявляет цитотоксичности. Положительный контрольный образец — материал, который, подвергаясь исследованию в соответствии с настоящим стандартом, проявляет цитотоксичность, при этом результаты воспроизводимы.

В качестве отрицательного контроля использовали клетки без исследуемых образцов материалов, растущие на полипропилене. Положительным контролем служил раствор ДМСО в конечной концентрации в лунке 10%.

Для каждого материала использовали пять образцов. В качестве контроля реагента использовали три лунки планшета без клеток с полной культуральной средой. 

Протокол проведения МТТ теста

Спустя 24 ч культивирования проводили МТТ-тест. По окончании времени культивирования среду, содержащую сыворотку, заменяли на культуральную среду без сыворотки и добавляли в каждую лунку по 20 мкл раствора МТТ с концентрацией 5 мг/мл в физиологическом растворе до конечной концентрации 0,5 мг/мл. Через 3,5 ч в микроскоп наблюдали интенсивное образование кристаллов формазана. Затем из всех лунок осторожно удаляли среду, не затрагивая дно лунки с клетками и образцами. 

Добавляли ДМСО в объеме 100 мкл — половину от объема среды в каждой лунке при культивировании. Через 60 мин окрашенный в пурпурный цвет раствор в объеме 100 мкл переносили в новый 96 луночный планшет в том же порядке и анализировали в планшетном сканере «Tecan Spark 10M» (Tecan, США) при 530 нм и референсной длине волны 620 нм.

Для оценки жизнеспособности результаты были нормированы путем вычитания среднего значения для контроля реагента. Относительную жизнеспособность оценивали по следующей формуле:

форм. 3

где Vb — относительная жизнеспособность, D₅₃₀ — оптическая плотность образца при 530 нм, D₆₂₀ — оптическая плотность образца при 620 нм,  D͞₅₃₀ — средняя оптическая плотность при 530 нм для отрицательного контроля, D͞₆₂₀ — средняя оптическая плотность при 620 нм для отрицательного контроля.

Методы стерилизации

Стерилизацию паром под давлением (автоклавирование) проводили настольным паровым стерилизатором NUT2540EKA (Tuttnauer, Израиль) при 1 атм., 120 °С, 45 мин.

Радиационную стерилизацию проводили на радиационно-технологическом комплексе на базе линейного резонансного ускорителя ЛУ-7-2 (ФГУП "РФЯЦ — ВНИИЭФ", Россия) в соответствии с технологическим регламентом на радиационную стерилизацию медицинских изделий «Аллотрансплантаты для хирургии «Аллоплант» ТР-119-РС-2007». Развертку пуска осуществляли перпендикулярно направлению движения конвейера с частотой 5 Гц. Скорость движения — 6 мм/с, время облучения — 25 с, поглощенная доза — 25 кГр. Дозиметрию облученных образцов проводили с использованием детекторов поглощенной дозы СО ПД (Ф)-5/50 (ФГУП «ВНИИФТРИ», Россия).

Плазменную стерилизацию с газообразной перекисью водорода проводили на системе STERRAD® 100S (Advanced sterilization products, США), продолжительностью 42 мин.

Стерилизацию сухим жаром проводили в сушильном шкафу Binder FD53 (Binder GmbH, Германия) при 180 °С 60 мин.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты MTT-теста демонстрируют, что выживаемость клеток напрямую зависит от метода стерилизации, типа пористости и материала образца.

Представленные в таблице результаты указывают на наибольшую жизнеспособность клеток после стерилизации методом сухого жара. Средняя и низкая пористость, как правило, обеспечивает оптимальные условия для клеточной жизнеспособности, сочетая достаточную площадь для клеточной адгезии и механическую прочность.

Анализ подгрупп указывает, что для имплантов из гидроксиапатита высокая пористость увеличивает значения при переходе от автоклавирования (0,1115) к комбинированной плазменно перекисной стерилизации (0,2023) (рис. 8). Средняя и низкая пористость показывают аналогичное поведение, с пиками при сухожаровой стерилизации (0,4954 и 0,4505 соответственно). Для оксида алюминия характерны умеренные значения для всех пористостей, с ростом при сухожаре. Результаты теста для трикальцийфосфата относительно стабильны, но при низкой пористости заметен рост после автоклавирования (0,078 до 0,182 при стерилизации сухим жаром).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

На сегодняшний день нет единого мнения в отношении того, какой из методов стерилизации новых материалов является наиболее безопасным с точки зрения влияния на жизнеспособность клеток при исследовании цитотоксичности [17].

Стерилизация паром под давлением (автоклавирование) является одним из наиболее распространенных методов, который обеспечивает полную деконтаминацию медицинских изделий в короткие сроки, однако материалы имплантов могут быть термо- и барочувствительны. Данный вид обработки применим для металлов и биостекла, для других материалов высока вероятность изменения физикохимических характеристик с последующей потерей эксплуатационных свойств [18].

В нашем исследовании автоклавирование оказало отрицательное влияние на образцы из керамических материалов, что отразилось в снижении жизнеспособности клеток во время MTT-теста, особенно для материалов с низкой и высокой пористостью. Это, вероятно, связано с модификацией поверхности образцов под действием температуры и давления, затрудняющей клеточную адгезию.

Стерилизация сухим жаром продемонстрировала наибольшую жизнеспособность клеток. Одно из возможных объяснений этого эффекта в том, что происходила элиминация влаги, которая сорбировалась в гигроскопичную структуру пористой керамики из воздуха. Однако данное предположение основано на общих механизмах термического воздействия на импланты и требует дальнейшего подтверждения с помощью материаловедческих методов, таких как рентгенофазовый анализ и газовая хроматография. Нельзя также исключать возможное изменение физических характеристик поверхности образцов после сухожаровой стерилизации, что могло повлиять на адгезию клеток.

Таким образом, метод сухого жара перспективен для стерилизации керамических имплантатов, но для окончательной оценки его влияния на структуру и механические свойства требуются дополнительные исследования. В дальнейшем целесообразно провести анализ микроструктурных изменений и механических характеристик материалов, чтобы подтвердить или опровергнуть влияние стерилизации сухим жаром на их свойства. Воздействие ионизирующего излучения, в частности пучка электронов высокой энергии, может проявляться в виде различных эффектов, таких как образование нано- и субмикропор, кристаллизации аморфного фосфата кальция, рекристаллизации кристаллического гидроксиапатита, фазовых превращений (возможно образование трёхкальциевого фосфата c моноклинной решеткой, а также аморфной фазы). Кроме того, облучение электронами высокой энергии может модифицировать поверхность образца, покрывая ее тонкими наноразмерными частицами CaO, α-Ca3(PO4)2 и гидроксиапатита. Этот метод, несмотря на его эффективность, вызывает вопросы о применимости в случаях, где требуется сохранение точной структуры материала [19].

ВЫВОДЫ

Результаты исследования показали, что жизнеспособность клеток зависит как от метода стерилизации, так и от степени пористости материала. В то время как стерилизация сухим жаром продемонстрировала более выраженные показатели жизнеспособности клеток, автоклавирование и поток быстрых электронов оказывали более выраженное негативное влияние. Анализ влияния пористости показал, что зависимость жизнеспособности клеток от этого параметра не является линейной. В некоторых случаях материалы с низкой пористостью демонстрировали более высокую относительную выживаемость клеток, что может быть связано с особенностями клеточной адгезии и взаимодействия с биоматериалом. В то же время средняя пористость обеспечивала оптимальные условия для сочетания механической прочности и клеточной жизнеспособности. Таким образом, выбор метода стерилизации и степени пористости материала должен основываться на комплексном анализе биологических и механических характеристик, с учетом конкретных клинических задач. Дальнейшие исследования, включающие анализ микроструктурных изменений, позволят глубже понять механизмы влияния стерилизации на свойства керамических имплантатов. Степень пористости и выбор метода стерилизации важны в создании пористых керамических имплантов, изготовленных с применением аддитивных технологий. Использование методов 3D-печати позволит создавать персонифицированные медицинские изделия с управляемыми физическими, химическими и биологическими свойствами, сочетающими высокую механическую прочность и биосовместимость. Полученные данные формируют основу для дальнейших исследований и разработки керамических материалов с улучшенными свойствами для клинического применения.