Иммунное микроокружение в опухолях активно участвует в процессах развития и прогрессирования рака. Эту роль подчеркивает быстрое развитие терапевтических подходов, направленных на модуляцию иммунного микроокружения, в том числе при раке легких. В серии фундаментальных исследований на модельных системах выявлены патогенетические механизмы прогрессирования и факторы микроокружения, связанные с резистентностью к иммунотерапии при раке легких [1]. Например, высокий процент лимфоцитов CD8⁺, экспрессирующих PD-1, коррелировал с ограниченным ответом на блокаду PD-1 при поликлональной стимуляции Т-клеток [2]. В ходе изучения взаимосвязи иммунологических параметров и клинического течения заболевания у пациентов были выявлены закономерности, указывающие на значимость иммунного микроокружения [3]. Таким образом, классификация опухолевого иммунного микроокружения (tumor immune microenvironment, TIMT) на основе лимфоцитов PD-1/PD-L1 и CD8⁺, инфильтрирующих опухоль (tumor-infiltrating lymphocytes, TIL), эффективно стратифицирует пациентов с аденокарциномой легких на группы с различными показателями выживаемости. Примечательно, что группа с низким количеством лимфоцитов CD8⁺ и высокой экспрессией PD-1/PD-L1 демонстрирует самые плохие результаты [4]. Микроокружение имеет не меньшую важность в исследованиях по изучению его связи с ответами на иммунотерапию. Например, показатель отношения иммунных генов, генов цитокератинов и контрольных иммунных точек (IKCscore, от англ. immune-keratin-immune checkpoint score), который выводят из коэффициентов экспрессии различных генов, кодирующих иммунные маркеры и цитокератины, является многообещающим индикатором для прогнозирования эффективности иммунотерапии и комбинированной терапии на основе иммунотерапии при немелкоклеточном раке легких (НМРЛ). Кроме того, уровни инфильтрации лимфоцитами CD8⁺, покоящимися Т-клетками памяти CD4⁺ и покоящимися дендритными клетками значительно выше в группе с высоким IKCscore по сравнению с группой с низким IKCscore [5]. Экспрессия лиганда программируемой смерти 1 (PD-L1) на опухолевых клетках и мутационная нагрузка опухоли (tumour mutational burden, TMB) были идентифицированы как предикторы ответа на иммунотерапию. Однако реальная клиническая практика показывает, что одних этих биомаркеров недостаточно для эффективного отбора пациентов для такого типа терапии. Интересно, что, несмотря на обширные исследования характеристик микроокружения опухоли при раке легких, некоторые аспекты, имеющие отношение к иммунотерапии, остаются неизученными.

Один из классов иммунотерапевтических агентов включает антитела к PD-1, которые нацелены на рецептор, а не на лиганд. Тем не менее, экспрессия PD-1 в микроокружении рака легких плохо изучена. В связи с широкой доступностью терапевтических вариантов, включающих ингибиторы иммунных контрольных точек, понимание особенностей микроокружения опухоли становится решающим, и может способствовать выявлению новых ассоциаций с эффективностью иммунотерапии. Цель данного исследования — оценить экспрессию PD-1 в инфильтрирующих опухоль иммунных клетках и ее связь с клиническими исходами у пациентов с раком легких.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Пациенты

В исследовании приняли участие 20 пациентов (17 мужчин и три женщины). Критерии включения: морфологически верифицированный диагноз рака легкого. У 12 из 20 пациентов был поставлен диагноз немелкоклеточного рака легкого», у восьми — диагноз мелкоклеточного рака легкого. Все пациенты имели III–IV стадии заболевания (у 10 пациентов III стадия, у 10 — IV стадия), средний возраст составил 56 ± 6,9 лет. Критерии исключения: наличие рака легкого I–II стадии; наличие сопутствующих аутоиммунных и воспалительных заболеваний. Пациенты прошли полный курс лечения в соответствии с клиническими рекомендациями (комбинированную терапию, включающую химиотерапию первой и последующих линий по схемам карбоплатин/паклитаксел, пеметрексед/карбоплатин, карбоплатин/этопозид, монохимиотерапию таксанами, деносумаб, химиоиммунотерапию, при наличии показаний пациентам выполняли дистанционную лучевую терапию). Медиана наблюдения составила 12 месяцев.

Иммунофенотипирование опухолевого микроокружения

Образцы опухолевой ткани были собраны до начала лечения, зафиксированы в формалине и залиты в парафин с использованием стандартных методов.  Затем проводили многоцветное иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание ткани рака легкого с усилением сигнала тирамидом (TSA). Использовали следующие первичные антитела: человеческие анти-CD8 (Ventana, Швейцария; клон SP57, разведение 1 : 10), анти-PD-1 (ABclonal, Китай; клон AMC0439, разведение 1 : 500), анти-CD20 (Leica Biosystems, Германия; клон L26, разведение 1 : 600), антиCD163 (Diagnostic Biosystems, США; клон 10D6, разведение 1 : 150) и моноклональные антитела анти-FoxP3 (Invitrogen, США; клон 236A/E7, разведение 1 : 800). Для визуализации использовали систему EnVision FLEX/HRP (Dako, Дания) и набор Opal 7-color Fluorophore Kit (Akoya Biosciences, США), включающий тирамид, конъюгированный с флуорофорами. Процедуру окрашивания проводили на автоматическом иммуногистостейнере BOND RXm (Leica, Германия). Протокол включал демаскировку антигена с использованием буфера Epitope Retrieval Solution 2 (Leica Biosystems, Германия) при 98,5 °C в течение 20 мин, за которым следовали пять последовательных циклов окрашивания. Каждый цикл состоял из следующих этапов: 10-минутная инкубация с реагентом EnVision FLEX Peroxidase-blocking (Dako, Дания), 10-минутная инкубация с Novocastra Protein Block (Leica Biosystems, Германия), 30-минутная инкубация с первичным антителом, 30-минутная инкубация с EnVision FLEX/ HRP и 20-минутная инкубация с красителем Opal. После каждого цикла проводили отмывку первичных и вторичных антител с использованием буфера Epitope Retrieval Solution 2. Ядра клеток контрастировали вручную с использованием Fluoroshield™ с DAPI (Sigma-Aldrich, США). Визуализацию и получение изображений проводили с использованием системы Vectra® 3.0 (Akoya Biosciences, США), а количественный анализ клеток — с использованием программного обеспечения inForm® (Akoya Biosciences, США) на основе данных, собранных из семи репрезентативных участков тканей.

Плотность инфильтрации цитотоксическими лимфоцитами CD8⁺, В-лимфоцитами CD20⁺, макрофагами CD163⁺, ассоциированными с опухолью и регуляторными Т-лимфоцитами FoxP3⁺ была количественно определена в опухолевой ткани пациентов с раком легких (рис. 1). Результаты были представлены в виде процента каждого типа клеток от общего количества клеток в строме опухоли. Статистический анализ выполняли с помощью программного обеспечения Prism 10 (GraphPad, США). Для выявления различий количества иммунных клеток в микроокружении опухоли использовали критерий Фридмана, для сравнения независимых групп — непараметрический критерий Манна–Уитни. Однофакторный и многофакторный Cox-регрессионный анализ использовали для выявления ассоциации основных клинико-патологических параметров и параметров микроокружения опухоли с выживаемостью без прогрессии пациентов. Все критерии были двухсторонние, различия считали достоверными при значении p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В микроокружении опухоли НМРЛ медиана доли PD-1позитивных клеток составила 1,04% (0,17–1,70%), при мелкоклеточном раке легкого (МРЛ) — 0,27% (0,03–2,93%). Частота встречаемости PD-1-позитивных цитотоксических лимфоцитов CD8⁺ составила 83,3% (10/12) у пациентов с НМРЛ и 37,5% (3/8) у пациентов с МРЛ. В то время как частота PD-1-позитивных B-лимфоцитов CD20⁺ составляла 8,3% (1/12) и 12,5% (1/8), PD-1-позитивных T-регуляторных лимфоцитов FoxP3⁺ составляла 25% (3/12) и 12,5% (1/8), а PD-1-позитивных макрофагов CD163⁺ — 25% (3/12) и 20% (2/8) соответственно. Мы изучили долю PD-1-позитивных цитотоксических лимфоцитов B-лимфоцитов CD8⁺, CD20⁺, T-регуляторных лимфоцитов FoxP3⁺ и макрофагов CD163⁺, а также долю других PD-1-позитивных клеток (без определения иммунофенотипа) в опухолевом микроокружении пациентов с немелкоклеточным и мелкоклеточным раком легкого (рис. 2).

При оценке клеточной фракции среди всех клеток в иммунном инфильтрате НМРЛ среди лимфоцитов преобладали PD-1-позитивные CD8⁺-цитотоксические лимфоциты и другие PD-1-позитивные иммунные клетки, составляя 0,24% (диапазон: 0,08–0,46%) и 0,39% (диапазон: 0,00–1,05%) соответственно. В микроокружении МКРЛ не наблюдалось существенных различий в количестве иммунных клеток, экспрессирующих PD-1. Также были определены доли клеток, экспрессирующих PD-1, среди всех изученных иммунофенотипов как для НМРЛ, так и для МКРЛ (табл. 1).

При сравнении доли клеток, экспрессирующих PD-1, между пациентами с НМРЛ и МРЛ существенных различий не выявлено (рис. 3).

При анализе параметров иммунного микроокружения с учетом клинических и патологических параметров рака легких не выявлено значимых корреляций между исследуемыми популяциями клеток и возрастом пациента, статусом курения или наличием отдаленных метастазов (стадия M1). Однако статистически значимая связь наблюдалась между стадией заболевания и долей CD8⁺лимфоцитов у пациентов с МРЛ. В частности, у пациентов с III–IV стадией заболевания обнаружено снижение доли CD8⁺-лимфоцитов в микроокружении опухоли по сравнению с пациентами со II стадией (3,49% [диапазон: 3,07–1,19%] против 4,82% [диапазон: 3,76–9,88%], p = 0,0286). Кроме того, оценена связь между характеристиками микроокружения опухоли и отдаленными результатами лечения с помощью регрессионного анализа Кокса (табл. 2).

Повышенная доля CD20⁺-лимфоцитов в микроокружении опухоли была выявлена как более значимый независимый фактор, связанный с плохой выживаемостью без прогрессирования у пациентов с раком легких (HR = 0,17 [0,02–0,65], p = 0,0454), по сравнению с такими факторами, как стадия, гистологический тип, статус курения, наличие метастазов в региональных лимфатических узлах и отдаленных метастазов (стадия M1). Кроме того, анализ прогностической ценности популяций иммунных клеток, экспрессирующих PD-1, с учетом клинико-патологических параметров показал, что независимые предикторы более короткой выживаемости без прогрессирования при раке легких включают наличие отдаленных метастазов (стадия M1), высокую долю CD163⁺-макрофагов, экспрессирующих PD-1, и низкую долю FoxP3⁺-лимфоцитов, экспрессирующих PD-1 (табл. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Клиническое значение экспрессии PD-1, особенно в контексте иммунотерапии, остается плохо изученным. В литературе доступны ограниченные и противоречивые данные о прогностической ценности определения экспрессии PD-1. Так, описано, что пациенты с ранней стадией НМРЛ, у которых экспрессия PD-1 составляла ≥10% на лимфоцитах, инфильтрирующих опухоль, имели неблагоприятные показатели 10-летней выживаемости [6]. По другим данным, положительная экспрессия PD-1 в сочетании с высоким количеством лимфоцитов (CD3, CD4, CD8 и FOXP3) была связана со значительно лучшими показателями выживаемости по сравнению с отрицательной экспрессией PD-1 в сочетании с более низким количеством лимфоцитов [7]. В нашем исследовании мы оценили экспрессию PD-1, учитывая иммунофенотип клеток. Мы сосредоточились на четырех наиболее значимых популяциях, для которых есть доказательства, предполагающие связь с ответом на иммунотерапию, поскольку пациенты, включенные в наше исследование, являются потенциальными кандидатами на анти-PD-1-терапию в последующих линиях терапии. Говоря о значимости экспрессии PD-1 для прогноза уже на фоне иммунотерапии, следует упомянуть работу, в которой показано, что низкая частота экспрессии PD-1 среди CD8⁺-лимфоцитов была отличительной чертой пациентов, проходивших лечение ниволумабом, и это также было связано с клиническими преимуществами и более продолжительной выживаемостью без прогрессирования (HR = 4,51; 95% ДИ: 1,45–13,94) [8]. В нашем исследовании экспрессия PD-1 была обнаружена преимущественно на CD8⁺-лимфоцитах, хотя доля PD-1⁺клеток в популяции CD8⁺-лимфоцитов составляла около 5% и не была связана с выживаемостью без прогрессии. Известно, что эффекторные функции постепенно утрачиваются при прогрессирующем истощении Т-клеток. В недавно опубликованном исследовании была отмечена обратная корреляция между функцией Т-клеток и уровнем экспрессии PD-1 [9]. Таким образом, экспрессия PD-1 на цитотоксических лимфоцитах указывает на состояние истощения. Важно отметить, по полученным нами данным, иммунные клетки, экспрессирующие PD-1, чрезвычайно редки в микроокружении как НМРЛ, так и МРЛ. Это указывает на то, что большинство иммунных клеток в строме опухоли находится преимущественно в активном функциональном состоянии. Наши результаты показывают, что клетки, на которые нацелены антиPD-1 терапевтические антитела, немногочисленны в микроокружении опухоли и в основном состоят из цитотоксических лимфоцитов, экспрессирующих PD-1. Блокирование контрольной точки в этих немногих клетках может потенциально восстановить их истощенную функцию. В то же время небольшое количество этих клеток может объяснить ограниченные терапевтические эффекты, наблюдаемые при использовании анти-PD-1-терапии.

В настоящее время мы не можем оценить корреляцию между конкретными характеристиками клеточного состава микроокружения опухоли и результатами лечения у этих пациентов, поскольку их терапия все еще продолжается. Тем не менее, это исследование позволило нам оценить связь между различными параметрами микроокружения опухоли и выживаемостью без прогрессирования (PFS). Наши результаты подчеркивают решающую важность состава иммунных клеток в микроокружении опухоли для определения PFS у пациентов с раком легких. В частности, повышенная доля CD20⁺-лимфоцитов была идентифицирована как значимый независимый предиктор более плохой PFS, показывающий отношение рисков (HR) 0,17 (95% ДИ: 0,02-0,65, p = 0,0454). Эта связь представляется более существенной, чем обычные прогностические факторы, включая стадию опухоли, гистологический подтип, статус курения и наличие региональных или отдаленных метастазов (стадия M1). Результаты показывают, что инфильтрация В-клеток может играть ранее недооцененную роль в прогрессировании рака легких, возможно, из-за ее влияния на подавление или модуляцию иммунитета в опухолевом микроокружении. Необходимы дальнейшие исследования для изучения функционального воздействия CD20⁺-лимфоцитов на рак легких с целью выяснения их роли в биологии опухоли и устойчивости к эффективному лечению.

Более того, проведенный нами анализ, касающийся популяций иммунных клеток, экспрессирующих PD-1, обнаружил новые данные о связях между экспрессией иммунных контрольных точек и клиническими результатами. Так, наличие отдаленных метастазов (стадия M1), высокая доля CD163⁺-макрофагов, положительных по PD-1, и низкая доля FoxP3⁺-лимфоцитов, положительных по PD-1, были идентифицированы как предикторы более короткой выживаемости без прогрессии. Эти наблюдения подчеркивают сложность иммунной регуляции в опухолевом микроокружении, где тонкий баланс между популяциями иммуносупрессивных и иммуностимулирующих клеток критически влияет на прогрессирование заболевания. Связь PD-1⁺CD163⁺-макрофагов с плохими результатами лечения преимущественно наблюдалась в моделях на животных [10]. Напротив, противоопухолевый эффект, наблюдаемый в PD-1⁺FoxP3⁺-лимфоцитах, предполагает потенциальную регуляторную функцию, хотя наличие Treg-лимфоцитов, как правило, связано с плохими результатами [11]. Эти результаты имеют существенное значение для разработки прогностических биомаркеров и формулирования иммунотерапевтических стратегий при лечении рака легких. Идентификация субпопуляций иммунных клеток, экспрессирующих PD-1, в качестве прогностических маркеров подчеркивает необходимость более глубокого понимания функционирования опухолевого микроокружения. Нацеливание на обнаруженные популяции, либо посредством прямой модуляции, либо в сочетании с существующими ингибиторами иммунных контрольных точек, может проложить путь к улучшению терапевтических результатов. Тем не менее, функциональная гетерогенность в этих популяциях клеток требует более подробных механистических исследований для выяснения их роли в иммунитете опухолей и определения оптимальных терапевтических целей.

ВЫВОДЫ

Проведенное исследование предоставляет убедительные доказательства того, что иммунный ландшафт опухолевого микроокружения, в частности состав иммунных клеток, экспрессирующих PD-1, в значительной степени связан с результатами лечения рака легких. Эти результаты подчеркивают критическую важность иммунного контекста в определении прогноза клинического течения и разработке терапевтических стратегий. Будущие исследования должны быть сосредоточены на подтверждении этих результатов на более крупных независимых когортах пациентов и дальнейшем изучении их прогностического потенциала в отношении иммунотерапии при раке легких.