Синдром Криглера–Найяра (СКН) — это орфанная ферментопатия, вызываемая вариантами потери функции фермента уридиндифосфатглюкуронозилтрансферазы 1A1, кодируемого геном UGT1A1 [1]. Отсутствие активной уридиндифосфатглюкуронозилтрансферазы 1A1 приводит к накоплению конъюгатов билирубина (клинически представленных желтухой и тяжелыми неврологическими нарушениями) и является потенциально фатальным в младенчестве. Диагноз включает биохимические и молекулярно-генетические тесты на, соответственно, неконъюгированный билирубин и варианты UGT1A1. Никакого специфического патогенетического лечения этого состояния не было предложено, за исключением трансплантации печени при СКН 1-го типа (тяжелой форме заболевания). Пациенты нуждаются в постоянном наблюдении и находятся на постоянном удалении билирубина с помощью плазмафереза и (или) фототерапии, что сильно влияет на их качество жизни. Потенциал использования аденоассоциированного вируса серотипа 8 для лечения СКН был обоснован в доклинических исследованиях in vivo [2, 3]. В 2023 г. D'Antiga et al. сообщили об успешном лечении СКН1 у взрослых пациентов с использованием генного препарата с доставкой посредством AAV8 [4]. У детей эффективность применения такой терапии (спекулятивно) может быть ниже из-за высоких темпов роста и физиологического обновления клеток печени. Здесь мы описываем устойчивый клинический ответ (107 недель на момент написания статьи) у ребенка с СКН1 с использованием кодирующей последовательности UGT1A1, доставленной двумя последовательными дозами аденоассоциированного вирусного вектора серотипа 8 (AAV8). Это первый отчет о терапии AAV в режиме доставки двумя дозами.

Описание клинического случая

Дизайн и очистка вектора

В качестве матрицы использовали кДНК от здорового донора с последовательностью UGT1A1 дикого типа. Кодирующая последовательность была клонирована в плазмиду pAAV-TBG. Конструкция pAAV-TBG-UGT1A1 была упакована в клетках HEK293.

Частицы очищали в ступенчатом градиенте плотности иодиксанола (OptiPrep, StemCell Technologies, США) при 350 000 g, +18 °C в течение 1,5 ч (ультрацентрифуга Optima-XPN; Beckman, США). 60%-ную фракцию и половину 40%-ной фракции йодиксанола собирали, очищали диализом (Spectrum™, Fisher Scientific #0867140; размер пор 100 кДа) против (1x) буфера PBS/350 мМ NaCl/0,001% Pluronic F-68 при 4 °C в течение 14–18 ч, концентрировали с помощью центрифужных фильтров Amicon®, размер пор 100 кДа (Millipore Sigma, США) и дополнительно стерилизовали шприцевой фильтрацией 0,22 мкм. Продукт, альфаглюкуронозилтрансферазаген унопарвовек, количественно определяли с помощью ПЦР «в реальном времени» с плазмидной ДНК в качестве эталона. Все показатели чистоты оказались в пределах референсных значений для клинического использования; продукт содержал эндотоксин <0,64 EU/мл (Endosafe® LAL; Charles River Endosafe, США), BSA < 159 нг/мл (BSA ELISA Kit; Wuhan Fine Biotech, КНР), остаточные белки HEK293 <2 нг/мл (HEK293 NSR ELISA Kit; Cygnus Technologies, США) и был микоплазмонегативным.

Доклинические исследования

Испытания in vitro проводили на клетках HeLa (ATCC, США).

Исследования на животных были одобрены Комитетом по содержанию и использованию животных Пироговского Университета. Испытания in vivo на мышах C57BL6 проводили в три раунда: оценка зависимости реакции от дозы, оценка токсичности передозировки и оценка постепенного исчезновения в подростковом возрасте. Контрольная группа получала идентичный объем буфера для разбавления вместо препарата (во всех экспериментах).

Оценку зависимости реакции от дозы проводили на мышах в возрасте 8 месяцев в группах n(c) = 11, n(L) = 11, n(M) = 11, n(H) = 11. Исследования токсикологии и биораспределения включали мониторинг количества лейкоцитов и биохимических тестов на 3, 4 и 5 неделе после инфузии, а также посмертную оценку параметров крови и биораспределения препарата в мышцах и внутренних органах на 6-й неделе. Иммуногистохимическое исследование (ИГХ) показало селективное биораспределение кодирующей последовательности человеческого UGT1A1 в печень. Сигнал hUGT1A1 увеличивался вместе с дозой как по интенсивности, так и по распространению в паренхиму печени из вен долек (рис. 1).

Оценку токсичности передозировки максимальной потенциальной терапевтической дозой проводили путем введения дозы 1,2 × 10¹⁴ вг/кг 8-месячным мышам в контрольной и экспериментальной группах (n = 6 в каждой) с теми же контрольными точками и контролируемыми параметрами, что и выше. Существенных токсических эффектов не было обнаружено. Оценку постепенного исчезновения конструкции в подростковом возрасте проводили на 5-недельных мышах (n = 24), которым 1,2 × 10¹³ вг/кг препарата вводили в хвостовую вену. Через 2 недели после инфузии (и затем каждые 3 недели до конца эксперимента в возрасте 19 недель) группы мышей (n = 6, 4, 4, 4, 6) подвергали эвтаназии и брали образцы печени для анализа копий вирусного генома методом количественной ПЦР и количественного обнаружения белка методом ИГХ (срезы печени, окрашенные антителом, специфичным к hUGT1A1). Результаты количественной ПЦР показали двухкратное снижение содержания векторной ДНК каждые 6 недель (четырехкратное за эксперимент). По результатам количественного анализа белка, уровень hUGT1A1 увеличивался в течение 5 недель после инфузии и оставался стабильным до конца эксперимента.

Пациент

Девочке с СКН1, подтвержденным секвенированием гена UGT1A1 и проявляющимся тяжелой неконъюгированной гипербилирубинемией, находящейся под постоянным наблюдением в ФГБУ «НМИЦ АГП им. В. И. Кулакова» Минздрава России, проводили 12-часовую ежедневную фототерапию, что позволило удерживать уровень непрямого билирубина в пределах токсичности 300–350 мкмоль/л.

Терапия AAV была одобрена этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ АГП им. В. И. Кулакова» Минздрава России 01 декабря 2022 г., протокол № 12 (для инфузии I), и 20 июля 2023 г., протокол № 7 (для инфузии II). Заявление на проведение клинического исследования I–II фазы № 13571. Законные представители пациентки дали информированное добровольное согласие на исследование и на каждую инфузию препарата.

Лечение и результат

Терапия генопрепаратом была начата в возрасте 7 лет и 5 месяцев. Пациентке было проведено две внутривенные инфузии альфаглюкуронозилтрансферазаген унопарвовека: 6 × 10¹² вирусных геномов на кг массы тела (вг/кг) на 0-й неделе и 1,2 × 10¹³ вг/кг на 27-й неделе (рис. 2). Безопасность контролировали по уровням трансаминаз и самочувствию пациента. Эффективность оценивали по снижению уровня билирубина в сыворотке. Диаграмма уровней непрямого билирубина за 3,5 года, включая обширный период времени, предшествовавший лечению, представлена на рис. 2. Режим фототерапии постоянно корректировался в соответствии с уровнями непрямого билирубина. Обе инфузии сопровождались поддержкой преднизолоном для смягчения иммунных реакций: пациентка принимала преднизолон ежедневно перорально в дозах, постепенно снижаемых с 1 мг/кг до 0 в течение 8 и 2 недель с момента первой и второй инфузии соответственно (рис. 2). Кроме того, в день инфузии II пациентка получила 250 мг (10 мг/кг) метилпреднизолона внутривенно.

Нейтрализующие антитела к AAV8 не были обнаружены до инфузии I. Положительная иммунологическая реакция с эпитопами AAV8 была выявлена после первой инфузии и сохранялась в течение всего исследования.

Инфузия I снизила сывороточный билирубин в 2 раза (минимум, достигнутый на протяжении 2–9 недель). Поскольку ежедневные дозы фототерапии постепенно снижались до 4 ч к 8-й неделе, концентрация сывороточного билирубина восстановилась до ~250 мкмоль/л (с 10-й недели и далее). Клиническое решение относительно инфузии II предполагало полную отмену фототерапии. Инфузия II на 27-й неделе не дала токсических эффектов и обеспечила дополнительное снижение концентрации сывороточного билирубина на ~20% на 29-й неделе. В связи с положительной

динамикой поддержка фототерапией была прекращена, но возобновлена через 2 недели в той же ограниченной дозе 4 ч, поскольку концентрация сывороточного билирубина резко увеличилась до ~400 мкмоль/л. Повторная фототерапия обеспечила быструю коррекцию концентрации сывороточного билирубина до ~250 мкмоль/л. Профили печеночных ферментов оставались нормальными в течение всего периода наблюдения. На момент написания статьи (107-я неделя) пациент стабилен при фототерапии, проводимой по 4 ч в день, без системных жалоб.

Обсуждение клинического случая

Лечение не вызвало токсических побочных эффектов. Хотя полное прекращение фототерапии оказалось невозможным на данном этапе, лечение обеспечило длительное трехкратное снижение ежедневного воздействия ультрафиолета по сравнению с первоначальными значениями.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование печень-специфичной генной терапии у детей связано с ускоренной потерей эффекта, по-видимому, из-за высокой регенерационной способности и роста печени. Возможность безопасного повторного введения вектора AAV8 позволяет удовлетворительно контролировать критический биохимический показатель. Генная терапия СКН1 в настоящее время находится в фазе 1/2 испытания (https://clinicaltrials.gov/study/NCT06641154) и может быть применима к другим пациентам в возрасте от 3 месяцев до 10 лет.