Гематогенное метастазирование — основная причина неблагоприятного исхода злокачественных новообразований. Источником гематогенных метастазов являются клетки первичной опухоли, обладающие способностью к интравазации и образованию циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК). Классический метод определения ЦОК CELLSEARCH основан на выделении CD45-отрицательных, EpCAM-положительных и цитокератин 8-, 18- и/или 19-положительных ЦОК в периферической крови [1]. К настоящему времени разработаны разные технологии обнаружения и выделения ЦОК: разделение центрифугированием в градиенте плотности; диэлектрофорез (метод выделения ЦОК на основе их диэлектрических свойств); метод разделения клеток на основе микрофлюидных чипов; обогащение ЦОК с использованием системы сортировки клеток с магнитной активацией (включает маркировку ЦОК суперпарамагнитными микросферами MACS, покрытыми антителами, специфичными для поверхностных антигенов ЦОК); использование магнитных бусин, покрытых тонким слоем гидрогеля, содержащего антитела против EpCAM; метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР); методы обнаружения, основанные на проточной цитометрии [2]. У пациентов на поздней стадии рака молочной железы ЦОК обнаруживают в 60% случаев, на ранних стадиях — в 20–30% случаев [3]. Использование метода проточной цитометрии позволяет выявить широкий спектр функциональных маркеров на каждой из ЦОК. Благодаря этой технологии при РМЖ продемонстрирована гетерогенность проявлений признаков стволовости и проявлений эпителиальномезенхимального перехода [4, 5]. Выживаемость без прогрессирования связана при РМЖ с ЦОК. При количестве ЦОК ≥ 6 чаще возникают рецидивы и метастазы и уменьшается выживаемость [6]. Ранее нами были опубликованы данные о том, что наряду с классическими ЦОК, экспрессирующими мембранный EpCAM (mEpCAM) в крови, имеются клетки с фенотипом CD45^–mEpCAM^– CK7/8^–CD24⁺N-cadherin^–, которые ассоциированы с повышенным риском метастазирования [7]. Эти клетки, в отличие от ЦОК обозначены как циркулирующие клетки (ЦК). Их природа остается неясной.

Важными характеристиками любой клетки в кровотоке, в том числе и опухолевой, являются биофизические параметры, которое могут частично отражать ее морфофункциональное состояние. Измерение биофизических свойств клеток (таких как электрический импеданс, радиочастотная проводимость, рассеяние света клетками под различными углами) положено в основу методов автоматизированного гематологического анализа. Метод проточной цитометрии позволяет получить информацию относительно размера и структуры клеток посредством детекции параметров прямого и бокового светорассеяния. При прохождении клетки через испускаемый лазером световой поток регистрируется флуоресценция клеток и светорассеяние в различных направлениях. Прямое светорассеяние (FSC) учитывает интенсивность света, рассеянного под малым углом до 10° (детекторы расположены по ходу лазерного луча), и характеризует размер клетки. Боковое светорассеяние (SSC) учитывает интенсивность света, рассеянного до 90° (детекторы расположены перпендикулярно направлению лазерного луча), зависит от плотности клетки и характеризует сложность внутриклеточных структур [8] и выраженность цитоплазматической зернистости [9]. Кроме того, имеются данные, свидетельствующие о более тонком влиянии различных структур клетки на параметры бокового светорассеяния. Так, рассеивание света под углом 5–30° обусловлено клеточным ядром, а под углом 50–130° — небольшими органеллами, такими как митохондрии, пероксисомы, лизосомы и гранулы [10].

В 2023 г. разработан метод и представлены результаты, демонстрирующие, что оцененная с помощью SSC гранулярность клеток может быть использована для разделения функциональных субпопуляций лимфоцитов. Так, наивные недифференцированные лимфоциты располагаются в области SSC^low, а цитотоксические лимфоциты с большим содержанием гранул — в SSC^high [9].

Цель данной работы заключалась в уточнении фенотипических характеристик СD45^–mEpCAM^–CK7/8^– CD24⁺N-cadherin^–клеток в крови пациенток с раком молочной железы в зависимости от бокового светорассеяния SSC, с учетом экспрессии маркеров эпителиальности E-cadherin, цитокератинов AE1/AE3 (pan Cytokeratin), а также внутриклеточной экспрессии молекулы адгезии EpCAM (icEpCAM) у пациенток с инвазивной протоковой карциномой молочной железы неспецифического типа (ИПКНТ) и доноров.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В проспективное исследование вошли 11 доноров и 20 пациенток с ИПКНТ, проходивших лечение в НИИ онкологии Томского НИМЦ. Критерии включения пациенток в группу исследования: диагноз инвазивной протоковой карциномы молочной железы неспецифического типа, подтвержденный морфологически; распространенность первичной опухоли T₁-4N₀-3M₀; люминальный Б Her2^– (9 пациенток), люминальный Б Her2⁺ (4 пациентки), трижды негативный (5 пациенток) и HER2⁺ (2 пациентки) молекулярно-биологические подтипы. Критерии исключения пациенток из группы исследования: другие гистологические типы рака молочной железы; первично множественные злокачественные опухоли; хронические воспалительные заболевания в стадии обострения. Группа доноров была сопостовима с пациентками по возрасту, главным критерием включения являлось отсутствие хронических воспалительных заболеваний в стадии обострения. Образцы венозной крови забирали в вакуумные пробирки, обработанные ЭДТА, перед операцией и неоадъювантной химиотерапией (НАХТ). Дальнейшую пробоподготовку осуществляли согласно протоколу, описанному ранее [11]. Для окрашивания поверхностных маркеров использовали моноклональные антитела: BV570-анти-CD45 (клон HI30, мышиные IgG1; Sony Biotechnology, США), PE-Cy7-анти-N-кадгерин (клон 8C11, мышиные IgG1; Sony Biotechnology, США), BB700анти-CD24 (клон ML5, мышиные IgG2a; BD Horizont, США), R718-анти-EpCAM (CD326) (клон EBA-1, мышиные IgG1; BD Biosciences, США), BV-421-анти-CD11b (клон ICRF44, мышиные IgG1; BioLegend, Великобритания), PE-Dazzle594-анти-Е-кадгерин (CD324) (клон 67А4, крысиные IgG1; Sony Biotechnology, США). Для внутриклеточного окрашивания использовали: PE-анти-CK7/8 (клон CAM 5.2, мышиные IgG2a; BD Biosciences, США), eFlour660анти-panCK (клон AE1/3, мышиные IgG1; Invitrogen, США), BV605-анти-EpCAM (CD326) (клон 9C4, IgG2b; Sony Biotechnology, США). Клетки линии рака молочной железы MCF-7 использовали в качестве положительного контроля при оценке уровня флуоресценции антител против эпителиальных маркеров, а клетки промоноцитарной клеточной линии U937 — в качестве отрицательного контроля. Позитивными по эпителиальным маркерам считали события, детектируемые в области высокого уровня интенсивности сигнала (седьмая декада и выше).

Иммунофлуоресценцию анализировали на проточном цитофлуориметре Novocyte 3000 (ACEA Biosciences, США) с помощью пакета программ NovoExpress 1.3.0 (ACEA Biosciences, США). Оценку гранулярности обнаруженных клеток проводили исходя из параметра бокового светорассеяния SSC, индивидуально для каждого случая. SSC^low-циркулирующие клетки локализовались на двумерном графике FSC/SSC в области, соответствующей популяциям агранулоцитов (лимфоциты и моноциты). SSC^high-клетки располагались на двумерном графике FSC/ SSC в области, соответствующей популяции гранулоцитов. Медианное значение границы между SSC^low и SSC^high областями для данного цитометра составило 0,40 (0,36–0,45) (рис. 1).

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ GraphPadPrism 9 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Для сравнения частот встречаемости различных фенотипов клеток использовали точный критерий Фишера. Для сравнения количеств клеточных фенотипов между собой использовали непараметрический критерий Уилкоксона, для сравнения количеств клеточных фенотипов у доноров и пациентов — непараметрический критерий Манна–Уитни; данные представлены как Me (Q₁; Q₃). Результаты считали статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Частота встречаемости и количество ЦК в областях SSC^low и SSC^high у доноров и пациенток с ИПКНТ

Для уточнения природы ЦК оценивали экспрессию маркера миелоидного происхождения CD11b, а также маркеров эпителиальности: E-cadherin, pan-Cytokeratin и внутриклеточного EpCAM (icEpCAM). Из 16 возможных фенотипов ЦК в цельной крови пациенток с ИПКНТ обнаруживались восемь. Причем каждая клетка экспрессировала только один из перечисленных эпителиальных маркеров. Было проведено сравнение частоты встречаемости (табл. 1) и количества (табл. 2) этих клеточных популяций в зависимости от степени бокового светорассеяния: SSC^low или SSC^high.

В табл. 1 и представлены только те фенотипы клеток, которые были обнаружены в крови пациенток с ИПКНТ. Частота встречаемости клеток с изучаемыми фенотипами ЦК не различалась в областях SSC^low и SSC^high. Независимо от параметра SSC и экспрессии CD11b в большинстве случаев (от 85 до 100%) обнаруживали ЦК с фенотипами № 1 и № 5 без экспрессии эпителиальных маркеров. В 20–35% процентах случаев среди ЦК присутствовали E-cadherin⁺-клетки. В шести фенотипах ЦК наблюдали экспрессию одного из исследованных эпителиальных маркеров.

Суммарное количество клеток, экспрессирующих эпителиальные маркеры (независимо от экспрессии CD11b и параметра SSC), составляет 1,9 клеток в 1 мл цельной крови. ЦК с фенотипами № 1 и № 5 не только чаще обнаруживались в крови, но и были самыми многочисленными. Медиана остальных шести фенотипов была близкой к нулю.

Количество ЦК с фенотипом № 5 в области SSC^high было в 24 раза больше, чем в области SSC^low (p < 0,0001) (табл. 2). В отличие от пациенток с РМЖ у доноров обнаружено только два фенотипа исследуемых клеток. Стоит отметить, что это те же самые часто встречающиеся и многочисленные фенотипы № 1 и № 5. Частоты встречаемости указанных фенотипов клеток не различались в зависимости от их расположения в областях SSC^low и SSC^high, а количество было не одинаковым. Количество клеток с фенотипом № 5 CD11b⁺Ecadherin^–panCK^–icEpCAM^– было в 12,5 раз больше в области SSC^high по сравнению с SSC^low (p = 0,0020), а клеток с фенотипом № 1 CD11b^–E-cadherin^–panCK^–icEpCAM^–, напротив, было в 7,5 раз больше в SSC^low, чем в SSC^high (p = 0,0156). Также области в SSC^high количество клеток с фенотипом № 5 CD11b⁺Ecadherin^–panCK^–icEpCAM^– в 25 раз преобладало над клетками с фенотипом № 1 CD11b^–Ecadherin^–panCK^–icEpCAM^– (p = 0,0020) (табл. 3).

Примечательно, что у доноров не было ЦК, в которых бы экспрессировались какие-либо из использованных нами маркеров эпителиальных клеток. 

Сравнение частоты встречаемости и количества различных фенотипов ЦК у доноров и пациенток с ИПКНТ

Сравнение частоты встречаемости и количества различных фенотипов ЦК в крови доноров и пациенток с ИПКНТ представляет отдельный интерес в связи с возможностью существования ассоциативной связи между идентификацией в крови ЦК и наличием онкологического заболевания. Было проведено сравнение частоты встречаемости ЦК с фенотипом CD45^–mEpCAM^–CK7/8^– CD24⁺Ncadherin^– с разными вариантами коэкспрессии CD11b, E-cadherin, pan-Cytokeratin и icEpCAM в областях SSC^low и SSC^high (рис. 2). С наибольшей частотой и у доноров, и у пациенток с ИПКНТ в SSC^low и SSC^high областях встречалось два фенотипа ЦК: № 1 CD11b^– Ecadherin^–panCK^–icEpCAM^– и № 5 CD11b⁺Ecadherin^–panCK^– icEpCAM^–, т. е. клетки, не экспрессирующие маркеры эпителиальности E-cadherin, pan-Cytokeratin и icEpCAM (рис. 2А, Б). Эти же фенотипы ЦК (№ 1 и 5) оказались не только самыми частыми, но и самыми многочисленными в обоих областях (рис. 2С, Г). Клетки с фенотипом № 4 CD45^–mEpCAM^–CK7/8^–CD24⁺Ncadherin^–CD11b^–Ecadherin⁺panCK^–icEpCAM^– в области SSC^low встречались достоверно чаще (p = 0,0331) (рис. 2А) и в большем количестве на уровне тенденции (p = 0,0522) (рис. 2В) у пациенток с ИПКНТ по сравнению с донорами. Стоит еще раз подчеркнуть, что у доноров клеток, экспрессирующих маркеры эпителиальности, не было обнаружено вовсе. У пациенток с ИПКНТ ЦК, экспрессирующие маркеры эпителиальности, обнаруживались, однако частота их встречаемости была низкой.

Частота встречаемости клеток, экспрессирующих любые эпителиальные маркеры, в области SSC^low была выше у пациенток с ИПКНТ, чем у доноров (у доноров таких клеток обнаружено не было) независимо от экспрессии CD11b (соответственно p = 0,0331 и p = 0,0331), в SSC^high — только для CD11b⁺-клеток (p = 0,0116) (рис. 3А). Количество таких клеток было больше у пациенток с ИПКНТ по сравнению с донорами только для CD11b⁺клеток в области SSC^high (p = 0,0129) (рис. 3Б).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Оценка параметра бокового светорассеяния позволила разделить исследуемые клетки на две популяции, располагающиеся в областях SSC^low и SSC^high, различающихся (как следует из физической природы показателя) сложностью внутриклеточной организации клетки, включая количество органоидов и выраженность цитоплазматической зернистости [8].  

Данный критерий, по-видимому, действительно отражает гранулярность цитоплазмы, так как количество клеток в областях SSC^low и SSC^high зависело от экспрессии в клетках миелоидного маркера CD11b. Количество ЦК с фенотипом № 5, которые экспрессировали CD11b, как у доноров, так и у пациентов с РМЖ в области SSC^high было больше, чем в SSC^low. В то же время количество ЦК с таким же фенотипом, но без экспрессии CD11b (№ 1) не различалось в областях SSC^low и SSC^high. При оценке частоты встречаемости оказалось, что каждый из восьми фенотипов ЦК с равной вероятностью находился в областях SSC^low и SSC^high. Это свидетельствует о том, что клетки с экспрессией одинаковых цитокератинов и/или CD11b имеют разную степень сложности внутриклеточной организации. Судя по результатам исследования разных по функциональной активности лимфоцитов [9], можно отметить, что клетки с высокой активностью располагаются в области SSC^high. По-видимому, такой вывод уместен и относительно изучаемых ЦК. ЦК с одинаковыми фенотипами, но с разными биофизическими свойствами, а значит и функциональными характеристиками, могут в разной степени быть ассоциированными с механизмами метастазирования. 

При обсуждении эпителиальных признаков ЦК следует уточнить некоторые методические особенности исследования. В работе использовали антиEpCAM моноклональные антитела с двумя разными флуоресцентными метками, что позволило выявить отдельно мембранную и внутриклеточную экспрессию EpCAM. Для этого антитела с первой меткой добавляли на этапе поверхностного окрашивания, а со второй — после проведения пермеабилизации. Оба используемых коммерческих антитела против EpCAM продуцируются клонами клеток EBA-1 и 9C4 и обладают специфичностью, позволяющей выявлять наличие маркера как на мембране, так и внутриклеточно, в зависимости от наличия этапа пермеабилизации [12]. Казалось бы, невозможно утверждать, что окрашивание после пермеабилизации выявляет только внутриклеточную экспрессию EpCAM, так как существует вероятность наличия свободных антигенных эпитопов на поверхности, несмотря на избыточное добавление антител на этапе поверхностного окрашивания. Однако в нашем наблюдении ни в одном из случаев не было выявлено ни одной клетки с одновременной экспрессией EpCAM на мембране и внутри клеток (в цитоплазме или в ядре), что позволяет говорить о наличии истинной «внутриклеточной» экспрессии EpCAM.

Потеря мембранной экспрессии EpCAM может происходить в процессе ЭМП вследствие транслокации молекулы [13, 14] или обусловлена RIP (regulated intramembrane proteolysis) и эндоцитозом мембранного EpCAM с конечной деградацией в протеосомах [15, 16]. Экспрессия использованных эпителиальных маркеров (E-cadherin и pan-Cytokeratin) при отсутствии mEpCAM и наличии icEpCAM позволяет предположить, что по крайней мере часть рассматриваемых ЦК является опухолевыми клетками в состоянии выраженного ЭМП. Эти клетки можно считать ЦОК. Однако, согласно современным данным, имеется и неопухолевое происхождение обсуждаемых ЦК. Описаны эпителиальные клеткипредшественники костномозгового происхождения [17, 18]. Имеются данные о том, что клетки из костного мозга, могут экспрессировать белки эпителиальных клеток и становиться эпителиальными клетками многих органов. Такие клетки негативны по лейкоцитарному маркеру CD45, но обладают экспрессией цитокератинов и выявляются только после предварительного повреждения эпителия. Это рассматривают как аргумент в пользу того, что костномозговые клетки предшественники эпителия предназначены для регенерации [19–21]. Приведенные результаты позволяют предположить, что исследуемые ЦК, экспрессирующие эпителиальные маркеры, но без экспрессии CD45, могут быть нормальными клетками, источником которых является костный мозг. Отсутствие этих клеток у доноров не препятствует такому предположению, поскольку их количество, вероятно, может достигать цифр, достаточных для обнаружения только в условиях рекрутирования в участки регенерации или микроокружение карцином, которые, как известно, рассматривают как «незаживающую рану» [22, 23].

Два фенотипа ЦК № 1 и № 5 лишены маркеров эпителиальности. ЦК № 1 экспрессировали только CD24, а № 5 — CD24 и CD11b⁺. ЦК с фенотипами № 1 и № 5 не только встречались чаще в сравнении с другими обнаруженными в крови фенотипами, но и были самыми многочисленными. Касаясь происхождения этих клеток можно предположить, что это эпителиальные клетки, но с утраченными, при достижении терминальной стадии ЭМП, эпителиальными признаками, либо эти ЦК имеют неэпителиальное происхождение и принадлежат к иной неизвестной популяции. 

Фенотипы ЦК № 1–4 были тождественны фенотипам № 5–8 по восьми из девяти исследуемым маркерам. Отличались эти группы фенотипов только экспрессией CD11b⁺ в ЦК № 5–8. Как известно, интегрин CD11b экспрессируется преимущественно на моноцитах/ макрофагах и нейтрофилах и некоторых субпопуляций дендритных клеток. CD11b представляет собой субъединицу интегрина альфа-M (αM CD11bCD18), которая входит в состав гетеродимера αMβ2. Данный интегрин служит рецептором для фибриногена и для молекулы адгезии эндотелия ICAM-1 [24]. CD11b опосредует клеточную адгезию, хемотаксис, миграцию, фагоцитарную активность, а также ингибирует воспалительные реакции, которые инициированы через Тoll-подобные рецепторы [25]. Одной из важнейших функций миелоидных клеток, экспрессирующих CD11b, является иммуносупрессия [26]. Каким может быть происхождение обнаруженных CD11b⁺-ЦК? Экспрессия CD11b наблюдается на достаточно поздней промоноцитарной стадии дифференцировки, в то время как CD45 должен экспрессироваться намного раньше: на стадии монобласта [27]. В связи с этим сомнительно, что рассматриваемые CD45^–D11b⁺-ЦК могут относиться к миелоидным элементам (тем более клетки, экспрессирующие эпителиальные маркеры). Уместно рассматривать ЦК, коэкспрессирующие CD11b⁺ и эпителиальные маркеры, как гибридные, возникающие вследствие гибридизации с миелоидными клетками. В таком случае ожидаема экспрессия лейкоцитарных маркеров. Не исключен и редко изучаемый, и обсуждаемый механизм ЭМП, при котором появляются не фибробластические, а лейкоцитарные признаки. Такой вариант ЭМП обоснован в одной из работ [28]. Наконец, если принять гипотезу костномозгового происхождения ЦК с эпителиальными признаками, то наличие миелоидного маркера могло быть результатом нелинейного процесса дифференцировки стволовых костномозговых клеток с наличием в дифференцировочном континууме клеток с нетипичными фенотипами.  

Необходимо уточнить, что проведенное исследование имеет ряд ограничений.

Проспективный характер исследования не позволил выяснить, действительно ли фенотипические особенности сочетания характера бокового светорассеяния с экспрессией CD11b⁺ и наличием признаков эпителиальности сопряжены с развитием гематогенных метастазов и безметастатической выживаемостью. Более длительное наблюдение позволит ответить на эти вопросы.

Малая выборка доноров (n = 11) могла ограничить выявление редких фенотипов ЦК в контрольной группе. Увеличение контрольной группы позволит уточнить наличие ЦК с экспрессией эпителиальных маркеров у доноров.

Неоднородность исследуемой группы пациенток с ИПКНТ также является ограничением исследования. Возможно, анализ изучаемых параметров в более однородных по молекулярно-биологическому подтипу группах пациентов позволит выявить ассоциации ЦК с эпителиальными признаками с более неблагоприятными подтипами РМЖ.

ВЫВОДЫ

Исследуемые ЦК являются гетерогенной популяцией. Все фенотипы клеток встречались в области как SSC^low, так и SSC^high. ЦК с экспрессией CD11b в большем количестве встречались в области SSC^high (p = 0,0020 — для доноров; p < 0,0001 — для пациенток с ИПКНТ). У пациенток с РМЖ из восьми обнаруженных фенотипов CD45^–mEpCAM^–CK7/8^– CD24⁺N-cadherin^– ЦК с разными вариантами коэкспрессии эпителиальных маркеров (E-cadherin, pan-Cytokeratin, и icEpCAM) и CD11b, шесть фенотипов имели признаки эпителиальности только по одному из маркеров. Все фенотипы ЦК были представлены двумя вариантами в зависимости от экспрессии CD11b. Самыми часто встречающимися и многочисленными были клетки с двумя фенотипами: CD45^– mEpCAM^–CK7/8^–CD24⁺N-Ecadherin^–panCK^–icEpCAM^–CD11b^– и CD45^–mEpCAM^–CK7/8^–CD24⁺N-Ecadherin^–panCK^–icEpCAM^– CD11b⁺. У доноров выявлялись только эти два фенотипа ЦК без эпителиальных признаков. Значение бокового светорассеяния ЦК с одинаковыми фенотипами является дополнительной характеристикой. В будущих исследованиях предстоит выяснить роль этого признака в ассоциации изучаемых ЦК с развитием отдаленных метастазов.