Исследование биотрансформации молекул-кандидатов — важнейший этап разработки лекарственных средств (ЛС) [1]. Образование токсичных метаболитов ЛС является фактором, вносящим существенный вклад в безопасность проводимой фармакотерапии и причиной неудач при проведении доклинических и клинических испытаний [2]. Наоборот, образование фармакологически активных метаболитов может значительно повышать эффективность применения ЛС [3], а также служить основой для разработки новых лекарственных молекул [4]. Сведения о биотрансформации ЛС имеют важное значение на этапе разработки состава и технологии производства лекарственных форм [5], а также позволяют прогнозировать многие лекарственные взаимодействия [6]. Кроме того, данные о путях метаболизма известных соединений лежат в основе целенаправленного конструирования молекул новых лекарственных кандидатов [7].

Основным органом, принимающим участие в биотрансформации ЛС, является печень [8]. Исследование метаболизма лекарственных кандидатов на этапе ранней разработки в основном осуществляют iv vitro путем инкубирования веществ с микросомальной фракцией печени, содержащей различные ферменты [9–11]. Данный подход общепринят, доступен и воспроизводим [12]. Кроме того, он позволяет идентифицировать отдельные цитохромы, участвующие в метаболизме конкретного вещества [13]. Однако такой способ имеет ряд существенных недостатков, среди которых можно выделить отсутствие возможности выявления продуктов внепеченочной биотрансформации ЛС [14]. Альтернативным подходом является исследование биотрансформации in vivo, при котором лабораторные животные получают исследуемый препарат, после чего через определенное время у них производят забор биологического материала (плазма крови, моча, фрагменты внутренних органов), который исследуют на предмет содержания вероятных метаболитов [15]. Полученные при этом результаты также не могут дать точное предстваление об участии печени в процессах биотрансформации ЛС.

Один из подходов к определению участия печени в метаболизме фармакологически активных веществ — исключение данного органа из системного кровотока хирургическим путем, проводимое непосредственно перед введением исследуемого препарата. Сравнение результатов хромато-масс-спетрометрического определения вероятных метаболитов в биоматериале, полученных от лабораторных животных с сосудистой изоляцией печени и без нее, позволяет сделать выводы о роли гепатоцитов в биотрансформации исследуемых молекул.

Цель настоящего исследования — разработка in vivo подхода к определению роли печени в биотрансформации молекул лекарственных кандидатов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Все экспериментальные работы, включая фармакологическую и биоаналитическую часть, были выполнены на базе научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВО Тверской ГМУ Минздрава России.

В качестве объекта экспериментального изучения участия печени в биотрансформации лекарственных средств использовали соединение-лидер BBP2023, представляющее собой производное сиднонимина, обладающее сосудорасширяющей активностью (рис. 1).

На первом этапе исследования на основании сведений об общих путях биотрансформации ксенобиотиков осуществляли прогнозирование структуры предполагаемых метаболитов соединения BBP2023, для которых рассчитывали точные значения моноизотопных масс (табл. 1).

На втором этапе проводили фармакологический эксперимент, целью которого было получение биологического материала (плазма крови), содержащего вероятные метаболиты. Исследования были выполнены на самцах крыс Wistar пола массой около 250 г (питомник ООО «СМК СТЕЗАР», Россия). Клетки с животными находились в контролируемых условиях окружающей среды (20–26 °C и 30–70% относительная влажность). В комнатах содержания животных поддерживали 12-часовой цикл освещения и производили 8–10-кратную смену объема воздуха в  час. Крыс кормили полнорационным комбикормом ПК-120 («Лабораторкорм», Россия), поили фильтрованной водопроводной водой ad libitum. Чистку клеток, влажную уборку комнат, а также замену бутылок с водой на новые осуществляли ежедневно. Вечером накануне эксперимента животные были лишены корма.

В ходе проведения исследования трем крысам однократно внутрижелудочно вводили активную фармацевтическую субстанцию (АФС) BBP2023 в форме 10%-й эмульсии кукурузного масла в дозе 1/100 LD₅₀. Через 3 ч после введения препарата производили забор крови из хвостовой вены крыс в объеме 0,1 мл с помощью инсулинового шприца, содержащего 2 ME гепарина натрия. Собранную кровь немедленно переносили в пробирки типа Эппендорф объемом 0,2 мл, плазму получали с помощью лабораторной центрифуги LMC-4200R (Biosan, Латвия) при комнатной температуре и частоте вращения ротора 3000 об./мин в течение 10 мин. Полученную плазму в объеме 50 мкл объединяли с 800 мкл метанола с добавлением 0,5% муравьиной кислоты, пробы перемешивали на вортексе Microspin FV-2400 (Biosan, Латвия) в течение 15 с, выдерживали при температуре –40 °С — в морозильнике MDF-136 (Sanyo, Япония) в течение 30 мин, после чего супернатант отделяли с помощью центрифуги D-37520 (Sigma, Германия) при ускорении 15 000 g и температуре –10 °С в течение 20 мин. Надосадочную жидкость пропускали через мембранный фильтр 0,22 мкм («Лаборатория воды», Россия), напрямую вводили в электрораспылительный источник ионов масс-спектрометра AB Sciex 3200 MD Qtrap (Sciex, Сингапур) с помощью встроенного шприцевого насоса со скоростью 10 мкл/мин. Вначале проводили масс-спектрометрический анализ соединения BBP2023 с целью идентификации характеристических ионов-продуктов (режим Product Ion). Учитывая, что потенциальные метаболиты при фрагментации могут образовывать ионы-продукты, по значению m/z (отношение массы к числу зарядов) совпадающие с фрагментарными ионами соединения BBP2023, проводили обратный скрининг молекулярных ионов по соответствующим ионампродуктам (режим Precursor Ion). Выявленные сигналы сравнивали с теоретически рассчитанными значениями моноизотопной массы предполагаемых метаболитов. В случае совпадения этих значений выявленные продукты биотрансформации соединения BBP2023 подвергали масс-спектрометрическому анализу в режиме Productr Ion с целью косвенного подтверждения химической структуры. Результаты масс-спектрометрического исследования в дальнейшем были использованы для детектирования предполагаемых метаболитов в режиме мониторинга множественных реакций (MRM) при осуществлении хроматографического анализа плазмы крови интактных крыс и животных, получавших соединение BBP2023. С этой целью были подобраны условия хроматографирования, указанные в табл. 2.

Для оценки участия печени в биотрансформации соединения BBP2023 на третьем этапе эксперимента у трех крыс было осуществлено оперативное вмешательство с целью исключения данного органа из системного кровотока. В зоне проведения операции у животных полностью удаляли шерсть с кожи, для премедикации подкожно вводили 0,1%-й раствор атропина сульфата («Дальхимфарм», Россия) в дозе 0,04 мг/кг). Крыс позиционировали на спине. Под наркозом, вызванным подкожным введением комбинации тилетамина гидрохлорида 5 мг, золазепама 5 мг (Золетил, Virbac, Франция) и ксилазина 4 мг («Нита-Фарм», Россия), производили верхнесрединную лапаротомию, петли кишечника извлекали, отводили влево, оборачивали салфетками, смоченными подогретым стерильным физиологическим раствором, устанавливали ранорасширитель Адсона. Выделяли воротную вену (vena portae) и чревный ствол (truncus celiacus), перевязывали нитью лавсан USP 3/0 («Медтехника», Россия) и пересекали между лигатурами (рис. 2). Важный момент при перевязке воротной вены — наложение лигатур до начала отхождения от нее ветвей, идущих в печень. После сосудистой изоляции печени в подпеченочный сегмент нижней полой вены (vena cava inferior) с помощью инсулинового шприца с иглой 30G (Inecta, Китай) вводили раствор (27,5 мг/мл) соединения BBP2023 в объеме 0,1 мл (1/100 LD₅₀), на место прокола накладывали гемостатическую губку («Лужский завод Белкозин», Россия). После достижения гемостаза лапаратомную рану ушивали послойно.

Через 3 ч после введения препарата производили забор крови из хвостовой вены крыс; получение и дальнейшую пробоподготовку плазмы осуществляли по ранее указанной методике. Обработанные образцы подвергали хроматографическому анализу с целью обнаружения метаболитов соединения BBP2023. Кроме того, выполняли исследование биоматериала, полученного от интактных крыс и ложнооперированных животных (без изоляции печени), которым внутривенно вводили препарат аналогичным образом. После забора крови животных подвергали эвтаназии с помощью ингаляции углекислого газа.

Обработку первичных данных хромато-массспектрометрического анализа выполняли с помощью встроенного программного обеспечения (ПО) AB Sciex Analyst 1.3.6 (AB Sciex, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В результате скрининга плазмы крови крыс, которым внутрижелудочно вводили исследуемый препарат, было выявлено наличие метаболита, представляющего собой соединение BBP2023, лишенное этоксикарбонильной группы. Кроме этого, обнаружен продукт, образующийся после отщепления монооксида азота (NO) от вышеуказанной молекулы. Данный факт может косвенно свидетельствовать о предполагаемой фармакодинамике исследуемого соединения-лидера. Также в результате скрининга были выявлены моно- и дигидроксилированные производные вышеуказанных метаболитов и исходного соединения, а также эфиры этих соединений с глюкуроновой кислотой (табл. 3). Некоторые выявленные метаболиты были синтезированы и использованы в качестве стандартов для постановки методики и последующего проведения хроматографического анализа. Совпадение времени удерживания данных соединений подтверждает правильность их идентификации на этапе скрининга.

По результатам исследования плазмы интактных крыс не выявлено хроматографических пиков, соответствующих соединению BBP2023 и его метаболитам, что подтверждает селективность разработанной методики идентификации. Анализ образцов плазмы ложнооперированных животных (без изолирования печени), которым внутривенно вводили исследуемое соединение в дозе 1/100 LD₅₀ за 3 ч до забора крови, позволил обнаружить хроматографические сигналы всех выявленных на втором этапе продуктов биотрансформации (рис. 3).

Результаты хроматографического анализа плазмы крови крыс, которые получали АФС BBP2023 в аналогичной дозе после осуществления сосудистой изоляции печени, подтвердили наличие сигнала, соответствующего исходному соединению. При этом площадь хроматографического пика превышала таковую при анализе биоматериала, полученного от ложнооперированных животных, в среднем в 2,8 раз. Кроме того, выявлено отсутствие пиков, соответствующих ранее обнаруженным продуктам биотрансформации соединения BBP2023 (рис. 4).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные результаты позволяют сделать заключение о непосредственном участии печени в образовании идентифицированных метаболитов соединения BBP2023 у крыс. Важным фактором при осуществлении вышеописанного эксперимента было использование абсолютно здоровых животных, так как любые повреждения гепатоцитов, приводящие к появлению в плазме крови печеночных ферментов, могут существенно повлиять на достоверность полученных результатов. Одним из недостатков данного подхода является невозможность исследовать препараты, имеющие исключительно энтеральные лекарственные формы. Попадание изучаемого вещества в системный кровоток в этом случае невозможно по причине наложения лигатуры на воротную вену. Кроме того, при проведении данного эксперимента следует учитывать возможное взаимодействие лекарственного кандидата с компонентами наркоза.

Одним из вариантов реализованного подхода является использование временного ограничения кровотока через печень путем наложения хирургических клипс на соответствующие сосуды. Через определенное время после введения препарата осуществляется забор крови с последующим восстановлением кровотока. Повторное взятие крови через установленный временной интервал с дальнейшим анализом плазмы на предмет наличия метаболитов позволит учитывать индивидуальные особенности животного в биотрансформации конкретного лекарственного кандидата. Вероятно, подобный подход может быть реализован и в отношении других органов, например почек.

ВЫВОДЫ

Предложенный в настоящем исследовании подход к оценке участия печени в биотрансформации кандидатных молекул на ранних этапах разработки лекарственных средств является универсальным и информативным. Он может быть использован как самостоятельный прием изучения метаболизма in vivo, так и в дополнении к широко применяемым методам in vitro. Полученные в ходе реализации данного подхода результаты могут служить основой для прогнозирования фармакокинетики, эффективности и безопасности лекарственных средств.