Болезнь Альцгеймера остается одним из наиболее социально значимых нейродегенеративных заболеваний и является основной причиной возникновения деменции у пожилых людей [1, 2]. Ее распространенность экспоненциально растет с возрастом: 53 новых случаев на 1000 человек в возрасте 65–74 лет; 170 новых случаев на 1000 человек в возрасте 75–84 лет и 230 новых случаев на 1000 человек в возрасте старше 85 лет [3, 4]. Патогенез заболевания сложен и многокомпонентен, однако достаточно часто этот процесс сопровождается накоплением β-амилоида (Aβ) в виде сенильных бляшек в коре головного мозга [5]. Aβ представляет собой пептид, который имеет длину 39–43 аминокислотных остатков и образуется из белка-предшественника Aβ (APP) [6] — этот уникальный процесс расщепления APP обеспечивает важные мишени для лечения болезни Альцгеймера [7]. Два основных пептида имеют длину 40 (Aβ₄₀) и 42 (Aβ₄₂) аминокислотных остатка. Aβ₄₂ проявляет склонность к агрегации in vivo и часто считается более токсичным [8, 9]. Накопление Aβ₄₂ приводит к каскаду патологических нарушений, включающих образование олигомеров и фибрилл, активацию нейровоспаления, нарушение синаптической передачи, гибель нейронов [6, 10, 11]. Детальное изучение амилоидной и других патогенетических гипотез, к сожалению, не привело к созданию по-настоящему действенных терапевтических стратегий, развитие которых продолжается с момента первого описания заболевания в 1906 г. [12]. Современные методы диагностики болезни Альцгеймера остаются труднодоступными для широкого применения ввиду технической сложности и значительных финансовых затрат. В этой связи особый интерес представляют малые молекулы, способные специфично связываться с Aβ, а их многофункциональность и возможность химической модификации открывают перспективы для разработки более доступных диагностических платформ. Среди таких молекул наиболее перспективными оказались короткие пептидные последовательности — в частности, тетрапептиды HAEE (His-Ala-Glu-Glu) и HASS (His-AlaSer-Ser), которые сочетают высокую аффинность к β-амилоиду, ингибирование его агрегации, хорошие фармакокинетические свойства и способность преодолевать гематоэнцефалический барьер [13]. Для реализации их диагностического потенциала необходимо детальное изучение фармакокинетических свойств, включая их биораспределение, способность преодолевать гематоэнцефалический барьер и динамику выведения из организма. Настоящее исследование направлено на комплексную характеристику этих параметров с использованием флуоресцентно-меченых аналогов HAEE и HASS в моделях на животных.

Его цель — определить фармакокинетические параметры тетрапептидов HAEE и HASS у здоровых животных, включая период полувыведения (T_1/2), для оценки их биораспределения, стабильности in vivo и перспектив дальнейшего применения в качестве основы для радиофармпрепаратов или терапевтических средств.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Все экспериментальные работы проводили в исследовательской лаборатории отдела медицинских нанобиотехнологий, а также в отделе регенеративной медицины научно-исследовательского института трансляционной медицины РНИМУ им. Н. И. Пирогова.

IVIS-визуализация in vivo/ex vivo

Самки мышей породы BALB/c возрастом 3 месяца, весом 20–25 г были приобретены в питомнике научного центра биомедицинских технологий Федерального медикобиологического агентства России филиала «Столбовая» (Московская область, Россия).

Мыши имели свободный доступ к пище и воде. Животные получали комбикорм полнорационный экструдированный для лабораторных животных — мышей, крыс, хомяков («Лаборантснаб», Россия). Световой день составлял 12 ч (с 7:00 до 19:00), освещенность в светлый период цикла — 70–90 лкс, температура в помещение постоянного содержания — 22 °С.

В каждом эксперименте участвовало пять животных. Исследуемые пептиды HAEEGGGGK-Cy5 и HASSGGGGK-Cy5 (чистота > 95% по данным ВЭЖХ). Перед введением пептиды растворяли в стерильном 0,9%-м растворе NaCl до конечной концентрации 250 мкМ. Полученные растворы фильтровали через 0,22 мкм фильтр и вводили внутривенно в хвостовую вену (n = 4 животных на группу) в объеме 100 мкл. Контрольной группе вводили 100 мкл 0,9%-го раствора NaCl.

Визуализацию прижизненной флуоресценции осуществляли с помощью IVIS Spectrum CT imaging system (Perkin Elmer, США) во временных точках 15 мин, 1 ч, 2 ч, 3 ч, 4 ч, 5 ч, 6 ч, 24 ч после введения. Все съемки флуоресценции выполняли под ингаляционной анестезией 2%-м изофлюраном (Аерран, Baxter HealthCareCorporation, США) в смеси с воздухом.

Для последующих экспериментов животных анестезировали внутрибрюшинной инъекцией тилетамина (Золетил, Virbac, Франция), после чего выполняли транскардиальную перфузию. Для этого надрезали правое предсердие, в левый желудочек вставляли канюлю и промывали кровеносное русло последовательно стерильным фосфатно-солевым буфером (Sigma-Aldrich, США) и раствором 10%-го забуференного формалина HistoSafe (Biovitrum, Россия). Затем извлекали органы и выполняли ex vivo съемку их флуоресценции.

Анализ флуоресценции и кинетическое моделирование

Эмиссию фотонов обсчитывали с использованием программы Living Image 4.3 с выбором региона интереса (ROI). Значения флуоресценции контрольного животного для каждой временной точки вычитали из значений флуоресценции животных для устранения систематических ошибок измерения. Для органов выполняли то же самое.

Широкопольная флуоресцентная микросокпия

Криосрезы толщиной 10 мкм были получены при помощи криотома HM525 (Thermo Scientific, США). Для дальнейшего анализа срезы фиксировали в 10%-м растворе забуференного формалина (Biovitrum, Россия) в течение 15 мин, последовательно 3 раза отмывали в фосфатно-солевом буферном растворе без Ca²⁺ и Mg²⁺ («ПанЭко», Россия) и заключали со средой VECTASHIELD Atifade Mounting Medium with DAPI (VectorLabs, США). Изображения были получены при помощи cистемы для визуализации EVOS FL Auto (Thermo Scientific, США).

Статистический анализ

Анализ данных выполняли с помощью GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, США). График зависимости интенсивности флуоресцентного сигнала от времени представлен в виде средних значений со среднеквадратичными отклонениями с линией тренда для двухкамерной модели. График накопления препарата в органах ex vivo содержит среднее, максимальное и минимальное значения в группе.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

После однократного внутривенного введения флуоресцентных пептидов HAEE и HASS мышам BALB/c были зарегистрированы временные изменения интенсивности флуоресценции (табл. 1). Оба соединения демонстрировали быструю системную абсорбцию с достижением максимума концентраций через 0,25 ч после введения, при этом HASS ((1,31 ± 0,19) × 10⁹ ф/с/см²/ср) показал на 6,5% более высокую интенсивность флуоресценции по сравнению с HAEE ((1,23 ± 0,18) × 10⁹ ф/с/см²/ср) с последующим экспоненциальным снижением показателей. Более наглядно полученные результаты представлены на рис. 1.

Построение полученных кинетических профилей в логарифмической шкале позволяют предположить двухкамерную модель элиминации пептидов HASS и HAEE (рис. 2).

Кинетические кривые HAEE и HASS (рис. 1, рис. 2), описываемые двухкамерной моделью (Ap = A₁ · e⁻ᵅᵗ + A₂ · e⁻ᵝᵗ), демонстрируют существенные различия в параметрах элиминации (табл. 2): HASS характеризуется доминированием быстрой фазы (96,43% против 93,37%), более высокой константой скорости — (3,11 ч^–1 против 1,6 ч^–1) и укороченным T_½α (0,22 ч против 0,43 ч), что коррелирует с крутым начальным спадом на графиках, тогда как HAEE проявляет пролонгированную элиминацию с удлиненным T_½β (4,39 ч против 2,76 ч), характеризуется пологим спадом на кинетической кривой и большим AUC (3,69 × 10⁹ против 1,51 × 10⁹ ч·ф/с/см²/ср), что указывает на его потенциальное преимущество для длительной диагностики.

Исследование ex vivo накопления пептидов HAEE и HASS проводили через 24 ч после инъекции. Согласно полученным данным (рис. 3), пептиды демонстрируют различную органную специфичность: HAEE преимущественно локализуется в почках, тогда как HASS — в печени. Оба соединения накапливаются в легких и в мозге без статистически значимых межгрупповых различий (p > 0,05). В сердце и селезенке флуоресцентная интенсивность в группе HAEE была достоверно выше по сравнению с группой HASS (p < 0,05).

Более длительный период полувыведения HAEE обусловлен его преимущественной почечной элиминацией, что подтверждено флуоресцентной микроскопией срезов, выявившей интенсивное накопление флуоресцентного сигнала в эпителии почечных канальцев (рис. 4), что согласуется с данными IVIS (рис. 5), где почки демонстрируют более высокий флуоресцентный сигнал по сравнению с другими органами через 24 ч, тогда как HASS преимущественно аккумулируется в печени (рис. 5).

Исследование репрезентативных микрофотографий срезов тканей почек мыши подтверждает повышенное содержание HAEE в виде скопления большого числа Су⁵⁺ агрегатов в клетках проксимальных канальцев эпителия почек (рис. 4А, Б) в сравнении с HASS (рис. 4В, Г).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Наши исследования выявили существенные различия в биораспределении пептидов HAEE и HASS, что может быть объяснено их структурно-функциональными особенностями. HAEE, обладая небольшой молекулярной массой (< 2 кДа) и слабым отрицательным зарядом, демонстрирует преимущественно почечную экскрецию. Этот процесс характерен для низкомолекулярных пептидов [14], которые после клубочковой фильтрации подвергаются реабсорбции через пиноцитоз. Наличие флуоресцентной метки Cyanine 5 (Cy5) в структуре пептида может увеличивать его липофильность, способствуя проникновению через клеточные мембраны, в частности, в эпителий проксимальных канальцев почек, что объясняет наблюдаемое накопление соединения в почечной ткани. Нельзя также исключить возможность специфического взаимодействия пептида с клеточными рецепторами, однако этот аспект требует дальнейшего изучения. Проникновение HAEE в печень может осуществляться посредством облегченного транспорта через мембраны гепатоцитов и клеток Купфера. Кроме того, учитывая ключевую роль печени в процессах метаболизма и детоксикации, накопление пептида в этом органе может быть связано с его биотрансформацией или активным транспортом через гепатоциты. При системном введении легочный эпителий также проницаем для малых липофильных молекул [15], что подтверждается обнаружением флуоресцентного сигнала в легких. Экспериментальные исследования на мышах BALB/c продемонстрировали, что HAEE характеризуется преимущественно почечным выведением, что подтверждается тремя ключевыми наблюдениями: 1) высокой флуоресцентной интенсивностью в почках через 24 ч после введения, зарегистрированной как методом IVIS-визуализации, так и флуоресцентной микроскопией; 2) пролонгированным периодом полувыведения (T_½β = 4,39 ч), что объясняется процессом реабсорбции в почечных канальцах; 3) быстрой начальной элиминацией (T_½α = 0,43 ч), свидетельствующей об отсутствии стабильных комплексов с белками плазмы крови.

В отличие от HAEE, пептид HASS обладает нейтральным зарядом и демонстрирует принципиально иные фармакокинетические характеристики. Его пиковый флуоресецнтный сигнал на 6,5% превышает аналогичный показатель HAEE, что, вероятно, обусловлено уменьшенным связыванием с тканевыми структурами. Для HASS характерна ускоренная элиминация с периодами полувыведения T_½α = 0,22 ч и T_½β = 2,76 ч, обусловленная, скорее всего, активным захватом гепатоцитами. Исследования ex vivo через 24 ч после введения подтвердили избирательное накопление пептида в печеночной ткани.

Несмотря на схожие размеры (< 2 кДа), HAEE показывает в 1,7 раз лучшую проницаемость гематоэнцефалического барьера (AUC (0→∞)), вероятно, благодаря электростатическим эффектам и особенностям взаимодействия с транспортными системами.

Полученные результаты демонстрируют выраженные различия в органном распределении исследуемых пептидов. В частности, установлено, что HAEE преимущественно экскретируется почками, что определяет его потенциальную диагностическую ценность при почечных патологиях. В отличие от HAEE, HASS проявляет выраженную гепатоспецифичность и высокую скорость печеночного метаболизма, что позволяет рассматривать его как перспективную основу для разработки печеночно-

направленных систем доставки. Присутствие метки Cy5 увеличивает липофильность обоих пептидов, что способствует их проникновению через клеточные мембраны, однако ограниченное прохождение через гематоэнцефалический барьер (особенно для HASS) указывает на необходимость структурной оптимизации для нейродиагностических применений. Для более полного понимания механизмов биораспределения тетрапептидов требуются дополнительные исследования: 1) идентификация транспортных систем (мегалин/OATP (транспортный полипептид органических анионов)); 2) полный метаболический профиль в биологических жидкостях; 3) корреляция между структурными изменениями пептидов и их органным распределением.

ВЫВОДЫ

Таким образом, проведенное сравнительное исследование выявило фундаментальные различия в поведении HAEE и HASS in vivo. Пептиды демонстрируют не только различную органную тропность, но и принципиально разные фармакокинетические профили (включая период полувыведения T_1/2), что открывает перспективы для их дифференцированного применения в диагностике и направленной доставке лекарств. Установлено, что HAEE с коротким T_1/2 и почечной экскрецией перспективен для разработки диагностических радиофармпрепаратов, тогда как HASS с гепатотропностью и быстрым печеночным метаболизмом представляет интерес для создания систем направленной доставки. Следует отметить, что полученные результаты были установлены на модели здоровых мышей. Эти данные требуют дальнейшего изучения на моделях трансгенных животных с болезнью Альцгеймера, но уже сейчас предлагают новые стратегии для комплексной терапии, сочетающей органоспецифичный транспорт пептидов и патогенетическое воздействие. Кроме того, влияние флуоресцентной метки на фармакокинетические параметры нуждается в отдельной оценке.