В-клетки и продуцируемые ими антитела обеспечивают эффективный иммунный ответ на патогены и вакцины. В процессе антиген-зависимой дифференцировки наивные В-клетки дают начало антитело-секретирующим клеткам (АСК) и клеткам памяти [1]. Помимо обеспечения гуморального иммунного ответа В-клетки могут выступать в качестве антиген-презентирующих клеток (АПК) [2]. При связывании антигена с В-клеточным рецептором (ВКР) комплекс интернализуется, и процессированные пептиды представляются на поверхности клетки в комплексе с MHCII для дальнейшего взаимодействия с CD4⁺-Т-хелперами (Th) [3]. Ключевые сигналы, которые получают В-клетки в процессе клеточной кооперации с Тh, включают в себя CD40-CD40L взаимодействие, а также секретируемые цитокины IL-21 и IL-4 [4]. Получившие Т-клеточную помощь В-клетки пролиферируют и могут дифференцироваться в короткоживущие АСК или В-клетки герминативных центров (ГЦ), для которых ключевым транскрипционным фактором является Bcl6 [5, 6].

Уникальные свойства В-клеток положили начало разработке методик для их культивации in vitro с целью использования для различных прикладных задач: получения АПК с дальнейшим анализом антигенспецифичного Т-клеточного ответа, генерации АСК для производства антител [7, 8], создания клеточных моделей для изучения биологии лимфом [9]. Во многих работах оценивали влияние CD40L и его уровня, цитокинов, продуцируемых Т-клетками, а также цитокинов, секретируемых микроокружением внутри ГЦ, например BAFF, на В-клеточные культуры с целью изучения экспансии В-клеток и образования АСК [10–12]. Однако исследования образования Bcl6⁺-В-клеток ГЦ в культурах из человеческих В-клеток были ограниченными. Цель данной работы — подобрать оптимальные условия для экспансии В-клеток, а также для эффективной генерации АСК и/или В-клеток ГЦ in vitro.

В нашем исследовании был проведен анализ культур, полученных из наивных В-клеток и CD27⁺-Вклеток памяти из периферической крови человека под влиянием Т-клеточных сигналов (CD40L, IL-21, IL-4), BAFF и дополнительных компонентов среды, а также проведена оценка экспансии В-клеток и накопления АСК и Bcl6⁺-Вклеток ГЦ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн плазмиды pcDNA-hCD40LG

Последовательность гена человеческого CD40LG (NM_000074.3) была получена с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) из тотатальной кДНК мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови человека с использованием прямого 5'-ATATGGATCCGCCACCATGATCGAAACATACAACCA-3' и обратного 5'- ATATGAATTCACACTGTTCAGAGTTTGAGTAAGCC-3' праймеров. В последовательности праймеров были включены сайты рестрикции BamHI и EcoRI на 5' и 3'-концах гена CD40LG соответственно, а также последовательность Козак (GCCACCATG) на 5'-конце гена. После обработки полученного ПЦР-продукта и вектора pcDNA3.1+ (Thermo Fisher Scientific, США, кат. № V79020) эндонуклеазами рестрикции BamHI-HF и EcoRI-HF (New England Biolabs, США, кат. № R3136 и № R3101) было проведено их лигирование с использованием набора Quick Ligation™ Kit (New England Biolabs, США, кат. № M2200) с последующей трансформацией E. coli штамм NEB Stable (New England Biolabs, США, кат. № C3040H). Очистку и выделение плазмиды для дальнейшей трансфекции производили с использованием набора Plasmid Miniprep 2.0 («Евроген», Россия, кат. № BC221).

Получение фидерной линии мышиных фибробластов, экспрессирующих человеческий CD40L (3T3-hCD40L)

Фидерная линия 3T3-hCD40L была получена на основе клеточной линии мышиных фибробластов NIH 3T3 из коллекции клеточных культур Института вирусологии имени Д. И. Ивановского. Культивирование NIH 3T3 клеток производили в среде DMEM («ПанЭко», Россия, кат. № С415п) с добавлением 10% бычьей фетальной сыворотки (FBS, STEMCELL Technologies, Канада, кат. № 06472), 1× смеси антибиотиков пенициллина и стрептомицина («ПанЭко», Россия, кат. № А065п). Пассирование клеток осуществляли каждые 3–4 дня. Для получения клонов NIH 3T3, стабильно экспрессирующих hCD40L, клетки трансфецировали плазмидой pcDNAhCD40LG с использованием реагента Lipofectamine® 3000 (Thermo Fisher Scientific, США, кат. № L3000015) согласно инструкции с последующей селекцией клонов на среде DMEM с добавлением генетицина G418 (0,5 мг/мл; Thermo Fisher Scientific, США, кат. № 10131027). Получение моноклональной линии производили методом предельных разведений. Экспрессию CD40L оценивали методом проточной цитометрии с использованием анти-CD154FITC-антител (1 : 20; клон TRAP1, BD Bioscience, США, кат. № 561721). В работе использовали моноклональную линию с самым высоким уровнем экспрессии CD40L (рис. 1А).

Выделение МНК из периферической крови здоровых доноров

Исследование проводили в соответствии с требованиями Хельсинкской декларации 2013 г. Критерии исключения пациентов: наличие инфекционного заболевания в острой фазе; наличие аутоиммунных, хронических заболеваний. Периферическую кровь здоровых доноров отбирали в вакуумные пробирки, содержащие K3ЭДТА в качестве антикоагулянта. Всего в исследовании приняли участие четыре донора, не связанные генетическим родством, возрастом от 21 до 65 лет (медиана — 39 лет). Соотношение мужчин и женщин — 1 : 1. Выделение МНК производили на градиенте фиколла («ПанЭко», Россия, кат. № Р050Е) в соответствии с протоколом [13]. Полученные клетки в охлажденном буфере для сортировки клеток (0,5% FBS в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (DPBS)). Подсчет клеток осуществляли на счетчике CytoSMART Cell Counter (Corning, США) с использованием трипанового синего. Выживаемость клеток была > 95%.

Окрашивание В-клеток для анализа на проточном цитофлуориметре (FACS)

Анализ В-клеток проводили методом проточной цитометрии с использованием антител к поверхностным клеточным маркерам CD19, CD27, CD38, CD95 (Fas), а также внутриклеточному транскрипционному фактору Bcl6. Окрашивание и хранение клеток производили при +4 °С. Для сортинга всех В-клеток (CD3^–CD19⁺CD20⁺) 20 × 10⁶ МНК предварительно инкубировали в блокирующем растворе с добавлением 10 мкг/мл Human Fc-block (клон K112-91, BD Biosciences, США, кат. № 564220) в течение 10 мин на льду, после чего окрашивали смесью антител анти-CD3-R718 (1 : 100, клон SK7; BD Biosciences, США, кат. № 751978), анти-CD19-BV510 (1 : 100, клон SJ25C1; BD Biosciences, США, кат. № 562947), анти-CD20-FITC (1 : 20, клон L27; BD Biosciences, США, кат. № 347673) в течение 30 мин на льду в темноте. Для сортинга CD3-CD19⁺CD20⁺CD27^– наивных В-клеток и CD3^–CD19⁺CD20⁺CD27⁺ В-клеток памяти МНК дополнительно окрашивали анти-CD27-PerCP-Cy5.5 (1 : 50, клон M-T271; BioLegend, США, кат. № 356408). После окрашивания клетки ресуспензировали в буфере для сортировки. Для оценки фенотипа В-клеточных культур на 7-й день клеточный супернатант отбирали из лунок без последующей трипсинизации. Отобранные клетки ресуспензировали в блокирующем буфере, после чего окрашивали с использованием следующей смеси антител: анти-CD19-BV510 (1 : 100), анти-CD27PerCP-Cy5.5 (1 : 50), анти-CD38-APC-R700 (1 : 50, клон HIT2; BD Biosciences, США, кат. № 564979), анти-CD95PE (1 : 100, клон DX2; BioLegend, США, кат. № 305608). Перед цитометрическим анализом клетки окрашивали с использованием Helix NP Blue в концентрации 25 нМ (Biolegend, США, кат. № 425305) для исключения мертвых клеток. Внутриклеточное окрашивание клеток производили с использованием набора True-Nuclear™ Transcription Factor Buffer Set (BioLegend, США, кат. № 424401) и антител анти-Bcl-6-AlexaFluor488 (1 : 20, клон: K112-91; BD Biosciences, США, кат. № 561524) в течение 12 ч. При цитометрическом анализе культур определяли следующие субпопуляции: CD19⁺CD27^highCD38^high (определяемые как АСК), СD19⁺CD38^–CD27^–, СD19⁺CD38^–CD27⁺, СD19⁺CD38⁺CD27^– В-клетки, CD19⁺CD95^high В-клетки (соответствующие активированным В-клеткам), CD19⁺CD95^highBcl6⁺ В-клетки (определяемые как В-клетки ГЦ). Сортинг В-клеток и цитометрический (FACS)-анализ В-клеточных культур проводили на клеточном сортере BD FACSAria™ III с использованием программного обеспечения FACSDiva™. Для обработки данных использовали FlowJo версии 10.8.1.

Культивирование В-клеток в присутствии клеток фидерной линии

Фибробласты 3T3-hCD40L или контрольные нетрансфециронные клетки инактивировали в среде DMEM митомицином С (5 мкг/мл; Sigma Aldrich, США, кат. № 50-07-7) в течение 2 ч, отмывали DPBS («ПанЭко», Россия, кат. № Р060Е) не менее 3 раз и пересаживали на шестилуночный планшет (Wuxi NEST, кат. № 703002) в количестве 3 × 10⁵ кл./лунка. На следующий день добавляли 1,5 × 10⁴ отсортированных CD19⁺CD20⁺-В-клеток. Культивирование производили в средах: RPMI-1 на основе RPMI-1640 («ПанЭко», Россия, кат. № С330п) с включением 10% FBS, 1× пирувата натрия («ПанЭко», Россия, кат. № Ф023), 1× GlutaMAX™ (Thermo Fisher Scientific, США, кат. № 35050061), 1× смеси антибиотиков) и RPMI-2 на основе richRPMI (BioinnLabs, кат. № bn-3A3R), содержащую человеческий трансферрин, инсулин, альбумин, а также глутатион и дополнительные микроэлементы и витамины, с включением  10% FBS, 1× GlutaMAX™, 1× антибиотики. Рекомбинантный человеческий IL-21 (rhIL-21, SCI-store, Россия, кат. № PSG260) добавляли в среды в концентрации 50 нг/мл. CD20⁺CD27^– и CD20⁺CD27⁺ В-клетки культивировали в RPMI-2 с добавлением IL-21 ± IL-4 (SCI-store, Россия, кат. № PSG040, 10 нг/мл) и ± BAFF (BioLegend, США, кат. № 559604, 100 нг/мл). Культивирование производили в течение 7 дней с обновлением среды на 3-й и 5-й дни. Схемы экспериментов с культивированием всех CD19⁺CD20⁺-В-клеток, а также CD19⁺CD20⁺CD27^– наивных и CD19⁺CD20⁺CD27⁺-В-клеток памяти в исследуемых и контрольных условиях представлены в табл. 1 и табл. 2.

Статистический анализ результатов

Независимые опыты, указанные в исследовании, проводили на МНК из крови четверых генетически не связанных взрослых доноров. Статистический анализ был проведен с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версия 9.5.1 (GraphPad Software Inc, США). Применяемые статистические методы указаны в подписях к рисункам. Различия между группами, не имеющие статистической значимости, не отмечены на графиках. Выбросы не исключены.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На первом этапе работы было установлено, каким образом наличие CD40L, цитокина IL-21 или специализированных добавок в клеточной среде воздействует на выживаемость и экспансию В-клеток, а также образование АСК и В-клеток ГЦ (рис. 1, рис. 2). Для продолжительной кокультивации В-клеток с человеческим CD40L (hCD40L) была получена трансгенная клеточная линия мышиных фибробластов NIH 3T3, стабильно экспрессирующая hCD40L (3T3-hCD40L) (рис. 1А).

В-клетки (CD19⁺CD20⁺) были получены из МНК периферической крови человека в результате флуоресцентного сортинга (с чистотой популяции > 99%). 1,5 × 10⁴ В-клеток культивировали в течение 7 дней в шестилуночном планшете в присутствии фидеров 3T3-hCD40L, или контрольных нетрансфецированных 3T3-клеток. Для культивации использовали две среды: стандартную RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, натрия пирувата, глутамина (обозначенная как RPMI-1) или такую же среду, обогащенную добавками из человеческой сыворотки, включая рекомбинантный инсулин, трансферрин, липид-обогащенный альбумин, глутатион, а также дополнительными микроэлементами и витаминами (RPMI-2). IL-21 добавляли в концентрации 50 нг/мл (табл. 1).

Цитометрический анализ полученных В-клеточных культур (рис. 1Б) показал, что при совместном действии hCD40L и IL-21 достигается наибольший уровень экспансии В-клеток (рис. 1В) и увеличивается выживаемость В-клеток, особенно при включении в среду добавок в виде рекомбинантных белков из человеческой сыворотки (рис. 1Г).

В культурах с hCD40L и IL-21 также наблюдается наибольшее накопление CD27^highCD38^high АСК (рис. 1Д, Е), повышение числа (но не процентного содержания) CD27^–CD38^–-В-клеток (рис. 1Ж, З) и накопление CD27⁺- и CD38⁺-В-клеток (рис. 1И–М), причем при культивировании в RPMI-1 процент CD27^–CD38⁺-В-клеток был заметно выше (рис. 1Л).

В-клетки ГЦ характеризуются повышенной поверхностной экспрессией CD95 (Fas) и присутствием внутриклеточного транскрипционного фактора Bcl6 [5]. Экспрессия CD95 также повышается на активированных В-клетках [15]. Исходя из этого, мы оценили экспрессию CD95 на поверхности В-клеток в культуре как маркера клеточной активации (рис. 2А).

Анализ полученных данных показал, что в присутствии 3T3-hCD40L-клеток до 97% В-клеток в культуре повышают поверхностную экспрессию CD95 (рис. 2А–В), а добавление IL-21 заметно не влияет на процент CD95^high-В-клеток (рис. 2Б). При этом до 80% всех СD95^high-В-клеток имеют фенотип CD27^–CD38^– (рис. 2Г, Д).

Число CD27⁺CD38^– СD95^high и CD27^–CD38⁺ СD95^high В-клеток в культурах возрастает при совместном добавлении hCD40L и IL-21 (рис. 2Ж, И), при этом их доля не изменяется (рис. 2Е, З).

Для оценки накопления CD95^high Bcl6⁺ (ГЦ-подобных) В-клеток проводили фиксацию поверхностно окрашенных В-клеток с последующим внутриклеточным окрашиванием антителами к Bcl6 (рис. 2К). Количественный анализ показал низкую представленность данной субпопуляции В-клеток в культурах (< 2%) (рис. 2Л). Наиболее заметное накопление ГЦ-подобных В-клеток наблюдалось в культуре RPMI-2 с включением 3Т3-hCD40L фидеров и IL21 (рис. 2М). Надо отметить, что в среде RPMI-2 более 50% ГЦ-подобных В-клеток имели фенотип CD27^–CD38^–, что достоверно выше, чем в культурах с RPMI-1 (рис. 2Н, О). CD27⁺CD38^– CD95^high Bcl6⁺ В-клетки встречались в культурах с RPMI-1 и RPMI-2 в равной степени (рис. 2П, Р), а доля CD27^– CD38⁺ ГЦ-подобных клеток была достоверно повышена в культурах с RPMI-1 (рис. 2С, Т).

Таким образом, кокультивирование B-клеток с 3T3-hCD40L фидерами и IL-21 позволяет достигнуть наибольшей экспансии и выживаемости В-клеток. При данных условиях на 7-й день культивирования в RPMI-1 около 15% среди живых клеток составляют АСК и 0,2% ГЦ-подобные В-клетки, a в RPMI-2 — 10 и 0,4% соответственно. Поэтому для дальнейшей работы была выбрана среда RPMI-2 как наиболее композиционно богатая для В-клеток.

В следующей серии экспериментов мы исследовали влияние различных композиций цитокинов (IL-4, BAFF) на клеточные культуры из CD20⁺CD27^–-В-клеток, которые преимущественно представлены наивными В-клетками, и CD20⁺CD27⁺-В-клеток памяти. Отдельные субпопуляции В-клеток были получены из МНК периферической крови в результате флуоресцентного сортинга (с чистотой популяций > 95%). 1,5 × 10⁴ В-клеток культивировали в среде RPMI-2 в присутствии 3T3-hCD40L-клеток с добавлением IL-21 (50 нг/мл) и цитокинов IL-4 (10 нг/мл) и/или BAFF (100 нг/мл) (табл. 2).

Цитометрический анализ клеточных культур на 7-й день (рис. 3А) показал, что различные композиции цитокинов не оказывают существенного влияния на экспансию и выживаемость В-клеток (рис. 3Б, В). Для всех комбинаций цитокинов наблюдалась тенденция к повышенной экспансии и сниженной доли мертвых В-клеток в культурах из CD27^– наивных В-клеток по сравнению с CD27⁺-Вклетками памяти.

Важно отметить, что в культурах из CD27⁺-Вклеток памяти происходит выраженное накопление CD27^highCD38^high АСК (20–35% от всех В-клеток) (рис. 3 Г,Д). В культурах из преимущественно наивных CD27^–-В-клеток доля АСК была менее 2% (рис. 3Г, Д), в то время как доля CD27^–CD38^‒-В-клеток (рис. 3 Е, Ж) была достоверно выше по сравнению с культурами из CD27⁺-В-клеток. CD27⁺CD38^‒-В-клетки были обогащены в культурах клеток памяти, а CD27^–CD38⁺-B-клетки присутствовали при всех условиях без выраженных различий (рис. 3З–Л). Вне зависимости от исходной популяции в культурах наблюдался тренд на снижение доли АСК, CD27⁺CD38^– и CD27^–CD38⁺-клеток при добавлении IL-4 (рис. 3Г, Д, З–Л).

Вне зависимости от условий и стартовых клеток, большинство клеток имеет фенотип CD95^high. При этом доля и число CD95^high В-клеток несколько повышены в культурах из CD27^–-наивных B-клеток (рис. 4А–В). Интересно также отметить тенденцию к снижению субпопуляции CD27^–CD38⁺CD95^high-В-клеток для всех условий при добавлении IL-4 (рис. 4Г, Д).

Анализ количества и доли CD95^highBcl6⁺-B-клеток (рис. 4Е) в культурах из исходных CD27^– — и CD27⁺-Вклеток не выявил статистически значимых различий (рис. 4Ж, З). Однако при добавлении IL-4 наблюдался тренд на повышение доли ГЦ-подобных В-клеток, который был более выражен для CD27^–-В-клеток. Интересно также отметить тенденцию на повышение уровня Bcl6 в В-клеточных культурах из CD27^– по сравнению с CD27⁺-Вклетками, которая соблюдалась для всех условий, кроме добавления BAFF без IL-4 (рис. 4И, К).

Таким образом, при культивации в среде RPMI-2 с 3Т3-hCD40L-фидерами и IL-21 наблюдалась значимо большая экспансия клеточной культуры из наивных CD27^–B-клеток с минимальным накоплением АСК по сравнению с культурами из CD27⁺-B-клеток памяти, в которых АСК достигали 30%. Статистически значимых различий в накоплении ГЦ-подобныx В-клеток выявлено не было. Добавление BAFF существенного эффекта на В-клеточные культуры не оказывало, в то время как IL-4 вызывал небольшое снижение доли АСК и увеличение ГЦ-подобныx В-клеток, особенно в CD27^–-B-клеточных культурах.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Культивирование человеческих B-клеток in vitro имеет фундаментальное значение для решения широкого спектра биотехнологических задач. К ним относятся получение АСК для производства антител, использование B-клеток в качестве антиген-презентирующих клеток для активации T-клеток, а также тестирование разрабатываемых трансгенных продуктов для иммунотерапии [16]. Несмотря на многочисленные исследования условий культивирования B-клеток [11–13], создание эффективных протоколов для отдельных прикладных задач остается актуальным.

В настоящем исследовании была поставлена цель подобрать комбинацию оптимальных факторов для: а) эффективной экспансии B-клеток в клеточной культуре; б) максимального накопления популяции АСК; в) Bcl6экспрессирующих В-клеток, подобных В-клеткам ГЦ. Для этого был проведен комплексный анализ влияния исходного статуса В-клеток по маркеру CD27 (субпопуляции CD27^– и CD27⁺), комбинации белков и добавок, замещающих человеческую сыворотку, цитокина BAFF, критического для выживания B-клеток, а также стимулов, имитирующих T-клеточную помощь (CD40L, IL-21, IL-4), на эффективность протоколов культивирования.

Экспансия и поддержание жизнеспособности активированных B-клеток

Цитометрический анализ культур B-клеток на 7-й день кокультивирования продемонстрировал, что наивысшие показатели экспансии и выживаемости были достигнуты в условиях использования трансгенной фидерной линии, экспрессирующей человеческий hCD40L, в комбинации с цитокином IL-21. Эти данные согласуются с результатами, описанными ранее [17, 18]. В то же время добавление в культуру цитокинов IL-4 и BAFF в концентрациях 10 и 100 нг/мл соответственно не оказало статистически значимого влияния на пролиферацию или жизнеспособность клеток.

Оптимизация состава питательной среды показала, что включение в базовую среду, содержащую 10% FBS, коктейля из рекомбинантного человеческого инсулина, трансферрина и альбумина способствовало максимальному снижению доли мертвых клеток.

Согласно сравнительному анализу, культуры, инициированные из CD27^–-B-клеток, в среднем в 1,5 раза превосходили по численности культуры, полученные из CD27⁺-клеток, а также характеризовались более низким процентом гибели клеток, что подтверждается литературными данными [19].

Таким образом, для оптимальной экспансии и поддержания жизнеспособности активированных B-клеток in vitro целесообразно использовать в качестве исходной популяции CD27^‒-клетки. Наиболее эффективный протокол включает их кокультивирование с фидерными клетками, экспрессирующими hCD40L, в среде, обогащенной IL-21, с добавлением комбинации сывороточных белков (включая инсулин, трансферрин, альбумин).

Накопление АСК в В-клеточных культурах

Следующей задачей было определение условий культивирования, при которых происходит накопление CD27^highCD38^high АСК в В-клеточных культурах. Было показано, что при одновременном присутствии hCD40L и IL-21 в культурах накапливались CD27^highCD38^high-клетки, достигая 10–15% от всего клеточного пула. Это согласуется с результатами ранее опубликованных работ [20, 21, 22]. Введение в среду для культивирования рекомбинантных сывороточных белков приводило к снижению доли АСК в культурах.

Выраженное накопление CD27^highCD38^high-В-клеток отмечалось в культурах из CD27⁺-В-клеток памяти (20–35% от всех живых клеток), что согласуется с более ранними исследованиями [21, 23] и быстрым вовлечением В-клеток памяти в АСК-ответ при повторном контакте с антигеном и получением Т-клеточной помощи [24]. В отличие от клеток памяти, в культурах из преимущественно наивных CD27^‒В-клеток доля и количество АСК были заметно снижены (1–2% от общего числа клеток).

Отмечалось также, что в присутствии цитокина BAFF количество CD27^highCD38^high, а также CD27⁺CD38^‒-Вклеток в культурах из CD27+-В-клеток памяти было максимальным, что согласуется с другими данными [25, 26]. При добавлении IL-4, наоборот, отмечался тренд на снижение доли и числа АСК и CD27⁺CD38^‒-клеток и повышение доли CD27^‒CD38^‒-В-клеток.

Из полученных нами результатов следует, что для обогащения АСК в В-клеточной культуре предпочтительнее использовать CD27⁺-В-клетки памяти в комбинации с hCD40L и IL-21 и с добавлением BAFF. Надо отметить, что данный анализ проводили без учета уровня секреции антител АСК, которая может существенно варьироваться в зависимости от уровня созревания АСК и множественных дополнительных факторов, и требует отдельных исследований для оптимизации продукции антител в клеточных культурах.

Накопление В-клеток ГЦ в клеточных культурах

Как было упомянуто ранее, сигнал через ВКР, а также «помощь» Тh-клеток в виде CD40L и секреции IL-21 индуцирует появление В-клеток ГЦ. Ключевым маркером В-клеток ГЦ является экспрессия транскрипционного фактора Bcl6 [5]. Фенотипический анализ лимфоцитов из вторичных лимфоидных органов человекa позволил идентифицировать CD95^highBcl6⁺CD38⁺CD27⁺/^–-В-клетки как В-клетки ГЦ [27]. В своей работе нам удалось идентифицировать ГЦ-подобные В-клетки в культурах по комбинации поверхностного маркера CD95 и внутриклеточного транскрипционного фактора Bcl6.

Накопление CD95^high Bcl6⁺-В-клеток имело место в культурах с hCD40L и IL-21 в соответствии с исследованиями in vivo [28]. Исходные клеточные популяции CD27^‒- и CD27⁺В-клеток не оказывали значимого влияния на долю и число CD95^highBcl6⁺ в конечных В-клеточных культурах. Однако в культурах из CD27^–-В-клеток был обнаружен тренд на повышение уровня Bcl6. Добавление рекомбинантных сывороточных белков и IL4 способствовало увеличению доли ГЦ-подобных В-клеток и снижению АСК. Это согласуется с результатами исследований, показавшими, что совместное действие IL-21 и IL-4, секретируемых Тh, повышает и стабилизирует экспрессию Bcl6 в активированных В-клетках [29], способствуя их дифференцировке в В-клетки ГЦ [5]. При этом Bcl6 является антагонистом транскрипционного фактора Blimp-1 и ингибирует дальнейшее дифференцирование В-клеток в АСК [24].

Таким образом, нам удалось показать, что культивирование В-клеток в присутствии hCD40L и IL-21 позволяет также наблюдать образование ГЦ-подобных В-клеток по повышению экспрессии Bcl6. При этом немного большее накопление ГЦ-подобных В-клеток наблюдается в культуре из CD27^–-наивных В-клеток при включении в среду IL-4 и добавок, заменяющих человеческую сыворотку.

Однако надо отметить, что все используемые в данной работе компоненты не приводят к накоплению более 1% ГЦ-подобных В-клеток. В-клетки ГЦ отличаются высокой чувствительностью к апоптозу в отсутствии поддержки со стороны фолликулярных Тh и особых клеток — фолликулярных дендритных клеток (ФДК) [30]. Показано, что использование клеточных линий на основе ФДК может быть более предпочтительным для культивирования В-клеток ГЦ [10]. Исходя из полученных нами данных и результатов ранее выполненных исследований, мы предполагаем, что направленное поддержание культур В-клеток ГЦ in vitro требует использования более сложных систем кокультивирования с включением ФДК-подобных В-клеточных линий.

ВЫВОДЫ

Проведенное исследование позволило подобрать оптимальные условия для эффективной экспансии В-клеток из периферической крови человека in vitro, а также для получения культуры, обогащенной АСК. Как было показано, включение в культуры hCD40L-экспрессирующих клеток фидеров и IL-21 необходимо как для пролиферации и выживаемости, так и для дифференцировки В-клеток in vitro. Для оптимальной экспансии В-клеточной культуры предпочтительно использовать CD27^–-наивные В-клетки и среду с добавлением комбинации человеческих сывороточных белков (включая инсулин, трансферрин, альбумин). В то же время использование CD27⁺-В-клеток памяти и добавление BAFF в среду предпочтительны для обогащения АСК. В проведенном исследовании нам удалось произвести оценку накопления CD95^highBcl6⁺ ГЦ-подобных В-клеток. Однако используемой в работе комбинации условий оказалось недостаточно для существенного обогащения культур данными клетками. Предположительно, получение культуры ГЦ-подобных В-клеток из В-клеток периферической крови может потребовать использования ФДК-подобных фидерных клеток и дополнительных растворимых факторов.