Современная травматология и ортопедия сталкиваются со сложной задачей реконструкции обширных дефектов костной ткани, возникающих вследствие травм, резекций по поводу опухолей или дегенеративных заболеваний [1]. Ключевым подходом к лечению костных дефектов является использование имплантируемых материалов для их замещения. Идеальный остеопластический материал должен быть биосовместимым, обеспечивать остеокондукцию (процесс, при котором костный заменитель служит структурным матриксом для миграции и пролиферации остеобластов), остеоиндукцию (процесс, посредством которого мезенхимные стволовые клетки и остеопрогениторные клетки активируются для дифференцировки в остеогенном направлении), а также сохранять структурно-механические свойства регенерируемой кости [2]. Универсального подхода для костной пластики в настоящее время не существует, выбор оптимального материала должен определяться конкретной клинической ситуацией, размерами дефекта и функциональными требованиями. Широко применяемый арсенал материалов для замещения костных дефектов включает в себя полимерные матриксы, биокерамику, а также конструкционные сплавы на основе металлов, в отдельных клинических ситуациях используют ауто- или аллотрасплантаты костной ткани [2–4]. Анализ эффективности существующих решений выявляет системные ограничения, варьирующиеся в зависимости от класса материала (табл. 1) [3–11].

На сегодняшний день подходы к восстановлению костных тканей ориентированы на преодоление текущих ограничений путем разработки принципиально новых решений, среди которых можно выделить несколько ключевых направлений. Одним из наиболее перспективных является тканевая инженерия, позволяющая создавать биомиметические структуры путем комбинирования биосовместимых матриксов, клеток-предшественников и биоактивных молекул для направленной стимуляции остегенеза [4, 12–14]. Значительный потенциал связан с применением аддитивных технологий (3D-печать, селективное лазерное плавление), которые обеспечивают производство имплантов со сложной архитектурой, контролируемой пористостью и точным соответствием анатомии дефекта, что невозможно при использовании традиционных методов [3, 15, 16].

Карбид бора традиционно применяют в качестве конструкционного материала благодаря высокой твердости (до 48,5 ГПа), относительно низкой плотности (~2,52 г/см³) и химической инертности [17]. На сегодняшний день свойства B₄C как самостоятельного имплантационного материала остаются малоизученными, а немногочисленные исследования сосредоточены главным образом на его роли вспомогательного компонента (модифицирующие добавки, защитные покрытия).

Целью работы было изучить биологическую совместимость керамических образцов на основе карбида бора путем исследования их цитотоксического воздействия на мезенхимные стволовые клетки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Заготовки спеченного карбида бора изготавливали по запатентованной технологии (патент № RU 2 836 825 C1) [18]. В ходе технологического процесса исходный порошок карбида бора («УНИХИМ с ОЗ», Россия) вместе со связующим веществом на 1 ч загружают в распылительное сушило XLB-3 (Oriental Development Limited, Китай). Далее пресс-порошок прессуют с помощью пневмогидравлического пресса СОРОКИН 7.50 («Лехт», Россия) методом холодного прессования для получения заготовки, из которой с помощью механической обработки получают детали требуемой формы. Спрессованную деталь для удаления связующего вещества помещают в муфельную печь ЭКПС-50 («Смоленское СКТБ СПУ», Россия). Затем заготовку размещают в установку горячего прессования HP W 250 (FCT Systeme GmbH, Германия), в которой происходит свободное спекание при температуре 1900–2100 °C с 14 стадиями, состоящими из нагревания, промежуточной выдержки и вакуумирования. Исходные заготовки с помощью алмазных дисков разрезали на образцы размером 5 × 5 × 30 мм, и очищали от пыли, образованной при резке, в ультразвуковой ванне CD-4830 (Codyson, Китай) в среде этилового спирта, затем отмывали в дистиллированной воде 3 раза по 40 мин. В качестве материала сравнения в работе использовали образцы аналогичного размера, изготовленные из титана марки ВТ 1-00 («ТНМК», Россия).

Исследование структуры поверхности образцов из карбида бора проводили на сканирующем электронном микроскопе KYKY-EM6900LV (KYKY Technology Co., Ltd., Китай) при ускоряющем напряжении 20 кВ и силе тока электронного луча 120 мкА. Топографию поверхности образцов исследовали на атомно-силовом микроскопе NTEGRA II (NT-MDT Spectrum Instruments, Россия) в полуконтактном режиме с помощью силиконового ультраострого кантилевера HA_FM A (NT-MDT Spectrum Instruments, Россия) при частоте сканирования 0,7 Гц. Для создания трехмерных топографических изображений использовали программное обеспечение Nova-Px (NT-MDT Spectrum Instruments, Россия).

Для стерилизации образцов были выбраны два широко распространенных в лабораторной и клинической практике метода — физический (автоклавирование) и химический (оксид этилена). Перед использованием в эксперименте половину образцов из карбида бора и титана стерилизовали в автоклаве (Youjoy BES-12L-B-LED, Китай) при температуре 121 °C, давлении 1,1 атм. в течение 45 мин. Оставшиеся образцы стерилизовали этиленоксидом в газовом стерилизаторе/аэраторе Steri-Vac 5XL (3M, США) при концентрации этиленоксида 750 мг/л, температуре в камере — 37°C, влажности — 70% в течение 3 ч. Аэрацию проводили при температуре стерилизации не менее 8 ч.

Цитотоксичность образцов оценивали непрямым методом, исследуя жизнеспособность мезенхимных стволовых клеток человека (МСК) линии MSC-DP-1 (ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных» ИНЦ РАН, Россия) в экстрактах, полученных выдерживанием тестируемых образцов в культуральной среде DMEM/F12 (Servicebio, Китай) при 37 °C во влажной атмосфере с 5% CO₂ в течение 72 ч согласно ГОСТ ISO 10993-12-2023 [19]. Поскольку МСК являются предшественниками остеобластов и играют ключевую роль в регенерации костной ткани, их использование позволяет оценить, насколько исследуемый материал будет совместим с целевой биологической средой in vivo.

Клетки MSC-DP-1 культивировали в среде DMEM/F12 (Servicebio, Китай) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («ПанЭко», Россия), 100 ЕД/мл пенициллина (Thermo Fisher Scientific, США), 100 ЕД/мл стрептомицина (Thermo Fisher Scientific, США) и 2 ммоль/л L-глутамина («ПанЭко», Россия) при 37 °C во влажной атмосфере с 5% CO₂. Для исследования цитотоксичности экстрактов клетки рассаживали в 96-луночные плоскодонные культуральные планшеты по 2 × 10⁴ клеток на 200 мкл среды в каждой лунке и инкубировали в течение 24 ч. Затем среду заменяли на 200 мкл экстракта. После инкубации в экстрактах при 37 °C во влажной атмосфере с 5% CO₂ в стандартных условиях в течение 24 и 72 ч жизнеспособность клеток измеряли с использованием набора для оценки пролиферации клеток EZcount™ XTT Cell Assay Kit (HiMedia Labs, Индия). Оптическую плотность содержимого лунок измеряли при длине волны 450 нм и референсной длине волны 690 нм с использованием микропланшетного фотометра Stat Fax-2100 (Awareness Technology, Inc., США). В качестве контроля использовали клетки, культивирующиеся в полной среде DMEM/F12. Число повторностей в каждой группе равнялось 5. Жизнеспособность клеток рассчитывали как отношение между оптической плотностью в экспериментальных группах и контроле (А):

Жизнеспособность клеток = (А_{экспериментальная группа}/А_{контроль}) × 100%.

Образец считали нетоксичным при величине показателя жизнеспособности клеток более 70% (ГОСТ ISO 10993-5-2023) [20].

Статистическую обработку данных выполняли в программе Statistica 10.0 (StatSoft, США). Нормальность распределения данных оценивали с помощью критерия Шапиро–Уилка. Для выявления различий между группами использовали U-критерий Манна–Уитни. Результаты исследования представлены в виде Ме (25%; 75%), где Ме — медиана, интерквартильный размах — значения 25го и 75-го процентилей. Для коррекции на множественные сравнения использовали поправку Бонферрони, уровень значимости после коррекции составил α = 0,0125, различия между группами считали достоверными при р < 0,0125.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общий вид образцов пористой керамики на основе карбида бора размером 5 × 5 × 30 мм представлен на рис. 1. Основные технические характеристики материала представлены в табл. 2.

На микрофотографиях поверхности спеченных образцов из карбида бора выявляется характерная поликристаллическая структура с выраженной зеренной организацией, средний размер зерен составляет 40 мкм (рис. 2). Зерна расположены плотно, без значительных промежутков, имеют преимущественно угловатую морфологию со скругленными границами. Границы имеют сложную конфигурацию, включая двойниковые структуры и участки неполного срастания. Поверхность обладает высокопористой структурой из взаимосвязанных пор преимущественно округлой и овальной формы со средним размером 30 мкм. При анализе взаимосвязей между порами выявлены разветвленные каналы и цепочки, формирующие систему межпорового сообщения. Распределение пор в объеме материала относительно равномерное, с локальными скоплениями и зонами повышенной пористости. Стенки пор имеют гладкие поверхности с микронеровностями и частичным срастанием соседних структур.

Топографический анализ поверхности исследуемого образца демонстрирует сложную морфологию рельефа с выраженной неоднородностью микроструктуры, среднеквадратичная шероховатость образцов составила 0,203 ± 0,037 мкм, градиент высот — 1,563 ± 0,607 мкм (рис. 3). На поверхности прослеживаются элементы, представленные как возвышенностями субмикронного размера, так и неглубокими впадинами различной конфигурации. Обнаружено неравномерное распределение высотных характеристик с формированием локальных холмистых структур и участков повышенной шероховатости.

При оценке жизнеспособности МСК, культивируемых в присутствии экстрактов из образцов карбида бора, цитотоксических эффектов не было выявлено ни в экспериментальных группах, ни в группах сравнения (рис. 4). В качестве отрицательного контроля использовали заготовки из титана марки ВТ 1-00, что подтвердило воспроизводимость метода и соответствие биологического ответа в тест-системе установленным требованиям. Влияние метода стерилизации на жизнеспособность клеток также отмечено не было (рис. 4).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные результаты, демонстрирующие отсутствие значимых цитотоксических эффектов спеченного карбида бора по отношению к МСК, согласуются с данными предыдущих исследований о биосовместимости материала, однако в этих работах карбид бора исследовали в виде порошка или отдельных частиц. Ранее было показано, что наночастицы B₄C, полученные методом сольвотермического синтеза, не оказывают токсического эффекта на клеточные линии HeLa (рак шейки матки) и HEK-293 (эмбриональная почка человека) в концентрациях от 100 до 800 мкг/л [21]. Показана также биосовместимость аморфного порошка карбида бора как при контакте с соматическими клетками (фибробластами линии Hs680), так и с клетками иммунной системы (макрофагами линии RAW 264.7) [22]. Отсутствие статистически значимых различий в жизнеспособности клеток между группами,

подвергнутыми автоклавированию и стерилизации этиленоксидом, указывает на стабильность свойств образцов B₄C и их устойчивость к сорбции токсичных соединений в процессе обработки. Следует отметить, что в данной работе использовали образцы карбида бора небольшого размера (5 × 5 × 30 мм). В дальнейшем для подбора условий стерилизации заготовок большего размера и/или сложной формы могут потребоваться дополнительные исследования, поскольку пористая структура материала может затруднять диффузию стерилизующих агентов и способствовать накоплению конденсата в глубинных зонах.

В настоящее время подавляющее большинство работ в области медицинского применения карбида бора сосредоточено на использовании наночастиц B₄C как высокоэффективных носителей для таргетной доставки изотопа бор-10 в рамках бор-нейтронозахватной терапии злокачественных новообразований [23]. В отличие от активно изучаемого терапевтического применения, вопросы, связанные с использованием B₄C в качестве биосовместимого материала для имплантологии, остаются малоизученными. Использование B₄C в качестве добавки при изготовлении пористых керамических матриц из оксида алюминия приводит к улучшению их механических свойств и цитосовместимости [24], однако детальные механизмы этих эффектов требуют дальнейшего изучения.

Основной задачей при создании пористых керамических матриц для замещения костных дефектов является оптимизация их архитектуры, которая должна обеспечивать как механическую стабильность, так и условия, способствующие эффективной диффузии питательных веществ и кислорода [25]. Оптимальное процентное соотношение пористости по результатам ряда исследований находится в пределах 40–90% [3]. Возникает фундаментальное противоречие: с одной стороны, пористость материала способствует адгезии, пролиферации и дифференцировке МСК в остеобласты, с другой стороны, высокая степень пористости ограничивает механическую прочность, что обусловливает необходимость поиска компромисса между этими параметрами [6]. Для плотной матрицы гидроксиапатита, наиболее распространенного аллопластического материала на основе керамики, пределы прочности на изгиб лежат в диапазонах 38–250 МПа, а для пористой матрицы предел прочности на изгиб зависит от формы и концентрации пор и составляет 2–11 МПа, что значительно ниже, чем у костной ткани (135–193 МПа) [26]. Хотя существует множество способов модификации кальций-фосфатной керамики, этот материал все еще уступает костной ткани по гибкости, эластичности и прочности. Из-за их хрупкости такие имплантаты не используют для восстановления костей, несущих существенную нагрузку [6]. Как альтернативный материал в подобных случаях (например, при изготовлении компонентов эндопротеза тазобедренного сустава) может быть использован керамический оксид алюминия класса А (Al₂O₃) [27]. Пористую керамику из карбида бора теоретически можно использовать в имплантологии как альтернативу керамическим алюмооксидным материалам для снижения нагрузки на сустав, поскольку имеет более низкий удельный вес — приблизительно 1,8 г/см³, что сопоставимо с плотностью кортикальной костной ткани, в то время как плотность керамики из оксида алюминия — 3,94 г/см3 [6]. Следует отметить, что прочность на изгиб керамического оксида алюминия выше, чем у спеченной керамики из карбида бора (500 МПа и 250–300 МПа соответственно). Одним из технологических решений для повышения прочности пористой B₄C-матрицы может быть импрегнирование алюминием путем нанесения на нее порошка металла и повторного спекания при температуре выше температуры плавления алюминия (более 660 °С). Полученный таким способом керамический композит имеет относительную плотность 2,2–2,6 г/см³ и прочность при изгибе не менее 600 МПа [18].

Дополнительными факторами, влияющими на адгезию и пролиферацию клеток в месте имплантации, являются геометрия пор и шероховатость поверхности материала [28]. Сложная пространственная организация пор не только увеличивает площадь для адгезии клеток, но и создает механические стимулы для их дифференцировки. В свою очередь, шероховатость поверхности способствует адгезии белков внеклеточного матрикса через интегриновые рецепторы, а гидрофильность в последующих экспериментах крупногабаритных или поверхности, связанная с микрорельефом, обеспечивает сложноструктурных заготовок. В клинической практике оптимальную смачиваемость, что способствует диффузии разработанный материал может найти применение при питательных веществ и миграции клеток [29]. Показано, что адгезия и пролиферация остеобластов на поверхностях из гидроксиапатита возрастают по мере увеличения шероховатости поверхности от 0,733 ± 0,203 до 4,680 ± 0,433 мкм [30]. Изучение адгезии и пролиферации клеток на поверхности керамики из карбида бора для определения оптимального способа обработки материала в данной работе не проводилось и запланировано в дальнейших исследованиях.

ВЫВОДЫ

Проведенное исследование показало цитосовместимость керамических образцов, изготовленных из карбида бора методом свободного спекания, что делает данный материал перспективным кандидатом для применения в медицинской имплантологии. Однако ограничения исследования, связанные с небольшими размерами образцов, требуют валидации в случае использования создании индивидуальных имплантатов для замещения дефектов костной ткани в челюстно-лицевой хирургии и ортопедии, особенно в случаях, требующих сочетания механической прочности и способности к интеграции с костной тканью. Целесообразно использование B₄C-керамики в составе комбинированных конструкций для артропластики, где ее низкая плотность позволяет снизить общую массу эндопротеза. Для повышения прочности пористой матрицы из карбида бора перспективно создание композитных материалов методом пропитки заготовок расплавами металлов. Дальнейшие направления исследования биосовместимости B₄C-керамики включают в себя оценку влияния микроструктуры (размер частиц, пористость) на адгезивные свойства поверхности и остеогенную активность in vitro, изучение долгосрочной стабильности материала в физиологических условиях, а также исследование стресскоррозионного поведения при циклических нагрузках, имитирующих естественную биомеханику, что особенно актуально для эндопротезирования суставов.