Клеточное старение — это сложный многокомпонентный процесс, триггером которого выступают различные стрессы: повреждения ДНК, укорочение теломер, активация ретроэлементов, окислительный и механический стрессы, а также неблагоприятные физические, химические и биологические факторы [1, 2]. Накопление мутаций и различных повреждений в стареющих клетках повышает риск опухолевой трансформации. В настоящее время считается, что одним из механизмов противоопухолевой защиты является переход в состояние сенесцентности [3, 4]. В целом сенесцентность реализуется через конвергенцию нескольких сигнальных каскадов, главными из которых являются p53/p21CIP1 и p16INK4a/RB [5]. Эти пути активируются в ответ на укорочение теломер и повреждение ДНК (DNA damage response, или DDR), активацию онкогенов, эпигенетические нарушения, нарушения архитектуры хроматина, избыток реактивных форм кислорода, в результате дисфункции органелл (в первую очередь митохондрий), а также в ответ на некоторые воспалительные и паракринные сигналы [6, 7]. Стрессиндуцированная активация NF-κB и mTOR путей приводит к продукции широкого спектра провоспалительных субстанций сенесцентными клетками (SASP) и нарушению аутофагии [8, 9]. А сопутствующая активация белков BCL-2, BCL-XL и MCL-1 блокирует апоптоз [10]. Эти изменения определяют ключевые особенности сенесцентных клеток, такие как перманентная остановка клеточного цикла, устойчивость к апоптозу, воспалительный фенотип SASP, дисфункции митохондрий и нарушения протеостаза [11]. Морфофункциональным отражением метаболического дисбаланса и лизосомной дисфункции сенесцентных клеток является гипертрофия лизосомного аппарата и повышение активности фермента лизосом — β-галактозидазы (β-Gal) [12]. Таким образом, высокое содержание фермента в увеличенных лизосомах приводит к детектируемой активности β-галактозидазы в неоптимальном диапазоне pH = 6,0, что позволяет использовать этот фермент в качестве маркера сенесцентных клеток (SA-β-Gal) [13, 14]. Обычно для определения активности β-Gal используют хромогенные субстраты, которые не подходят для многопараметрического фенотипического анализа сенесцентных клеток флуоресцентными методами, включая проточную цитометрию. Появление флуорогенного субстрата β-Gal значительно расширяет область применения этого маркера и позволяет одновременно оценивать активность SA-β-Gal в разных клеточных популяциях методом проточной цитометрии [15]. В настоящее время мало данных об изменении активности данного фермента в различных популяциях клеток иммунной системы при старении. Оценка активности SA-β-Gal в различных лимфоидных и миелоидных популяциях центрального и периферического отделов иммунной системы представляет интерес в контексте изучения возрастных изменений в иммунной системе. Поскольку иммунная система в течение жизни подвергается воздействию различных по природе и интенсивности стрессовых факторов, отдельные субпопуляции лимфоидных и миелоидных клеток будут иметь неодинаковые траектории и темпы старения. Увеличение сенесцентного бремени в иммунной системе усугубляет «inflammaging», повышает риск развития аутоиммунных и онкологических процессов, а также увеличивает восприимчивость к инфекциям [16]. Поэтому детальное изучение возрастных изменений в иммунной системе закладывает фундамент для разработки направленных подходов восстановления компетентности иммунной системы в пожилом возрасте. Таким образом, целью данной работы было проведение сравнительного анализа активности SA-β-Gal в основных популяциях клеток иммунной системы, полученных из селезенки и костного мозга мышей молодого (3 месяца) и крайне пожилого возраста (26 месяцев). Такой подход позволил изучить распределение клеток с признаками старения в иммунной системе пожилых мышей, а также сравнить центральный и периферический отделы иммунной системы по содержанию таких клеток.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Мыши

Исследование проводили на 12 мышах линии C57BL/6: 8 мышах в возрасте 3 месяца и 4 пожилых мышах в возрасте 26 месяцев. Животных содержали в виварии с 12-часовым световым циклом, свободным доступом к воде и сбалансированному лабораторному корму. Эвтаназию проводили с соблюдением принципов гуманного обращения с животными, в условиях глубокой анестезии изофлураном методом цервикальной дислокации. Сразу после эвтаназии проводили сбор необходимых материалов.

Выделение спленоцитов

После эвтаназии извлекали селезенку, помещали в стеклянный гомогенизатор с холодным PBS (1% FCS, 0,02% EDTA) и мягко растирали стеклянным пестиком до получения однородной суспензии. Полученную клеточную взвесь дважды фильтровали через нейлоновый фильтр (70 мкм), промывая раствором PBS. Фильтрат центрифугировали 5 мин — 300 g при 8 °C. Осадок ресуспендировали в 5 мл буфера для лизиса эритроцитов в течение 2 мин. Затем добавляли 10 мл PBS с 1% FBS и повторно центрифугировали. После удаления супернатанта клетки ресуспендировали в нужной концентрации в полной среде RPMI-1640 или PBS в зависимости от целей.

Выделение клеток костного мозга

Клетки костного мозга выделяли из бедренных и большеберцовых костей мыши путем вымывания костного мозга раствором PBS из полости кости с помощью шприца (27 G). Полученную суспензию дважды фильтровали через нейлоновый фильтр 70 мкм, отмывали в растворе PBS (0,02% EDTA) центрифугированием 5 мин — 300 g при 8 °C. Далее проводили лизис эритроцитов (см. выше) и ресуспендировали в полной среде или PBS.

Жизнеспособность спленоцитов и клеток костного мозга оценивали флуоресцентным методом с помощью акридинового оранжевого и пропидия йодида и составляла в среднем 98%.

Окрашивание SA-β-Gal

Для оценки активности SA-β-Gal в живых клетках использовали витальный краситель SPiDER-βGal (Cellular Senescence Detection Kit, Dojindo Laboratories, Japan), который является флуорогенным субстратом, специфичным для β-Gal. Клетки костного мозга или спленоциты в количестве 2 × 10⁵ клеток на лунку инкубировали в 96-луночном плоскодонном планшете (NEST Biotechnologies, Китай) в полной среде RPMI-1640 в объеме 200 мкл с добавлением бафиломицина А1 (Sigma Aldrich, США) в конечной концентрации 100 нМ в качестве агента, защелачивающего лизосомы, в течение 1 ч в CO₂-инкубаторе при 37 °С. Далее к клеткам добавляли субстрат в конечной концентрации 1 мкмоль/л и инкубировали при тех же условиях в течение 1 ч.

Затем клетки отмывали центрифугированием 5 мин — 300 g, 20 °C), окрашивали красителем FVS780 (BD Biosciences, США) согласно протоколу производителя для удаления из последующего анализа мертвых клеток и метили антителами. В качестве положительного контроля клетки параллельно инкубировали с субстратом без добавления бафиломицина. В качестве негативного контроля клетки инкубировали с добавлением бафиломицина и без добавления субстрата.

Фенотипирование

Для окрашивания антителами 2 × 10⁵ клеток ресуспендировали в 200 мкл  FACS-буфера, добавляли 50 мкл смеси антител, тщательно перемешивали пипетированием и инкубировали при 4 °C — 30 мин в темноте. Используемые против мыши антитела: TCRβ BB700 (#745846, BD Biosciences, США), CD19 BV605 (#563148, BD Biosciences, США), CD11c APC (#550261, BD Biosciences, США), CD11b BV510 (#562950, BD Biosciences, США), Ly6G PE (#12-9668-82, ThermoFisher, США), Ly6C PE-Cy7 (#560593, BD Biosciences, США), CD4 SB702 (#67-0041-82, ThermoFisher, США), CD8 SB780 (#78-0081-82, ThermoFisher, США). Затем клетки дважды отмывали 5 мин — 300 g FACS-буфером и ресуспендировали в объеме 300 мкл. Далее их анализировали на проточном цитометре BD LSRFortessa (BD Biosciences, США).

Статистический анализ

Анализ данных проточной цитометрии проводили с использованием программы FlowJo 10.8.1. (BD Bioscience, США). Статистический анализ — в программе GraphPad Prism 9.3.1 (GraphPad Software, США). Распределения проверяли на нормальность с помощью теста  Шапиро– Уилка. Сравнение групп молодых и пожилых мышей проводили с помощью непараметрического теста Манна–Уитни. Данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Использование многоцветной проточной цитометрии позволило изучить активность SA-β-Gal в десяти различных популяциях клеток иммунной системы. Анализируемые популяции были условно разделены по происхождению на лимфоидные (T- and B-cells) и миелоидные (конвенциональные дендритные клетки, моноциты, макрофаги и гранулоциты). Стратегия гейтирования представлена на рис. 1A. Затем в каждой из обозначенных популяций оценивали долю клеток с повышенной активностью SA-β-Gal. Границу гейта определяли по контролю FMO (от англ. fluorescence minus one), в качестве которого выступали клетки без добавления флуорогенного субстрата SPiDER-βGal, но с добавлением бафиломицина A1 (рис. 1Б). Последнее особенно важно для контрольных образцов, так как бафиломицин A1 сам по себе влияет на уровень аутофлуоресценции клеток.

При анализе данных, полученных из селезенки мышей, мы выявили значимое повышение содержания моноцитов (8,2% (5,6–12,4) против 23,7% (17,3–29,2), p < 0,05), дендритных клеток (12,9% (12–14,2) против 27,9% (18,2–29,5), p < 0,05) и B-лимфоцитов (53,5% (49,8–57,5) против 66,4% (64,9–69,5), p < 0,05) в группе пожилых мышей (рис. 2A). Интересно отметить, что с возрастом значительно увеличивалось содержание CD11c⁺В-клеток (0,39% (0,32–0,47) против 2,18% (1,33–2,58), p < 0,01) — это относительно недавно описанная популяция B-клеток, ассоциированных со старением. Также, несмотря на увеличение общей популяции дендритных клеток, содержание CD8α⁺DC значительно снижалось (31,9% (29–33) против 23,8% (19,3–31,2), p < 0,01). В образцах костного мозга тоже наблюдалось увеличение содержания моноцитов (18,2% (14–20) против 23,7% (22–28,2), p < 0,05) и снижение содержания B-клеток (32,9% (29,9–36,3) против 26,2% (22,8–27,5), p < 0,05) при этом содержание CD11c⁺В-клеток возрастало (0,03% (0,025–0,048) против 0,26% (0,18–0,4), p < 0,01), а CD8α⁺DC снижалось (21,6% (19,1–24) против 6,5% (4,9–7,1), p < 0,01) — аналогично образцам селезенки (рис. 2Б).

На следующем этапе изучали распределение клеток с повышенной активностью SA-β-Gal среди лимфоидных и миелоидных популяций. В образцах селезенки было выявлено значительное повышение содержания позитивных по SA-β-Gal гранулоцитов (7,2% (2,4–15,5) против 62,5% (45,8–66,1), p < 0,001), макрофагов (23,8% (16,8–29,1) против 57,2% (55,1–63,5), p < 0,001) и моноцитов (50,5% (43,8–86) против 85,1% (77,7–90,2), p < 0,01), а также CD11c⁺В-лимфоцитов (39,2% (35,4–43) против 60,5% (57,5–73,3), p < 0,01) в группе пожилых мышей (рис. 2В). В костном мозге выявлено возрастное увеличение SA-β-Gal позитивных макрофагов (64,4% (56,8–65,8) против 70,9% (66,1–76,5), p < 0,05), CD8α⁺DC (1,5% (0,96–1,7) против 3,25% (2,71–4,26), p < 0,05), дважды негативных лимфоцитов (19,5% (15,2–28,3) против 41% (30,9–53,3), p < 0,05) и CD11c⁺В-клеток (38,4% (34,2–43,6) против 62% (47,8–76,8), p < 0,05) (рис. 2Г).

Таким образом, в результате исследования были выявлены возрастные  изменения в основных популяциях лимфоидных и миелоидных клеток, которые сопровождались увеличением доли клеток с повышенной активностью SA-β-Gal. В костном мозге, как в первичном лимфоидном органе, эти изменения были выражены менее существенно.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные результаты показали, что физиологическое старение иммунной системы происходит неравномерно [17] и сопровождается значимыми количественными изменениями в популяциях B-лимфоцитов, дендритных клеток и моноцитов. Кроме того, в популяциях миелоидной линии накопление клеток с повышенной активностью SA-β-Gal происходит быстрее, чем в лимфоидном компартменте.

Увеличение содержания B-клеток в селезенке пожилых мышей может отражать историю антигенных вызовов в течение жизни, а накопление возраст-ассоциированных CD11c⁺B-клеток связывают со старением и повышением риска аутоиммунных заболеваний и феноменом «inflammaging» [18, 19]. Это клетки с нарушенными функциями, которые способствуют приобретению макрофагами провоспалительного фенотипа, их содержание часто повышено при различных аутоиммунных заболеваниях, и они могут составлять значительную часть популяции зрелых В-клеток в пожилом организме [20].

В костном мозге наоборот наблюдалось снижение содержания B-клеток, что отражает возрастное снижение их продукции и, по-видимому, негативно влияет на способность иммунной системы отвечать на новые антигенные вызовы [21]. При этом, несмотря на уменьшение общей популяции B-лимфоцитов, содержание CD11c⁺B-клеток было повышено, как и в селезенке. Возрастное увеличение содержания CD11c⁺ дендритных клеток в селезенке, а моноцитов и в костном мозге, по-видимому, отражает так называемый «миелоидный сдвиг» — характерную особенность старения иммунной системы, которая хорошо описана в недавних исследованиях [22–24]. Особый интерес представляет выявленное увеличение доли SA-β-Galпозитивных гранулоцитов, моноцитов и макрофагов в селезенках пожилых мышей. Возрастное накопление SA-β-Gal-позитивных клеток в миелоидных популяциях, по-видимому, вносит вклад в хроническое вялотекущее воспаление — inflammaging, которое преимущественно обусловлено продукцией факторов SASP сенесцентными миелоидными клетками [25, 26]. Повышенное содержание SA-β-Gal-позитивных макрофагов, DN T-лимфоцитов и, особенно, CD11c⁺B-клеток в костном мозге указывает на вовлечение центральных отделов иммунной системы в процессы старения. В этом контексте стоит отметить, что непосредственная близость стареющих макрофагов и CD11c⁺B-клеток к гемопоэтическим стволовым клеткам (HSC) может негативно влиять на микроокружение в нишах за счет продукции факторов SASP и приводить к функциональному истощению и снижению лимфопоэтического потенциала HSC [27]. Так может замыкаться порочный круг, когда накопление клеток с признаками сенесцентности в костном мозге негативно влияет на гемопоэз, что в свою очередь усиливает накопление дисфункциональных и стареющих клеток [28].

Мы обнаружили существенное повышение активности SA-β-Gal в различных лимфоидных и миелоидных популяциях в группе пожилых мышей, что наряду с существующими данными позволяет использовать этот маркер в контексте изучения процессов старения иммунной системы. Тем не менее, стоит отметить определенные ограничения нашего исследования. Полученные данные основаны на оценке активности SA-β-Gal как основного маркера клеточной сенесцентности, однако этот маркер не является абсолютно специфичным и может повышаться при активации и изменении метаболизма в некоторых типах клеток, а также на этапе перехода клеток в сенесцентное состояние [29, 30]. Кроме того, нами не проводилась оценка функционального потенциала изучаемых популяций и не использовались дополнительные маркеры сенесцентности, такие как p16INK4a, p21CIP1, HMGB1 [5] или компоненты SASP [31], что ограничивает интерпретацию наблюдаемых явлений исключительно в контексте клеточной сенесцентности.

Однако старение это сложный и многогранный процесс, который не ограничивается одним переходом клеток в сенесцентное состояние. Так, выявленные нами количественные изменения в содержании лимфоидных и миелоидных субпопуляций в группе пожилых мышей, наряду с изменениями в активности SA-β-Gal, по-видимому, отражают наиболее выраженные возрастные изменения в иммунной системе. Поэтому необходимы дальнейшие комплексные исследования, включающие анализ транскриптома и протеома, а также функциональные тесты, направленные на изучение различных аспектов старения иммунной системы. Такой подход будет способствовать более глубокому пониманию механизмов иммунного старения и созданию стратегий, направленных на восстановление компетентности иммунной системы в пожилом возрасте.

ВЫВОДЫ

Полученные результаты подтверждают гипотезу о неравномерном старении различных компонентов иммунной системы и указывают на миелоидный сдвиг как на ключевую особенность старения иммунной системы. Стоит также отметить, что возрастные изменения помимо периферического отдела наблюдались и в костном мозге. Так, снижение содержания B-клеток отражает возрастное угнетение продукции B-лимфоцитов, а значительное повышение содержания провоспалительных CD11c⁺Bклеток и позитивных по SA-β-Gal DN T-лимфоцитов, макрофагов и CD8α⁺-дендритных клеток свидетельствует о вовлечении центральных отделов иммунной системы в процессы старения [27]. Необходимо подчеркнуть, что накопление SA-β-Gal-позитивных клеток происходит в костном мозге в непосредственной близости от гемопоэтических стволовых клеток, где продукция факторов SASP может нарушать функциональное состояние ниш, снижать лимфопоэтический потенциал и тем самым замыкать порочный круг возрастассоциированной дисфункции иммунной системы [27, 28]. Эти данные дополняют современные представления о динамических изменениях в иммунной системе, которые происходят при старении. Таким образом, дальнейшее изучение возрастных изменений в иммунной системе с применением комплекса методов, включая оценку SA-β-Gal, имеет практическую значимость с точки зрения разработки подходов селективного удаления воспалительных сенесцентных клеток, восстановления лимфопоэтического потенциала и улучшения функциональной активности иммунной системы в пожилом возрасте.