Сахарный диабет 1-го типа (СД1) обусловлен аутоиммунным разрушением β-клеток в островках поджелудочной железы. Разрушение β-клеток ведет к недостатку инсулина и, как следствие, к гипергликемии и другим тяжелым метаболическим нарушениям, поэтому все больные СД1 нуждаются в пожизненной инсулинотерапии. СД1 поражает преимущественно детей и подростков. Существует наследственная предрасположенность к СД1: риск заболеть у ближайших родственников больных примерно в 40 раз выше [1].

Для СД1 характерен латентный доклинический период (ДКП), на протяжении которого происходит постепенная аутоиммунная деструкция β-клеток [2]. ДКП длится от нескольких месяцев до нескольких лет и заканчивается, когда популяция β-клеток сокращается на 70–80%. В этот момент возникают абсолютный дефицит инсулина, гипергликемия и ее симптомы: происходит манифестация СД1 и начинается клинический период болезни. Примерно у половины больных при манифестации развивается острое осложнение СД1 — диабетический кетоацидоз, приводящий к тяжелым нейрокогнитивным нарушениям, а иногда и к смерти. Основная причина кетоацидоза — запаздывающее назначение инсулинотерапии.

Представление о том, что СД1 — аутоиммунное заболевание, сложилось к началу 1980-х гг. К этому времени уже было показано, что у большинства пациентов с СД1 в сыворотке присутствуют аутоантитела (аутоАТ), связывающиеся со структурами островковых клеток на криостатных срезах поджелудочной железы [3]. Такие аутоАТ получили название «антитела к островковым клеткам» (islet cell antibodies, ICA). Было понятно, что ICA связываются с некими цитоплазматическими антигенами β-клеток — потенциальными мишенями аутоиммунной реакции. Наиболее вероятным кандидатом в такие антигены казался главный продукт β-клеток — инсулин. Эта гипотеза была подтверждена в 1983 г. группой исследователей из США под руководством Джерри Палмера [4]. С помощью РИА Палмер и коллеги обнаружили IAA у пациентов с впервые выявленным СД1, которым еще не назначили инсулинотерапию, а также у некоторых здоровых родственников больных СД1.

В дальнейшем были открыты аутоАТ и к другим антигенам β-клеток, в частности — к глутаматдекарбоксилазе (glutamic acid decarboxylase antibodies, GADA), тирозинфосфатазе (islet antigen-2 antibodies, IA-2A) и транспортеру цинка 8 (zinc transporter 8 antibodies, ZnT8A) [5]. АутоАТ не играют существенной роли в деструкции β-клеток, но являются ее высокоспецифичными лабораторными маркерами.

Тестирование на аутоАТ применяют для решения следующих задач:

• ранняя диагностика СД1 в ДКП;
• подтверждение диагноза СД1 при нечеткой клинической картине заболевания;
• дифференциальный диагноз между СД1 и другими типами и вариантами СД;
• скрининг на ДКП СД1 в группах риска (например, у ближайших родственников больных) и среди населения.

Последняя задача имеет особое значение по двум причинам. Во-первых, обнаружение маркеров аутоиммунной деструкции β-клеток говорит о высокой вероятности манифестации СД1 и дает возможность пациентам и их родителям к ней подготовиться, а врачам — своевременно назначить инсулинотерапию и предупредить кетоацидоз и его последствия. Во-вторых, скрининг выявляет пациентов, которым показана медикаментозная профилактика СД1 с помощью препаратов, подавляющих аутоиммунную реакцию против β-клеток, например с помощью теплизумаба [6]. Программы скрининга уже много лет проводят в европейских странах, США, Канаде, Австралии, Израиле [7], а в конце 2024 г. такая программа стартовала и в России в НМИЦ эндокринологии [8]. Тесты на аутоАТ являются основным инструментом скрининга, причем важнейшее место среди них занимает тест на IAA, поскольку именно эти аутоАТ появляются уже в начале ДКП и служат самыми ранними индикаторами аутоиммунной реакции против β-клеток [9].

В разных КДЛ для тестирования IAA применяют разные методы. Наиболее распространены РИА, ИПАМЛ (иммунопреципитация антигена, меченного люциферазой); ЭХЛА (электрохемилюминесцентный анализ); ИФА и ИХЛА (иммунохемилюминесцентный анализ). Операционные параметры этих методов — диагностическая чувствительность (ДЧ), диагностическая специфичность (ДС) и диагностическая точность (ДТ) — сильно различаются. Сравнительную оценку операционных параметров разных методов периодически проводят в рамках международной Программы стандартизации тестов на аутоАТ (Islet Autoantibody Standardization Program, IASP) [10]. КДЛ, участвующие в IASP, получают наборы сывороток пациентов с впервые выявленным СД1 и сывороток здоровых доноров крови; каждая КДЛ тестирует IAA во всех сыворотках своим методом. Результаты двух раундов IASP, проведенных в 2018 и 2020 гг., представлены в табл. 1. Как видно, наилучшими ДЧ и ДС и максимальной ДТ обладает метод РИА, второе место по ДТ занимает ИПАМЛ, ИФА находится на четвертом месте, а ИХЛА вообще не имеет ДТ (его AUC < 0,5). Неудовлетворительные операционные параметры ИФА и ИХЛА объясняются тем, что в этих методах антиген (инсулин) сорбируется на твердой фазе — пластике или магнитных частицах, что приводит к нарушению его конформации и экранировке антигенных детерминант.

К сожалению, в России в настоящее время во всех без исключения КДЛ для тестирования IAA используют коммерческие тест-системы ИФА. Их операционные параметры гораздо хуже, чем у тест-систем, применяемых в КДЛ — участницах IASP. Например, у широко применяемой тест-системы Orgentec Anti-Insulin (Orgentec Diagnostika GmbH, REF ORG520, Германия) ДЧ = 4%, ДС = 95,6%, ДТ = 50%, т. е. эта тест-система не имеет клинической ценности [11]. Недавно на российском рынке появилась система ИХЛА Maglumi IAA (Shenzhen New Industries Biomedical Engineering Co., Ltd; КНР), но в инструкции по эксплуатации этой системы нет данных о ее операционных параметрах [12].

Таким образом, в нашей стране назрела необходимость создания и внедрения надежных, информативных тестсистем для определения IAA. В связи с этим в КДЛ РДКБ была предпринята попытка воспроизведения классического РИА IAA.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Общее описание исследования

Тестировали IAA в образцах сывороток пациентов с максимальной и минимальной вероятностью носительства IAA, т. е. пациентов с впервые выявленным СД1 (группа СД1) и пациентов без этого заболевания (группа К, контрольная). Работы проводили в январе–феврале 2024 г. в РДКБ и ИБХ.

Описание групп пациентов

Группа СД1 (n = 21)

М : Ж = 8 : 13 (38% : 62%); возраст 1,1–17,9 года (медиана возраста — 10,1 года, 95%-й доверительный интервал для медианы — 4,2–12,1 года).

Критерии включения пациентов в группу: возраст 0–18 лет, пол любой; диагноз «сахарный диабет 1-го типа, впервые выявленный» (коды МКБ-10 E10.1 или E10.9); длительность СД1 от даты постановки диагноза до даты взятия пробы крови ≤ 3 месяцев; присутствие в сыворотке как минимум двух видов аутоАТ из следующих: ICA, GADA, IA-2A, ZnT8A.

Группа К (n = 19)

М : Ж = 12 : 7 (63% : 37%); возраст 2,5–46,9 года (медиана возраста — 13,3 года, 95%-й доверительный интервал для медианы — 10,2–16,6 года).

Критерии включения пациентов в группу: возраст любой, пол любой; пациент практически здоров (код МКБ-10 Z00) или имеет один из следующих диагнозов: сахарный диабет 2-го типа (МКБ-10 E11), другие уточненные формы СД, в том числе разные формы моногенного СД (МКБ-10 E13, E13.9), ожирение (МКБ10 E66), СД неуточненный (МКБ-10 E14, E14.9), синдром Иценко–Кушинга (МКБ-10 E24), болезнь Иценко–Кушинга гипофизарного происхождения (МКБ-10 E24.0), синдром Тернера (МКБ-10 Q96); пациенту никогда не ставили диагноз СД1; пациент никогда не получал инъекции инсулина; в сыворотке пациента отсутствуют ICA, GADA, IA-2A, ZnT8A.

Метод тестирования на IAA

Воспроизведен метод конкурентного РИА (competitive radioimmunoassay) Дж. Палмера и соавторов [4]. Процедура РИА детально представлена на рис. 1

Метод расчета концентрации IAA

Метод включал следующие этапы:

• рассчитывали среднюю общую РА (РА_общ, число импульсов за минуту) в двух пробирках для подсчета общей РА. РА_общ равнялась 5000 cpm;
• для каждого образца сыворотки регистрировали РА (число импульсов за минуту) в пробирке без добавления немеченого инсулина (РА_А) и в пробирке с добавлением немеченого инсулина (РА_Б);
• для каждого образца сыворотки рассчитывали процент связывания ¹²⁵I-инсулина (ПС) в пробирке без добавления немеченого инсулина (ПС_А) и в пробирке с добавлением немеченого инсулина (ПС_Б) по формулам:

ПС_А = РА_А : РА_общ и ПС_Б = РА_Б : РА_общ;

• для каждого образца сыворотки рассчитывали разность процентов связываний (Д, дельта) по формуле: Д = ПС_А – ПС_Б;
• для каждого образца сыворотки рассчитывали концентрацию IAA (C_IAA) по формуле:

C_IAA = (Д x 10 000) : 100 (нЕд/мл).

Методы статистической обработки результатов и расчета операционных параметров теста

Для выявления статистических выбросов в группах СД1 и К применяли, соответственно, левосторонний и правосторонний критерии Граббса, для построения кривой операционной характеристики теста — метод DeLong et al. [13], при этом распространенность СД1 считали равной 0,123% [14]. ДЧ, ДС и ДТ рассчитывали по AUC. Для всех расчетов использовали медикостатистическую программу MedCalc [15].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты измерения C_IAA представлены в табл. 2.

Один результат (для образца сыворотки № 28) был квалифицирован как выброс. Таким образом, в статистический анализ были включены результаты измерений C_IAA в 21 образце сыворотки группы СД1 и в 18 образцах сывороток группы К. В группе СД1 значения C_IAA варьировали от 1 до 1047 нЕД/мл, в группе К — от 6 до 45 нЕД/мл. При построении кривой операционной характеристики теста программа MedCalc автоматически выбрала в качестве критерия позитивности теста (наличия IAA в образце сыворотки) значение C_IAA, превышающее 45 нЕД/мл. ДЧ, ДС и ДТ теста, рассчитанные по AUC с применением указанного критерия, составили, 42,9%, 100% и 72,8% с 95%-ми доверительными интервалами 21,8–66%, 81,5–100% и 56,1–85,7% соответственно (рис. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

По данным IASP, для разных методов РИА IAA медианы ДЧ, ДС и ДТ составляют 44%, 100% и 81,1 соответственно (). У нашего метода ДЧ (42,9%) весьма близка к  медиане ДЧ РИА IASP, а ДС совпадает с медианой ДС IASP. Однако ДТ нашего метода (72,8%) оказалась существенно ниже медианы ДТ РИА IASP и не попала в ее интерквартильный интервал. Мы объясняем расхождение результата нашего метода РИА с результатами РИА в других КДЛ-участницах IASP (более низкую ДТ нашего метода) двумя причинами:

• очень маленькая численность обеих групп;
• в состав инкубационного буферного раствора (ИБР), применявшегося Дж. Палмером и соавторами [4], входил бычий γ-глобулин в концентрации 0,025%, блокирующий неспецифическое связывание инсулина с «не-IAA» иммуноглобулинами в образцах сывороток. В нашем ИБР этот реагент отсутствовал.

Необходимо отметить, что операционные параметры нашего метода тестирования на IAA оказались лучше, чем у методов ИФА и ИХЛА, представленных в IASP, и намного превзошли операционные параметры упоминавшейся выше ИФА-тест-системы Orgentec Anti-Insulin, популярной в российских КДЛ.

ВЫВОДЫ

В конечном счете мы расцениваем наши результаты как успешные, поскольку операционные параметры предлагаемого метода оказались гораздо лучше, чем у методов ИФА и ИХЛА. Мы считаем, что после соответствующей доводки наш метод РИА IAA можно применять как с научными целями, так и в клинической практике. К сожалению, на сегодня применение этого метода в КДЛ РДКБ невозможно по двум причинам: отсутствие счетчика γ-частиц; отсутствие помещений для работ с радионуклидами, лицензированных Роспотребнадзором и Росздравнадзором. Однако мы надеемся, что со временем в РДКБ — филиале Пироговского Университета — удастся наладить РИА IAA, в котором так нуждаются российская диабетологическая наука и практика.