Рис. 1. Процедура РИА IAA 1. Образцы сывороток (75 мкл) внесли в две серии 1,7-мл конических пробирок Эппендорф (Costar 3207, Corning). В пробирки серии А добавили по 75 мкл 0,23М инкубационного буферного раствора (ИБР) pH 7,4 следующего состава: NaH₂PO₄ (Sigma-Aldrich, REF S-0751) 0,014М; NaH₂PO₄ (Panreac, REF 141677) 0,067М; NaCl (Sigma-Aldrich, REF S-9625) 0,15М; бычий сывороточный альбумин (CDH, REF TC1546) 0,05%; Твин-20 (Panreac, REF 162312) 0,05%. В пробирки серии Б добавили по 75 мкл ИБР с рекомбинантным человеческим инсулином (Insulin Reference Standard, Eli Lilly, США) в концентрации 9 х 10^–3 ЕД/мл. 2. Пробирки обеих серий встряхивали на вихревом смесителе и инкубировали 30 мин на орбитальном шейкере ELMI-ST3 (Elmi, Латвия) при скорости вращения платформы 250 об./мин при комнатной температуре. За время этой инкубации сывороточные IAA связывались с инсулином. 3. В пробирки обеих серий добавили по 100 мкл ИБР с рекомбинантным человеческим инсулином, меченным ¹²⁵I (¹²⁵I-инсулин), в концентрации 7,5 × 10^–6 ЕД/мл. Кроме того, по 100 мкл ИБР с ¹²⁵I-инсулином внесли в две пробирки для подсчета общей радиоактивности (РА). Препарат ¹²⁵I-инсулина был изготовлен в ИБХ путем монойодирования инсулина по тирозину A14 с помощью хлорамина-Т в качестве окислителя, очищен гель-фильтрацией на колонке с Сефадексом G-15. Для йодирования использовали натрия йодид ¹²⁵I (А/О ИЗОТОП, РФ). В конечном счете получили стабилизированный препарат ¹²⁵I-инсулина со следующими радиохимическими характеристиками: общая РА — 352 кБк, удельная РА — 58 ТБк/ммоль, радиохимическая чистота — 92%. 4. Все пробирки закрыли крышками и инкубировали 7 сут. в холодильнике при +4 °С. За время инкубации сывороточные IAA связывались с инсулином и 125I-инсулином, и устанавливалось равновесие между связыванием IAA с меченым и немеченым лигандами. 5. Во все пробирки, кроме пробирок для подсчета общей РА, внесли по 500 мкл буферного раствора pH 8,6 с полиэтиленгликолем (БР-ПЭГ) следующего состава: Трис 0,05М (Sigma-Aldrich REF 7-9 Tris base T13,78); ПЭГ-8000 (Polyethylenglycol 8000 BioChemica AppliChem REF A2204.0500) 14%. БР-ПЭГ был предварительно охлажден до 0 °С. 6, 7. Пробирки встряхивали на вихревом смесителе и центрифугировали на центрифуге Бекман G-2-21 при 2000 g 30 мин при +4 °С. Надосадочную жидкость удаляли аспиратором. В результате получили преципитат, содержащий комплексы IAA с меченым и немеченым инсулином, а также IAA, не связавшиеся с инсулином. 8, 9. Во все пробирки, кроме пробирок для подсчета общей РА, внесли по 1000 мкл БР-ПЭГ с 11% ПЭГ-8000, предварительно охлажденного до 0 °С. Пробирки встряхивали на вихревом смесителе и центрифугировали на центрифуге Бекман G-2-21 при 3000 g 30 мин при +4 °С. Надосадочную жидкость удаляли аспиратором. В результате получили преципитат, содержащий комплексы IAA с меченым и немеченым инсулином. 10. Измерили РА во всех пробирках (в том числе в пробирках для подсчета общей РА) на γ-спектрометре Wizard (PerkinElmer, США) при продолжительности измерения 1 мин

Рис. 2. Кривая операционной характеристики (Receiver Operator Curve) теста на IAA. Пунктирная кривая — линия, ограничивающая AUC, равную 0,5. Сплошная кривая с маркерами — кривая операционной характеристики теста. Точечные кривые — границы 95%-го доверительного интервала (95%ДИ_AUC) для кривой операционной характеристики. P_AUC — вероятность достоверности нулевой гипотезы об отсутствии различия между AUC 0,5 и AUC теста