Инфаркт миокарда и инсульт, являющиеся основными осложнениями атеросклероза, по данным Всемирной организации здравоохранения, остаются ведущими причинами смертности в мире. В России на долю болезней системы кровообращения в 2019 г. пришлось 46,8% всех случаев смерти. Высокие показатели летальности во многом обусловлены длительным бессимптомным развитием атеросклероза, который на поздних, диагностируемых стадиях часто требует хирургического вмешательства и слабо поддается консервативной терапии [1]. Несмотря на существующие методы лечения, направленные на снижение уровня липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и восстановление кровотока, атеросклероз продолжает оставаться глобальной медико-социальной проблемой. Общепризнано, что атеросклероз является хроническим воспалительным заболеванием артерий [2], однако внутриклеточные молекулярные механизмы, управляющие этим воспалением и прогрессированием болезни, изучены недостаточно [3]. Ключевым событием в его патогенезе является формирование атеросклеротических бляшек, характеризующееся хроническим воспалением, дисфункцией эндотелия, накоплением липидов и пролиферацией гладкомышечных клеток в стенке [4, 5].

Циклин-зависимые киназы CDK8 и CDK19, входящие в состав медиаторного комплекса, являются ключевыми регуляторами транскрипции, опосредованной РНКполимеразой II. Хотя их точные механизмы действия остаются не до конца изученными, известно, что CDK8/19 играют центральную роль в транскрипционном перепрограммировании, лежащем в основе клеточной дифференцировки и патогенеза различных заболеваний [6]. CDK8/19 выступают модуляторами сигнальных путей транскрипционных факторов STAT1 и NF-kB, играющих критическую роль в воспалительных процессах [7, 8].

В последнее время накапливаются данные, связывающие CDK8 с патологиями сердечно-сосудистой системы. В частности, CDK8 выступает корегулятором транскрипционного фактора HIF-1α (индуцируемый гипоксией фактор-1α) — ключевого медиатора клеточного ответа на гипоксию, который вносит значительный вклад в развитие атеросклероза [9]. HIF-1α запускает экспрессию широкого спектра генов, непосредственно способствующих развитию атеросклероза, таких как TNF, CD36, VEGF, ICAM-1, VCAM-1 [10–12]. Таким образом, HIF-1α опосредует проатерогенные процессы, такие как нарушение метаболизма липидов в макрофагах, дисфункция эндотелия и усиление воспаления [13]. Кроме того, CDK8 является негативным регулятором биосинтеза липидов. CDK8 индуцирует повышенное убиквитинирование и деградацию SREBP посредством фосфорилирования этого белка. Семейство SREBP включает ключевые факторы транскрипции, регулирующие липидный обмен, в том числе транскрипцию генов синтеза холестерина и липогенеза [14]. Поскольку CDK8 регулирует экспрессию множества генов, ассоциированных с атерогенезом, выдвинута гипотеза о том, что делеция CDK8 и/или CDK19 может привести к снижению прогрессии атеросклероза в результате снижения липопротеиновой инфильтрации интимы аорты.

Несмотря на известное участие CDK8/19 в канцерогенезе и в иммунном ответе [15, 16], их роль в атерогенезе изучена недостаточно. В связи с этим представляется перспективным исследовать роль транскрипционных киназ CDK8/19 — известных регуляторов воспаления и участников кардиоваскулярных патологий — в развитии атеросклероза. Таким образом, цель данного исследования — оценить влияние системного и эндотелиоспецифичного нокаута Cdk8, а также системного нокаута Cdk19 на формирование атеросклеротических поражений в аорте мыши на фоне нокаута ApoE — известной модели атеросклероза у мышей [17].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования

В работе использовали мышей активаторных линий Rosa26/Cre-ERT2 (B6.129-Gt(ROSA)26Sortm1(cre/ERT2)Tyj/J, Jackson Laboratory) и Tie2-Cre (B6.Cg-Tg(Tek-cre)1Ywa/J, Jackson Laboratory). Мыши данных линий были скрещены с Cdk8fl/fl (Jax:008463, Jackson Laboratory) с фланкированным loxPсайтами экзоном 2 в гене Cdk8 для получения Rosa26/ Cre-ERT2/Cdk8fl/fl (системный нокаут) и Tie2-Cre/Cdk8fl/fl (эндотелиоспецифичный нокаут). Кроме того, использовали мышей линии C57BL/6N-Cdk19 (RRID:MMRRC 047035UCD, MMRRC) с конститутивным нокаутом гена Cdk19.

Генотипирование потомства линий Cdk8fl/fl, C57BL/6NCdk19, Rosa26/Cre-ERT2 проводили как описано ранее [18]. Эксперименты проводили на мышах перечисленных линий на фоне ApoE^–/^– (нокаута аполипопротеина Е). Данные мыши были получены в дар от Юрия Котелевцева [19]. Для генотипирования мышей линий ApoE^–/^– и Tie2-Cre использовали олигонуклеотидные праймеры P1, P2 и P3 а также P4, P5 и P6 соответственно (таблица). Все праймеры были синтезированы в компании «Евроген» (Россия).

Мышей содержали в виварии ЦКП ИБГ РАН в условиях постоянного доступа к воде и корму. Световой цикл составлял 12/12 ч, температура воздуха — 23 ± 1 °C, влажность — 42 ± 5%. Животных выводили из эксперимента методом цервикальной дислокации шейных позвонков.

Индукция нокаута гена Cdk8

Для индукции нокаута гена Cdk8 у мышей линии Rosa26/ Cre-ERT2/Cdk8fl/fl проводили внутрибрюшинные инъекции тамоксифена (Sigma-Aldrich, США), растворенного в кукурузном масле (Sigma-Aldrich, США), как описано ранее [20]: самцам в возрасте 2 месяца ежедневно вводили по 0,15 мл тамоксифена в концентрации 20 мг/мл в течение 7 дней подряд. Данных мышей переводили на атерогенную диету (Western type diet, WTD) через месяц после индукции нокаута.

Экспериментальные группы

Из самцов мышей представленных линий возрастом 3 месяца сформировали следующие экспериментальные группы (рис. 1), всего 46 животных.

1. ApoE — мыши c дефицитом аполипопротеина E, содержавшиеся на стандартном корме (отрицательный контроль), n = 4.
2. ApoE WTD — мыши ApoE-/-, содержавшиеся на WTD (положительный контроль модели атеросклероза для мышей Cdk19^–/^–/ApoE^–/^– и Tie2-Cre/Cdk8fl/fl/ApoE^–/^–), n = 8.
3. ApoE + Oil WTD — мыши ApoE^–/^–, обработанные в течение 7 дней кукурузным маслом по 150 мкл, содержавшиеся на WTD (положительный контроль модели атеросклероза для мышей, обработанных тамоксифеном Rosa26/Cre-ERT2/Cdk8fl/fl), n = 5.
4. Rosa WTD — мыши линии Rosa26/Cre-ERT2, содержавшиеся на WTD (отрицательный контроль модели атеросклероза для мышей Rosa26/Cre-ERT2/Cdk8fl/fl), n = 4.
5. Tie WTD — мыши линии Tie2-Cre, содержавшиеся на WTD (отрицательный контроль модели атеросклероза для мышей и Tie2-Cre/Cdk8fl/fl/ApoE-/-), n = 4.
6. Cdk19/ApoE WTD — мыши с нокаутом гена Cdk19 на фоне нокаута гена ApoE, содержавшиеся на WTD, n = 8.
7. Cdk8/Rosa/ApoE WTD — мыши Rosa26/Cre-ERT2/Cdk8fl/fl с индуцибельным нокаутом гена Cdk8 на фоне нокаута гена ApoE, содержавшиеся на WTD, n = 6.
8. Cdk8/Tie/ApoE WTD — мыши с конститутивным эндотелиоспецифичным нокаутом гена Cdk8 на фоне нокаута ApoE, содержавшиеся на WTD, n = 7.

Критерии исключения

В эксперименте участвовали только самцы. Исключение животных из эксперимента проводили на основании ухудшения клинического статуса, проявляющегося вялостью, апатией, отказом от пищи, а также при спонтанной гибели животного до плановой эвтаназии. По последнему критерию из исследования было исключено пять животных: два из группы (1), по одному из групп (4), (5) и (7).

Атерогенная диета

Взрослых мышей различных экспериментальных групп возрастом 3 месяца держали на атерогенной диете. Диета содержала 21,2% молочного жира («Пармалат», Россия), 34% сахарозы (Solarbio, Китай) и 0,2% холестерина (Macklin, Китай) [21]. Для индукции развития атерогенных поражений мыши содержали на атерогенной диете в течение 2 месяцев.

Исследование аорт

Сепарацию, окрашивание аорт мышей и обработку изображений проводили, как описано ранее [22]. Мышей наркотизировали раствором 0,6 мл Золетила (Virbac, Франция) + 0,3 мл Ксилазина (Interchemie Werken "de Adelaar" BV, Нидерланды) + 9 мл физиологического раствора («Панэко», Россия) в дозе 100 мкл на 10 г массы животного, внутрибрюшинно, затем через пункцию верхушки левого желудочка перфузировали сердечнососудистую систему 10 мл PBS (BioinnLabs, Россия) для вымывания крови. Под стереомикроскопом Zeiss Stemi DV4 (Carl Zeiss, Германия) аккуратно выделяли всю аорту от дуги до подвздошных артерий, удаляли периваскулярную жировую и соединительную ткань вокруг аорты, избегая ее повреждения. Для фиксации тканей проводили перфузию 10 мл 4%-го раствора параформальдегида («Медикс», Россия). Далее аорту помещали в 1 мл свежеприготовленного 60%-го раствора Oil Red O (Sigma-Aldrich, США) и инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре.  После окрашивания препарат промывали 60%-м изопропанолом (Panreac AppliChem, Германия) в течение 20 мин, а затем трижды дистиллированной водой по 5 мин. Под микроскопом окончательно очищали аорту от остатков окрашенной периваскулярной жировой ткани, переносили на предметное стекло и получали цифровые микрофотографии в высоком разрешении. Полученные изображения обрабатывали с использованием программного обеспечения ImageJ. Процент атеросклеротических поражений рассчитывали как отношение площади поражений к общей площади восходящей части и дуги аорты.

Вестерн-блот

Был проведен анализ уровней CDK8 и CDK19 в аортах мышей всех исследуемых групп. Для детекции CDK8 и CDK19 использовали антитела CDK8 (D6M3J) Rabbit 17395 (Cell Signaling, США) и антитела для CDK19 из работы [18] соответственно, в разведении 1 : 1000. Уровень белка β-актина определяли в качестве контроля нагрузки. Для этого использовали моноклональные мышиные антитела β-actin (A2228, Sigma-Aldrich, США) в рабочем разведении 1 : 1000. Детекцию проводили с использованием вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP): Anti-rabbit IgG (кат. № 7074, Cell Signaling, США) и Antimouse IgG (кат. № 7076, Cell Signaling, США) в разведении 1 : 2000. Визуализацию результатов вестерн-блоттинга выполняли на системе iBright FL1500 (Invitrogen, США).

Статистическая обработка данных

Статистическую значимость различий оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) в программе GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, США). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В данной работе объектом исследования были генетически модифицированные мыши с системным и эндотелиоспецифичным нокаутом гена Cdk8, а также с системным нокаутом гена Cdk19. На первом этапе работы проводили валидацию уровня белков CDK8 и CDK19 в аорте мышей разных экспериментальных групп (рис. 2).

Оказалось, что у контрольных мышей линии ApoE, Tie и Rosa в аорте детектируются белки CDK8 и CDK19, в то время как у мышей с системным нокаутом Cdk8 (группа Cdk8/Rosa/ApoE) отсутствует CDK8, а у мышей с системным нокаутом Cdk19 (группа Cdk19/ApoE) отсутствует CDK19. При этом у мышей с эндотелиоспецифичным нокаутом Cdk8 (группа Cdk8/Tie/ApoE) белок CDK8 детектируется. Наблюдаемое присутствие белка согласуется с гистологическим строением аорты, которая состоит из трех слоев: адвентиции, медии и интимы, основную часть которой и составляет эндотелий [23]. Таким образом, в данной группе нокаут Cdk8 затрагивает преимущественно эндотелиальные клетки интимы, что и объясняет обнаружение белка CDK8 в гомогенате всей аорты.

Далее проводили исследование аорт у мышей всех экспериментальных групп после содержания на атерогенной диете в течение 2 месяцев. Значения, полученные от мышей из экспериментальных групп Cdk19/ApoE WTD и Cdk8/Tie/ ApoE WTD сравнивали со значениями группы ApoE WTD, являющейся положительным контролем в эксперименте; со значениями групп Tie WTD, а также ApoE на стандартном рационе, служившими отрицательным контролем (рис. 3).

Оказалось, что в группе мышей с эндотелиоспецифичным нокаутом Cdk8 происходит достоверное (p = 0,0295) снижение площади поражения аорты по сравнению с положительным контролем ApoE. При этом в группе с системным нокаутом Cdk19 площадь поражения не отличается от контрольных групп.

В процессе индукции нокаута гена Cdk8 в группе Cdk8/Rosa/ApoE мышей подвергали ежедневным инъекциям тамоксифена, растворенного в кукурузном масле. Для создания положительного контроля для данной группы использовали мышей ApoE, обработанных кукурузным маслом по аналогичной схеме. После содержания на атерогенной диете было проведено исследование атеросклеротических поражений аорты у мышей Cdk8/ Rosa/ApoE WTD, ApoE + Oil WTD в качестве положительного контроля; Rosa WTD, а также ApoE на стандартном рационе в качестве отрицательных контролей (рис. 4).

Оказалось, что значения, полученные от мышей с системным нокаутом Cdk8, достоверно (p = 0,0024) ниже значений положительного контроля и не отличаются от значений отрицательного контроля.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Генетически модифицированные животные — широко распространенный инструмент для моделирования и последующего исследования патогенеза заболеваний человека, а также разработки методов терапии [24]. Это обусловливает их важную роль при исследованиях таких социально-значимых патологий, как атеросклероз. Атеросклероз как хронический прогрессирующий патологический процесс, лежит в основе большинства случаев сердечно-сосудистой патологии, что определяет высокие показатели летальности и инвалидизации населения [25].

Известно, что транскрипционная киназа CDK8 и ее паралог CDK19 модулируют сигнальные пути транскрипционных факторов STAT1 и NF-kB, тем самым регулируя воспалительный ответ. В ряде работ было показано, что низкомолекулярные ингибиторы CDK8/19, такие как SenexinA/B, Cmpd3/4, Cpd32, Cortistatin A эффективно подавляют активацию ключевых провоспалительных транскрипционных факторов STAT1 и NF-kB in vitro и in vivo [7, 8, 26, 27]. Кроме того, показана роль CDK8 в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний, так как данная киназа является корегулятором HIF-1α, участвующего в проатерогенных процессах [9, 10, 28].

В данной работе было проведено исследование роли транскрипционных киназ CDK8 и CDK19 при формировании атеросклеротических поражений с использованием генетически модифицированных мышей с системным и эндотелиоспецифичным нокаутом Cdk8, а также с системным нокаутом Cdk19. Для моделирования накопления липопротеинов в стенке аорты данные мыши были переведены на фон нокаута ApoE. Ген ApoE кодирует белок аполипопротеин Е, который играет центральную роль в метаболизме липопротеинов. Одна из его основных функций — служить лигандом для рецепторов печени, которые удаляют из кровотока остатки хиломикронов и ЛПНП. У мышей ApoE-/- отсутствует ключевой механизм очистки плазмы от богатых холестерином липопротеинов, что приводит к резкому повышению уровня холестерина в плазме, накоплению в крови ЛПНП и последующему развитию атеросклеротических поражений [17].

Нокаут CDK8 и CDK19 был подтвержден в аортах исследуемых мышей методом вестерн-блот (рис. 2). Показаны отсутствие CDK19 в группе мышей CDK19/ApoE с системным нокаутом гена Cdk19, отсутствие CDK8 в группе мышей CDK8/Rosa/ApoE с системным нокаутом гена Cdk8, а также неполное удаление CDK8 в группе CDK8/Tie/ApoE c эндотелиоспецифичным нокаутом Cdk8. Таким образом, мы показали, что данные модели релевантны.

Исследование накопления липидных включений в аортах подопытных мышей показало, что как эндотелиоспецифичный (рис. 3), так и системный (рис. 4) нокаут Cdk8 приводит к достоверному снижению площади поражения сосуда. При этом тотальный нокаут Cdk8 оказывает более выраженный антиатерогенный эффект по сравнению с эндотелиоспецифичным. Полученные данные позволяют предположить, что вклад CDK8 в патогенез атеросклероза не ограничивается эндотелиальными клетками, а также опосредован его функцией в других ключевых для данного заболевания типах клеток, таких как макрофаги и, возможно, гладкомышечные клетки сосудов. Эти результаты согласуются с данными литературы, которые демонстрируют снижение противоспалительного ответа при ингибировании CDK8/19 в моноцитах/макрофагах [29]. Согласно полученным результатам, CDK8 принимает участие в усилении атеросклеротического фенотипа, вероятно, через регуляцию транскрипционных программ, связанных с воспалительным ответом и метаболизмом липидов.

В отличие от CDK8, системная инактивация гена Cdk19 не оказала статистически значимого влияния на площадь атеросклеротических поражений аорты, что демонстрирует сопоставимые показатели с группами как отрицательного, так и положительного контроля (рис. 3). Стоит отметить, что в группе Cdk19/ApoE наблюдалась значительная межиндивидуальная вариабельность, включающая образцы как с обширной, так и с минимальной площадью поражений. Данное распределение, наряду с отсутствием общего эффекта, позволяет предположить, что CDK19, в отличие от своего паралога CDK8, не играет детерминирующей роли в прогрессии атеросклероза.

Хроническое воспаление является краеугольным камнем в патогенезе атеросклероза [2], а наши результаты прямо указывают на проатерогенную роль CDK8. Учитывая, что CDK8 является регулятором воспалительного ответа [6–8], можно предположить, что фармакологическое ингибирование данной киназы будет воспроизводить наблюдаемый нами антиатерогенный эффект за счет подавления провоспалительных сигнальных путей. Таким образом, применение известных ингибиторов CDK8 в экспериментальных моделях атеросклероза представляется перспективным направлением для разработки новых терапевтических подходов.

ВЫВОДЫ

Проведенное исследование раскрывает фундаментальные аспекты регуляции атерогенеза, связанные с функцией транскрипционных киназ CDK8 и CDK19. Использование генетических моделей на мышах линии ApoE⁻/⁻ с нокаутом указанных генов позволило установить, что CDK8 функционирует как проатерогенный регулятор — это подтверждается статистически значимым уменьшением площади атеросклеротических поражений при его нокауте. Более выраженный антиатерогенный эффект системного нокаута по сравнению с эндотелиоспецифичным свидетельствует о плейотропном характере влияния CDK8 на патогенез заболевания, включая его роль не только в эндотелиальных клетках, но и в других клеточных популяциях, в частности в макрофагах. Молекулярные механизмы проатерогенного действия CDK8, по-видимому, связаны с его способностью регулировать ключевые транскрипционные программы, включая пути HIF-1α, STAT1 и NF-κB, что модулирует воспалительный ответ и метаболизм липидов в стенке сосуда. CDK19 не проявляет значимого влияния на развитие атеросклеротических поражений, что подчеркивает функциональную дивергенцию между структурно гомологичными киназами CDK8 и CDK19 в контексте патогенеза атеросклероза. Полученные результаты не только расширяют понимание молекулярных основ атеросклероза, но и открывают новые возможности для разработки таргетной терапии. Ингибирование CDK8 представляет собой перспективную стратегию для подавления прогрессирования атеросклеротических поражений. Дальнейшие исследования должны быть направлены на уточнение клеточно-специфичных механизмов действия CDK8 в различных популяциях клеток сосудистой стенки и оценку эффективности селективных ингибиторов CDK8 в доклинических испытаниях.