Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) позволяет визуализировать поверхности различных материалов. В последнее время этот метод находит все большее применение для изучения биологических объектов и характера взаимодействия эукариотических клеток с органическими и неорганическими материалами, в частности керамическими имплантатами [1].

Биокерамические материалы занимают важное место среди современных биосовместимых конструкций, используемых в регенеративной медицине, травматологии-ортопедии, нейрохирургии, челюстно-лицевой хирургии.

Благодаря своей химической инертности, биосовместимости и способности к остеоинтеграции они широко применяются при создании костных имплантатов, остеопластических композиций и тканеинженерных каркасов. Наиболее изученные представители этой группы — гидроксиапатит, трикальцийфосфат и различные композиции на их основе [2]. Морфология и микрорельеф поверхности биокерамики в значительной степени определяют характер адгезии, пролиферации и дифференцировки клеток, что напрямую влияет на качество интеграции имплантата с тканями организма [3].

Оценка взаимодействия клеток с поверхностью биоматериала требует применения высокоточных методов визуализации, способных воспроизводить топографию образца на микронном и субмикронном уровнях. Традиционные методы световой и флуоресцентной микроскопии позволяют лишь косвенно оценивать состояние клеток и их распределение, но не дают представления о характере контакта между клеточной мембраной и поверхностью материала. В этом отношении сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) является оптимальным инструментом, обеспечивающим визуализацию клеточных структур с высоким пространственным разрешением и глубиной резкости. Метод позволяет детально рассматривать форму клеток, состояние их цитоплазматических выростов, характер прилегания к поверхности и степень формирования внеклеточного матрикса [4].

Однако применение СЭМ для анализа биологических образцов сопряжено с рядом методических трудностей. Основные ограничения — высокий процент содержания воды в клетках, отсутствие электрической проводимости и склонность к разрушению при высушивании [5]. Для предотвращения деформации клеточной структуры требуются фиксация и постепенная дегидратация, что традиционно достигается с использованием токсичных веществ, таких как глутаровый альдегид и тетраоксид осмия, и многоступенчатых процедур критической сушки. Тетраоксид осмия относится к высокотоксичным соединениям, что требует организации особых условий для обеспечения безопасности. Протокол сушки в критической точке требует подбора условий для каждого конкретного материала и типа клеток и занимает около 24 ч.
Кроме того, большинство существующих протоколов ориентированы на исследование плоских стеклянных или металлических подложек, тогда как биокерамические образцы обладают выраженной микрорельефной и пористой поверхностью, что осложняет поиск клеток и снижает воспроизводимость результатов [6, 7].

Токсичность реагентов, длительность подготовки и высокая стоимость оборудования (в частности, установки для критической сушки с диоксидом углерода) делают подобные протоколы малопригодными для рутинных лабораторных исследований. При этом сохранение морфологических особенностей клеток и обеспечение качественной визуализации при минимальных изменениях исходной структуры остаются критически важными условиями для корректной интерпретации данных [8]. Следовательно, возникает необходимость в разработке более простой, экономичной и безопасной схемы пробоподготовки клеточных образцов для СЭМ-анализа, которая обеспечивала бы высокую воспроизводимость результатов и хорошее качество изображений без применения токсичных соединений и дорогостоящих технологий.

Особое значение имеет создание алгоритма, позволяющего надежно фиксировать и визуализировать клетки, выращенные на поверхности биокерамики, с сохранением их формы, целостности мембраны и элементов цитоскелета. Такая методика должна быть адаптирована к особенностям материала, обладать технологической простотой и не требовать сложного оборудования. Реализация этих условий позволит значительно расширить возможности рутинной морфологической оценки биосовместимых материалов и повысить доступность СЭМ-анализа в лабораторной практике [9].

Цель нашей работы — оптимизация методики подготовки животных клеток, растущих на поверхности биокерамических образцов, к анализу с помощью СЭМ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Подготовка образцов биокерамики

Подробно методика изготовления биокерамических образцов описана нами ранее [10]. Для эксперимента использовали три вида образцов биокерамических материалов. Материал для 3D-печати на основе аллотрансплантата, полученный из кадаверной костной ткани человека, предварительно подвергли прокаливанию, измельчили в порошок микронного размера для создания фотополимеризуемой суспензии и использовалили в процессе аддитивного производства на основе цифровой обработки света. Для аддитивно изготовленных образцов гидроксиапатита и трикальцийфосфата после печати проводили термическую обработку-спекание при различных температурах для удаления влаги и органических компонентов связующей системы. Все образцы представляли собой цилиндры диаметром 3,6–4,5 мм и высотой 1,9–2,6 мм.

Стерилизация

Стерилизацию проводили с помощью нагревания образцов в сухожаровом шкафу до 180 °С в течение 60 мин. После стерилизации образцы размещали в лунках культурального планшета в боксе микробиологической безопасности 2-го класса («Ламинарные системы», Россия).

Подготовка клеток

Мезенхимальные стволовые клетки человека из жировой ткани (МСК ЖТ) (Биолот, Россия) культивировали в среде DMEM (Capricorn, Германия), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (Biowest, Франция) и 2% L-глутамина (Servicebio, Китай) до достижения ими 90% покрытия дна культурального планшета. Далее клетки снимали с помощью 0,25%-го раствора трипсина («Биолот», Россия), промывали 1 раз раствором фосфатно-солевого буфера без кальция и магния (ФСБ, Панэко, Россия) и снова ресуспендировали в полной культуральной среде.

Посев клеток в планшеты

После ресуспендирования МСК рассевали по 5000 клеток на лунку 96-луночного культурального планшета в концентрации 100 000 клеток на 1 мл. Для этого 50 мкл суспензии наносили на центр цилиндрического образца и инкубировали в течение 30 мин при температуре 37 °С, содержании 5% СО₂ в воздухе в условиях влажной среды для прикрепления клеток к поверхности. Для каждого типа образцов готовили по две лунки планшета. По истечении времени адгезии в каждую лунку добавляли по 150 мкл полной культуральной среды и оставляли клетки для пролиферации на образцах биокерамики в течение 7 суток в условиях СО₂-инкубатора.
Мезенхимальные стволовые клетки, адгезированные к поверхности после культивирования, были готовы к анализу с помощью СЭМ.

Подготовка клеток на поверхности биокерамики к СЭМ

Промывка образцов

Необходимые реагенты: фосфатно-солевой буфер без кальция и магния.

Этапы промывки
1. По истечении времени культивирования во все анализируемые лунки добавляли по 500 мкл ФСБ для промывания образцов керамики от остатков питательной среды.
2. Жидкость аккуратно отбирали.
3. Процедуру повторяли дважды.

Фиксация и дегидратация образцов

Необходимые реагенты: глутаровый альдегид 2,5% по объему в деионизированной воде; физиологический раствор (NaCl, 0,9%); этанол 50% (здесь и далее готовили разведения из 95%-го этанола разбавлением деионизированной водой по объему); этанол 70%; этанол 80%; этанол 90%; этанол 95%; этанол 99% надкупоросный.

Этапы фиксации
1. В каждую лунку добавляли по 300 мкл 2,5%-го глутарового альдегида на 30 мин. Объем глутарового альдегида в 10 раз превышал объем образца для фиксации.
2. Глутаровый альдегид удаляли и добавляли к образцам 10-кратный объем физиологического раствора для промывания.
3. Удаляли жидкость полностью.
4. Процедуру промывания повторяли дважды.

Этапы дегидратации
5. После удаления жидкости проводили дегидратацию клеток. Добавляли этанол 50% до полного покрытия образца.
6. Выдерживали образцы в растворе 60 с при комнатной температуре.
7. Удаляли этанол 50% и добавляли этанол 70% до полного покрытия образца.
На данном этапе можно прервать протокол и хранить образцы при температуре +4 °C в закрытом состоянии для предотвращения испарения спирта.
8. Выдерживали образцы в растворе 60 с при комнатной температуре.
9. Удаляли этанол 70% и добавляли этанол 80% до полного покрытия образца.
10. Выдерживали образцы в растворе 60 с при комнатной температуре.
11. Удаляли этанол 80% и добавляли этанол 90% до полного покрытия образца.
12. Выдерживали образцы в растворе 60 с при комнатной температуре.
13. Удаляли этанол 90% и добавляли этанол 95% до полного покрытия образца.
14. Выдерживали образцы в растворе 60 с при комнатной температуре.
15. Удаляли этанол 95% и добавляли этанол 99% до полного покрытия образца.
16. Выдерживали образцы в растворе 60 с при комнатной температуре.
17. После завершения фиксации образец высушивали на воздухе и переходили к окрашиванию или хранили образцы до использования.

Окрашивание

Процедуру окрашивания клеток на поверхности керамического образца использовали для их визуализации, поскольку в процессе культивирования, перемещения, промывания и фиксации образцы могут переворачиваться в лунках. Клетки же преимущественно будут располагаться на поверхности образца, обращенной в сторону жидкости в лунке, но не к ее дну. Окрашенные клетки можно рассмотреть невооруженным глазом либо в световой микроскоп для выбора ориентации образца при монтировании на столик для СЭМ.

Необходимые реагенты: раствор красителя Гимзы, Панэко, Россия.

Этапы окрашивания
1. Образец полностью покрывали раствором красителя Гимзы.
2. Инкубировали 2 мин при комнатной температуре.
3. Заполняли лунку деионизированной водой для промывания.
4. Покачивали планшет в течение 2 мин.
5. Жидкость полностью удаляли и промывали лунки большим объемом водопроводной воды до просветления жидкости.
6. Жидкость полностью удаляли и снова промывали образец деионизированной водой в течение 2 мин.
7. Жидкость удаляли, а окрашенный образец высушивали на воздухе и хранили в закрытом планшете до использования.

Напыление

Необходимое оборудование: настольная установка магнетронного напыления DSR1, (Nanostructured coatings Co, Иран).

Этапы напыления
1. Керамические образцы закрепляли на алюминиевые столики для СЭМ диаметром 1 см с помощью электропроводящей ленты.
2. Предварительная окраска по Гимзе позволяла визуализировать участки, содержащие клетки, окрашенные в сине-фиолетовый цвет. Поверхность с такой окраской ориентировали вверх, без окраски — вниз и фиксировали к электропроводящей ленте.
3. Далее на образцы наносили слой золота толщиной 20–30 °А с помощью напылительной установки в автоматическом режиме.

Анализ поверхности с помощью СЭМ

Необходимое оборудование: сканирующий электронный микроскоп KYKY-EM6900LV (KYKY Technology Co., Ltd. Китай).

Этапы анализа
1. Разместили столики с закрепленными образцами в рабочей камере микроскопа.
2. Установили режим высокого вакуума, напряжение 11–13 кВ, рабочее расстояние 10–14 мм, использовали детектор SE электронов.
3. Провели поиск образца и его центрирование на минимальном увеличении (рис. 1А).
4. Окрашенные красителем Гимзы клетки визуализируются как более темные структуры на поверхности (рис. 1А, черная стрелка).
5. Выбирали отдельные наиболее темные участки на поверхности образца керамики, устанавливали увеличение 2000× или 5000× и настраивали изображение для подтверждения наличия клетки на данном темном участке. Примечание: данный этап необходим, поскольку более темными могут выглядеть также отдельные участки материала биокерамики.
6. При обнаружении в области темных фрагментов морфологических отличий от частиц биокерамики выбирали меньшее увеличение (200× или 500×) и проводили поиск объектов, отвечающих параметрам клетки (рис. 1Б).
7. В случае обнаружения клетки или группы клеток с помощью данного алгоритма, наблюдали структуры с темной мембраной, практически ровной поверхностью, под которой визуализировались очертания частиц материала керамики или выросты, тяжи разной длины как под телом клетки, так и в области ее внешних краев. Поверхность клетки могла быть менее ровной в зависимости от характера ее роста и качества обезвоживания материала (рис. 1– рис. 4).

8. После визуального обнаружения клетки проводили сканирование и получали изображение при условном увеличении 200×, 500×, 2000×, 5000×, 10 000× (рис. 1– рис. 4).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для исследования биосовместимости с помощью СЭМ было подготовлено 15 образцов на трех типах материалов. Использованный в работе подход позволил обнаружить клетки на поверхности всех образцов из обработанного костного аллогенного материала человека, гидроксиапатита и трикальцийфосфата (рис. 1– рис. 5). Анализ поверхности материала с помощью СЭМ позволил охарактеризовать клеточную морфологию: размеры и форму клеток, однородность поверхности или ее шероховатость, наличие выростов краевой зоны клетки и их длину, наличие выростов под телом клетки, количество клеток на образце.

Среди обнаруженных нами клеток можно выделить несколько морфологических вариантов, характеризующих степень прикрепления клеток к поверхности материала (рис. 5) : 1;) высокая степень адгезии — крупные, распластанные по поверхности клетки с очень мелкими складками, под которыми можно различить очертания частиц материала поверхности, с длинными тонкими выростами плазматической мембраны по краям клетки и под ее телом; 2) средняя степень адгезии — клетки распластанные, с мелкими неровностями поверхности, средних размеров, с небольшим числом широких и тонких выростов мембраны в основном по периферии клетки; 3) низкая степень адгезии — относительно некрупные, плоские клетки, имеющие хорошо заметные складки, хорошо заметные регулярные неровности поверхности, без выростов мембраны под телом клетки и по периферии, очертания гранул материала не просматриваются.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты проведенного исследования демонстрируют, что предложенный алгоритм подготовки клеточных культур, выращенных на поверхности биокерамических образцов, обеспечивает сохранение морфологии клеток и достоверную визуализацию зон их взаимодействия с материалом при помощи СЭМ. В отличие от классических схем пробоподготовки, требующих сложного оборудования, длительной подготовки проб и токсичных реагентов, предложенный подход основан на последовательной фиксации и мягкой дегидратации образцов, что делает метод применимым в условиях стандартной лаборатории. Ранее описанные методики, несмотря на применение похожей схемы дегидратации [11], часто приводили к деформации мембран и потере клеточных псевдоподий вследствие изменения поверхностного натяжения при обработке образцов. Современные исследования указывают, что даже минимальные различия в микрорельефе и пористости биокерамики могут существенно влиять на адгезию и пространственную ориентацию клеток [12]. В нашем исследовании фиксация с последовательной дегидратацией в градиенте этанола при комнатной температуре позволила избежать подобных искажений и сохранить естественные контуры клеток и микроструктуру материала. Часто применяемая сушка препарата в критической точке является относительно трудоемкой и продолжительной по времени процедурой [13]. В нашем исследовании удалось ограничиться дегидратацией и последующим плазменным напылением золота для обеспечения токопроводимости образца.

Особое значение имеет использование ориентационной окраски раствором красителя Гимзы перед напылением. Этот прием позволил точно позиционировать участки с адгезированными клетками и значительно сократил время поиска зон интереса при электронно-микроскопическом анализе. Подобная комбинация методов визуализации ранее не была описана в отношении биокерамических подложек и может быть полезна при морфологических исследованиях других типов материалов.

Анализ микроскопических изображений показал сохранение характерной для мезенхимальных стволовых клеток формы, наличие периферических выростов и выраженных контактных зон с поверхностью керамики. На образцах трикальцийфосфата клетки демонстрировали более плотную адгезию и формирование протяженных мембранных выростов, что согласуется с данными о высокой биосовместимости кальций-фосфатных материалов и их стимулирующем влиянии на остеогенную дифференцировку [14]. В то же время на аллогенном материале наблюдалась вариабельность формы клеток, которая зависела от температуры обработки материала и, вероятно, обусловлена неоднородностью структуры поверхности.

Предложенный протокол сочетает воспроизводимость, технологическую простоту и безопасность. Он может быть адаптирован для анализа других типов клеток и подложек, что расширяет возможности морфологической оценки клеточно-материальных интерфейсов в биомедицинских исследованиях и разработке остеоинтегрирующих имплантатов.

ОГРАНИЧЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование имеет ряд ограничений. Прежде всего, анализ носил преимущественно качественный характер и не включал количественную морфометрию клеточных структур, что могло бы повысить объективность оценки. Кроме того, работа выполнена на одной клеточной модели — мезенхимальных стволовых клетках жировой ткани человека; для подтверждения универсальности метода требуется проверка на других типах клеток.

Исследование проведено в условиях in vitro, что ограничивает возможность прямого переноса полученных данных на ткани in vivo. Также не рассматривалось влияние отдельных физико-химических параметров биокерамики на качество визуализации и сохранность клеточной морфологии, что может стать предметом дальнейших исследований.

ВЫВОДЫ

В работе предложена методика подготовки мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека, выращенных на поверхности биокерамических образцов, к анализу с помощью СЭМ и проведения самого анализа. Предложенный в работе подход требует не более 1 ч для подготовки клеток к анализу с помощью СЭМ, с учетом этапа высушивания образца, не требует использования токсичных солей тяжелых металлов, позволяет получить стабильные воспроизводимые результаты. Применение окраски образцов по Гимзе значительно облегчает поиск клеток на поверхности и способствует правильной ориентации образца для исследования. Описанный вариант пробоподготовки может быть использован и для обработки любых других животных клеток, адгезированных к поверхности любого материала, при условии его устойчивости к обработке глутаровым альдегидом и этанолом.